專利名稱：一種葡萄試管苗繁殖方法及所使用的培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用組織培養(yǎng)繁殖葡萄試管苗的方法以及所使用的培養(yǎng)基。
葡萄是世界上栽培面積和總產(chǎn)量都占第一位的果樹。除用常規(guī)方法進行繁殖、育種和脫毒外，八十年代以來許多研究者開展了生物工程技術(shù)的研究，以加快葡萄育種和繁殖。
M.Barlass等(M.Barlass etc.，Ann.Appl.Biol.1982，101291～295)通過葡萄莖尖碎片培養(yǎng)，證明了再生植株脫除了嫁接傳播的卷葉、黃斑和斑點病毒。莖尖培養(yǎng)與熱處理相結(jié)合，也可獲得無扇葉病毒的葡萄。
R.Chee和R.M.Pool(R.Chee and R.M.Pool，Scientia Horticulturae，16(1982)17～27)嘗試了通過組織培養(yǎng)快速繁殖葡萄，他們以葡萄品種“羅金安”(Rougeon)莖尖為材料，在含有NAA和BA的MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在每日10小時光照下得到具有2～4個葉原基的莖。原始外植體繼代培養(yǎng)可產(chǎn)生莖叢，出現(xiàn)了莖增殖的潛力。切下的莖叢(1.5cm長)繼代培養(yǎng)在含5μM BA和0.5μM NAA的培養(yǎng)基上，45天中在硬的愈傷組織頂部產(chǎn)生10～30個密生的莖叢。
莖尖轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基后30～40天，產(chǎn)生的小植株栽入滅過菌的裝有泥炭的花盆中，放在生長箱內(nèi)保持100％相對濕度。每天光照16小時，暗中溫度27℃，光下31℃。當(dāng)莖高達到4cm，具有4～6片展開的小葉時，把生長箱內(nèi)的相對濕度降至60％進行鍛煉。然后栽入大花盆中并移入生長室內(nèi)?？偣伯a(chǎn)生24個小植株，全部移栽，其中6株死亡，成活率為75％。
上述實驗中雖然可以從一塊愈傷組織產(chǎn)生10～30個莖，但是R.chee等總共只獲得24株再生植株，說明實際成苗率并不高。并且，該實驗在嚴格控制光照、溫度和濕度的情況下試管苗移栽成活率也只有75％，顯然不適合大規(guī)模工廠化生產(chǎn)的需要。
A.Bouquet(A.Bouquet，Colloque multiplication de la vigne.1982.Bordeaux.)在前人工作的基礎(chǔ)上把葡萄離體繁殖技術(shù)概括為微型扦插和微型繁殖兩種途徑。
在微型扦插中，外植體在不含任何植物激素的培養(yǎng)基上長成具有根系和莖葉的植株。再把這些小植株每株切成約10段接種在新的培養(yǎng)基上，重新長出完整的植株，如此無限循環(huán)，大約兩個月轉(zhuǎn)接一次。每個外植體的年增殖率的理論值約為1.0×106。本方法的缺點是兩個月轉(zhuǎn)接一次，周期太長，繁殖系數(shù)偏低。作者沒有提到具體使用哪一種培養(yǎng)基，也沒說明植株移栽成活率有多少，因此無法計算出一年內(nèi)可獲得多少移栽成活的植株。
在微型繁殖中，培養(yǎng)基加入細胞激動素，一般用量為2mg/L。將外植體接種在培養(yǎng)基后，腋芽萌發(fā)，葉片生長，很快就形成一堆叢生芽。切取帶葉的小芽接種在相同的培養(yǎng)基上，就可以無限循環(huán)地繁殖。每2～3周轉(zhuǎn)接一次。微型繁殖每次移植的增殖率為8～10倍。這一方法的理論效率比微型扦插高。但是存在著某種難以克服的技術(shù)困難。因此，A.Bouquet斷言“盡管葡萄微型繁殖有一個可觀的繁殖系數(shù)，但在短期和較長時間內(nèi)似乎還不可能成功地應(yīng)用于商品化生產(chǎn)”。正如A.Bouquet所預(yù)言的那樣，由于莖叢形成的再生植株較弱，移栽成活率低，實際繁殖系數(shù)并不高，現(xiàn)在幾乎沒有人用這一方法進行葡萄試管苗快速繁殖。
無論是用于何種目的，葡萄組織培養(yǎng)最終都要獲得再生植株。因此，再生植株的移栽成活率對實驗的成敗起著決定性作用。尤其是對脫病毒試管苗或優(yōu)良品種進行離體快速繁殖更需要有較高的移栽成活率，盡可能提高繁殖系數(shù)，降低生產(chǎn)成本。
