本發(fā)明與馬鈴薯脫毒快繁技術有關，屬于生物技術細胞工程中的植物組織培養(yǎng)領域。
背景技術：
我國自20世紀70年代，就開展了利用脫毒技術和植物組織培養(yǎng)技術快速繁殖馬鈴薯無毒種苗。該繁殖技術取得了巨大的成功，已成為馬鈴薯種薯生產的重要環(huán)節(jié)；但仍存在著繁殖周期較長、操作過程繁瑣，生產成本較高等關鍵問題。部分相關的技術文獻報道如下：發(fā)明專利申請“大量生產無類病毒病和病毒病馬鈴薯繁殖材料的方法”(專利申請?zhí)枺?7106041.8)，“活體外-活體內生產馬鈴薯微瘤的一種有效工藝”(專利申請?zhí)枺?8101458.3)，“馬鈴薯脫毒微型種薯快繁技術”(專利申請?zhí)枺?0106636.2)，“馬鈴薯組培苗分化培養(yǎng)方法”(專利申請?zhí)枺?1140273.3)，上述專利中涉及的方法雖具有一定的生產推廣價值，但仍需在田間開放條件下繁殖多年，很大程度上會產生病毒再次感染，給生產造成損失，同時其生產用種的成本亦偏高。
馬鈴薯試管薯的生產可解決上述問題。馬鈴薯試管薯是指在組織培養(yǎng)的條件下，以經過莖尖分生組織培養(yǎng)脫去主要病毒的馬鈴薯脫毒苗為材料，通過控制培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件，誘導腋芽頂端膨大所形成的塊莖。試管薯具有無病原、體積小、運輸儲運方便，能工廠化周年生產等優(yōu)勢，展現(xiàn)出良好的產業(yè)化前景。目前馬鈴薯試管薯的生產主要有兩種方式：其一，是在一般組織培養(yǎng)室中，以玻璃器皿為容器，先培養(yǎng)結薯母苗，然后將其整體轉入結薯培養(yǎng)基中誘導試管薯(連勇等，馬鈴薯雜志，1994，8卷，4期：連勇等，馬鈴薯雜志，1994，13卷，1期)；其二，是利用類似于生物反應器的特殊裝置，在較大的容器中生產試管薯(Hulscher et al,International symposium an plant production in closed ecosystem.Automation,Culture and Environment,August 26-29,1996,Narita,Japan.ActaHorticulture.1996,No.440，533-538；Akita M and Ohta Y,Plant Cell Reports.1998,vol.18,No.3-4,284-287；Jimenez E,et al.Plant Cell,Tissue and Organ Culuture.1999,vol.59,No.1,19-23)。前者需經過多次更換培養(yǎng)基和轉接，費時、費工、生產周期長、成本較高(約100天左右)；后者采用小型生物反應器生產試管薯，雖在生產效率上有一定的改善，但需要特殊的設備，生產成本高，推廣應用困難。中國專利申請“一種高效生產馬鈴薯試管薯的方法及其培養(yǎng)盒”(專利申請?zhí)枺?2131125.0)，雖在培養(yǎng)技術上做了改進，采用一步培養(yǎng)法，即：將馬鈴薯基礎苗直接接種于試管薯誘導培養(yǎng)基上，省略了結薯母苗的培養(yǎng)過程；但基礎苗一般較弱，結薯率較低，且其前期仍需在其他容器培養(yǎng)基礎苗，并未實際縮短培養(yǎng)周期。
目前，用于植物組織培養(yǎng)的器具或裝置也有一些報道。例如：實用新型專利“一種培養(yǎng)瓶結構”(中國實用新型專利號：ZL 95244625.1)，在一個玻璃錐形瓶的瓶底開通形成開口面積較大的瓶口，呈筒狀體的承物盤的外徑小于瓶口內徑，其底側周緣向外凸起一緣邊，緣邊的外徑大于瓶口內徑，并開有至少一個氣孔，樞蓋余瓶口相連接，樞蓋上至少開有一個氣孔，其內可存放慮棉塊，瓶口外圈的瓶體有一圈遮陰部。實用新型專利“植物組織培養(yǎng)瓶”(專利號：ZL 99252172.6)，該實用新型培養(yǎng)瓶包括瓶體和置于瓶體扣上的瓶蓋設有帶透氣孔的進氣孔，進氣孔內置有透氣片和內部通氣孔壓緊帽等構成，瓶蓋與瓶體之間需要借助一個專門設置的消毒用的中間蓋體?！耙环N高效生產馬鈴薯試管薯的方法及其培養(yǎng)盒”(專利號：ZL02131125.0)，該培養(yǎng)盒為方形，由下筒體和盒蓋構成，盒蓋上設計了即有利于通氣又有利于無菌培養(yǎng)的透氣柱。上述培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)盒均存在著設計復雜，不便操作，生產成本較高等問題；且無培養(yǎng)板支撐，試管苗易倒伏或需要另外添加脫脂棉等支持物。實用新型專利“馬鈴薯脫毒基礎苗液體培養(yǎng)用組培瓶”(授權公告號：CN 201947752 U)，其培養(yǎng)瓶包括