一般都是通過嚴格控制環(huán)境的溫度和濕度來提高葡萄試管苗的移栽成活率，而忽視了試管苗自身的生理狀態(tài)，使移栽成活率低且不穩(wěn)定。如上述R.Chee和R.M.Pool的實驗，即使在嚴格控制光照、溫度和濕度的條件下，移栽成活率也只有75％。在大規(guī)模葡萄試管苗工廠化生產(chǎn)中，濕度和溫度很難控制。而且控制溫度和濕度需要昂貴的設(shè)備，這就必然提高試管苗的生產(chǎn)成本。如何在不太嚴格的環(huán)境條件下提高葡萄試管苗的移栽成活率是一個亟待解決的問題。
本發(fā)明的一個目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的缺點和局限性，提供一種利用組織培養(yǎng)繁殖葡萄試管苗的方法，提高試管苗對移栽后的環(huán)境條件的適應(yīng)能力，進而提高移栽成活率，降低培養(yǎng)成本。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于繁殖葡萄試管苗的方法的繼代培養(yǎng)基。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種用于繁殖葡萄試管苗的方法的光自養(yǎng)培養(yǎng)基。
除非特別說明，本發(fā)明所用的百分比均為重量百分比。
本發(fā)明采用GS(繼代培養(yǎng)基)和GP(光自養(yǎng)培養(yǎng)基)對培養(yǎng)基的基本無機鹽成分無特殊要求，但培養(yǎng)基的碳源、有機附加物、激素濃度和瓊脂以及pH值都做了相應(yīng)的調(diào)整。MS、B5或懷特等培養(yǎng)基以及在這些培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的其它培養(yǎng)基均可用作無機鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基。無機鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基只含有無機鹽，不含有有機附加物的培養(yǎng)基。以1/2B5(B5培養(yǎng)基的大量元素減半)培養(yǎng)基為最佳。
GS培養(yǎng)基是在無機鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基中按常規(guī)量加入有機附加物——肌醇，鹽酸硫胺素，煙酸，鹽酸吡哆醇，瓊脂后再加入0.05～0.1mg/L的植物生長素(也可使用其它生長素類物質(zhì)，但濃度要作相應(yīng)的變化)，用于試管苗的增殖。當(dāng)植物生長素濃度低于0.05mg/L時，莖的形成和生長較慢，高于0.1mg/L時則在外植體的基部形成較多的愈傷組織，均不利于試管苗的快速增殖。此外，GS培養(yǎng)基還必須加入2％～3％的蔗糖。蔗糖含量低于2％時，長期繼代培養(yǎng)會出現(xiàn)較多的玻璃苗，高于3％時不僅外植體生長速度減慢，而且增加了試管苗的生產(chǎn)成本。最好使用2％的蔗糖。pH值為5.6左右GP培養(yǎng)基(光自養(yǎng)培養(yǎng)基)就是使葡萄試管苗在離體培養(yǎng)階段在饑餓脅迫下進行光自養(yǎng)生長的培養(yǎng)基。GP培養(yǎng)基不含碳源。僅加入生長素類物質(zhì)，如0.05-0.1mg/L的植物生長素，和瓊脂，其它有機附加物基本上完全除去，但保留2mg/L的鹽酸硫胺素效果更好。瓊脂含量提高到0.75％以上，pH值為6.0左右。在試管苗移栽前轉(zhuǎn)入光自養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)。通過光自養(yǎng)培養(yǎng)，可以改善試管苗的生理狀態(tài)，使之具有較強的適應(yīng)性。此外，光自養(yǎng)培養(yǎng)基由于缺少微生物生長所必需的碳源和其它有機物，不利于微生物的生長。可以在培養(yǎng)基不污染的情況下延長練苗時間，使練苗時間長達7～10天而不污染。其它任何培養(yǎng)基在有菌情況下練苗3～5天培養(yǎng)基就會污染，練苗5天以上培養(yǎng)基嚴重污染，致使試管苗死亡。葡萄試管苗在移栽前必須打開瓶口練苗，否則不能移栽成活。在培養(yǎng)基不污染的情況下，練苗時間越長，試管苗的移栽成活率也就越高。
來自光自養(yǎng)培養(yǎng)基的葡萄試管苗本身的適應(yīng)能力比較強，再經(jīng)過7～10天練苗，大批量繁殖的移栽成活率穩(wěn)定在90％以上。
GP培養(yǎng)基不適于長期繼代培養(yǎng)。在GP培養(yǎng)基上形成的再生植株必須移栽或重新轉(zhuǎn)入GS培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)。
本發(fā)明提供一種利用光自養(yǎng)培養(yǎng)快速繁殖葡萄試管苗的方法，包括以下步驟a.將試管苗在繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，擴大繁殖；b.當(dāng)試管苗長出3～5個葉片時，把莖切成小段，每節(jié)一段，帶一個葉片，轉(zhuǎn)到繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，每天光照10～16小時，溫度20～28℃；c.當(dāng)試管苗繁殖到一定數(shù)目時轉(zhuǎn)到光自養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)，方法同步驟2，每天光照14小時以上，光照度最好為1200～2000lux，試管苗長出3～5片葉和健壯的根后，打開瓶口在室內(nèi)自然光照下練苗6天以上，最好7～10天；d.取出練苗后的試管苗進行移栽，在濕潤條件下生長3～5天，之后在自然條件下生長。本步驟中的移植最好是將試管苗移植在砂子，蛭石，草炭土或其它透氣性良好的材料中。濕潤條件可以是通過覆蓋塑料薄膜來實現(xiàn)。
本方法的成苗率和植株移栽成活率均可達90％以上。如以每個試管苗平均切成3.5個莖段外植體，每月繼代一次計算，一年內(nèi)從1個原始的試管苗可以繁殖出3.512×90％＝3.04×106株葡萄試管苗。以90％的成活率計算，一年內(nèi)可獲得3.04×106×90％＝2.73×106棵成活植株。這樣的繁殖系數(shù)完全適合大規(guī)模工廠化生產(chǎn)的需要。
本發(fā)明較現(xiàn)有技術(shù)有以下優(yōu)點1.試管苗的繼代繁殖周期從A.Bouquet文中微型扦插的2個月縮短為4個星期，提高了繁殖系數(shù)。
2.突破了現(xiàn)有技術(shù)只通過控制環(huán)境的溫度和濕度來提高試管苗移栽成活率的局限性。使用了光自養(yǎng)培養(yǎng)法和與之相適應(yīng)的培養(yǎng)基。通過改變培養(yǎng)基的成分來提高試管苗的適應(yīng)能力，控制練苗時培養(yǎng)基的污染，延長練苗時間，使大批量繁中試管苗的移栽成活率達90％以上。R.Chee等在少量試管苗移栽試驗中，在嚴格控制溫度、濕度和光照的情況下，移栽成活率也只有75％。
實施例一(一)試驗材料先鋒葡萄品種的試管苗。這些試管苗已繼代多次，具有穩(wěn)定的再生能力。
(二)培養(yǎng)基1.培養(yǎng)基的基本成分(mg/L)大量元素KNO31250，(NH4)SO467，NaH2PO4·H2O75，MgSO4·7H2O125，CaCl2·2H2O75。
微量元素KI0.75，H3BO33.0，MnSO4·H2O10，ZnSO4·7H2O2.0，Na2M0O4·2H2O0.25，CuSO4·5H2O0.025，CoCl2·6H2O0.025，Na2·EDTA37.3，F(xiàn)eSO4·7H2O27.8。
2.繼代培養(yǎng)基(GS)基本培養(yǎng)基附加肌醇25mg/L，鹽酸硫胺素10mg/L，煙酸1.0mg/L，鹽酸吡哆醇1.0mg/L，植物生長素0.05mg/L，蔗糖20000mg/L，瓊脂5000mg/L。pH調(diào)至5.6。
3.光自養(yǎng)培養(yǎng)基(GP)基本培養(yǎng)基附加鹽酸硫胺素2.0mg/L，植物生長素0.05mg/L，瓊脂8000mg/L。pH調(diào)至6.0。
(三)方法與結(jié)果1. 試管苗的繼代培養(yǎng)與增殖每個100ml的三角瓶裝GS培養(yǎng)基30ml。共25瓶培養(yǎng)基用常規(guī)方法高壓滅菌。把長出3～5個葉的試管苗每節(jié)切成一段，每段帶一個葉片。把莖段外植體的形態(tài)學(xué)下端插入GS培養(yǎng)基，每瓶接種3個外植體。每天光照10～16小時。培養(yǎng)室的溫度為20～28℃。培養(yǎng)4個星期在GS培養(yǎng)基上的外植體長成具有3～5個葉片和根的新的植株。
這些再生植株又可切成莖段進行下一次培養(yǎng)。每4個星期繼代一次。培養(yǎng)4個星期統(tǒng)計結(jié)果如下在GS培養(yǎng)基上的75個外植體共形成72個完整的植株，成株率為96％。
2.光自養(yǎng)培養(yǎng)與試管苗移栽(1)取100個先鋒葡萄試管苗莖段外植體接種在光自養(yǎng)培養(yǎng)基(GP)上，另取100個外植體接種在繼代培養(yǎng)基(GS)作為對照。每瓶接2個外植體。操作方法同步驟1。每天光照16個小時，光照度為1200～2000lux。
(2)培養(yǎng)4個星期，兩種培養(yǎng)基上的外植體均長出帶有3～5片葉片的新莖和健壯的根。形成再生植株。光自養(yǎng)培養(yǎng)基無污染，100個外植體共形成92個完整的植株。成株率為92％。對照繼代培養(yǎng)基污染4瓶，剩下92個外植體，其中86個外植體形成完整的植株，成株率為93.48％。兩種培養(yǎng)基的成株率無顯著差異。但是對照污染較多，實際獲得的再生植株數(shù)少于光自養(yǎng)培養(yǎng)的材料。
(3)打開瓶口，兩種培養(yǎng)基上的再生植株均在室內(nèi)散射光下練苗7天。然后用自來水洗去根上的培養(yǎng)基，栽入盛有純沙的花盆內(nèi)置于室內(nèi)?；ㄅ铦餐杆?，上面蓋上塑料薄膜保濕。5天后去掉塑料膜。
(4)移栽20天后統(tǒng)計成活率和植株的生長情況。來自光自養(yǎng)培養(yǎng)基的92個植株成活87株，成活率為94.57％。來自對照的86個植株成活31株，成活率為36.05％。移栽前來自兩種培養(yǎng)基的小植株平均株高均為4.2cm。移栽20天后來自光自養(yǎng)培養(yǎng)基的小植株平均株高達10.45cm，增高6.25cm；而來自對照的小植株平均株高只有5.71cm，僅增高1.51cm。實施例二(一)試驗材料先鋒葡萄試管苗。
(二)培養(yǎng)基GS培養(yǎng)基植物生長素含量為0.1mg/L，蔗糖30000mg/L；GP培養(yǎng)基的植物生長素含量為0.1mg/L，瓊脂為12g/L。培養(yǎng)基的其它成分同實施例一。
(三)方法與結(jié)果1.繼代培養(yǎng)與增殖按照實施例一的方法，每瓶GS培養(yǎng)基接種3個外植體，25瓶共接種75個外植體。培養(yǎng)4周后共形成70個完整的植株，成株率為93.3％。
2.光自養(yǎng)培養(yǎng)與試管苗移栽按照實施例一的方法把100個莖段外植體接種在GP培養(yǎng)基上，未設(shè)GS對照。四個星期后共形成93個完整植株，成株率為93％。經(jīng)練苗把這些植株全部移栽。20天后共成活86株，成活率為92.47％。實施例三(一)試驗材料先鋒、巨峰和黑奧林三個葡萄品種的試管苗，其中黑奧林為脫病毒試管苗。
(二)培養(yǎng)基GS培養(yǎng)基含植物生長素0.1mg/L，蔗糖20000mg/L。GP培養(yǎng)基植物生長素0.1mg/L，瓊脂8000mg/L。其它成分同實施例一。
(三)方法與結(jié)果在GS培養(yǎng)基上大量繁殖三個葡萄品種的試管苗，方法同實施例一。然后，把來自GS培養(yǎng)基的上述3個品種的外植體共2537個全部接種在GP培養(yǎng)基上進行光自養(yǎng)培養(yǎng)，一個月后共獲得再生植株2312個(其中先鋒1251株，巨峰579株，黑奧林482株)，成株率為91.13％。經(jīng)練苗7天后把這些植株全部栽入盛有純沙的沙床。澆水至飽和狀態(tài)，上罩塑料薄膜保濕。5天后去掉塑料膜。20天后統(tǒng)計成活率。共成活2083株，其中先鋒為1126株，巨峰523株，黑奧林434株。成活率為90.1％。上述植株在沙床上培養(yǎng)1個月后全部栽入苗圃。
權(quán)利要求
1.一種用于葡萄試管苗繁殖的繼代培養(yǎng)基，其特征在于，該培養(yǎng)基是在無機鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基中按常規(guī)量加入有機附加物——肌醇，鹽酸硫胺素，煙酸，鹽酸吡哆醇和瓊脂后再加入生長素類物質(zhì)和2％～3％的蔗糖，pH值被調(diào)整至5.6。
2.按照權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述的生長素類物質(zhì)為0.05～0.1mg/L的植物生長素。
3.按照權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述的蔗糖濃度為2％。
4.一種用于葡萄試管苗繁殖的光自養(yǎng)培養(yǎng)基，其特征在于，該培養(yǎng)基是在無機鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基中僅加入0.05～0.1mg/L的植物生長素和瓊脂，并將瓊脂含量提高到0.75％以上，pH值調(diào)整至6.0。
5.按照權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)基，其特征在于，該培養(yǎng)基中還含有2mg/L的鹽酸硫胺素。
6.一種利用光自養(yǎng)培養(yǎng)快速繁殖葡萄試管苗的方法，包括以下步驟a.將試管苗在繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，擴大繁殖；b.當(dāng)試管苗長出3～5個葉片時，把莖切成小段，每節(jié)一段，帶一個葉片，轉(zhuǎn)到繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，每天光照10～16小時，溫度20～28℃；c.當(dāng)試管苗繁殖到一定數(shù)目時轉(zhuǎn)到光自養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)，方法同步驟b，每天光照14小時以上，試管苗長出3～5片葉和健壯的根后，打開瓶口在室內(nèi)自然光照下練苗6天以上；d.取出練苗后的試管苗進行移栽，在濕潤條件下生長3～5天，之后在自然條件下生長。
7.按照權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，在進行步驟c的培養(yǎng)時光照度為1200～2000lux。
8.按照權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，在進行步驟c的培養(yǎng)后練苗時間為7～10天。
9.按照權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，在進行步驟d中的移植是將試管苗移植進砂子，蛭石，草炭土或其它透氣性良好的材料中。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種葡萄試管苗繁殖方法及所使用的繼代培養(yǎng)基和光自養(yǎng)培養(yǎng)基。所述的繼代培養(yǎng)基是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中按常規(guī)量加入有機附加物——肌醇,鹽酸硫胺素,煙酸,鹽酸吡哆醇,瓊脂后再加入生長素類物質(zhì)和2%～3%的蔗糖。所述的光自養(yǎng)培養(yǎng)基是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中僅將瓊脂含量提高到0.8%或0.8%以上,pH值調(diào)整至6.0。利用本發(fā)明的方法可縮短繁殖周期,提高繁殖率,降低成本。
文檔編號A01H4/00GK1252216SQ9812353
公開日2000年5月10日 申請日期1998年10月23日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月23日
發(fā)明者朱有光, 林建興, 張性坦, 趙存, 柏惠俠, 李諾 申請人:中國科學(xué)院遺傳研究所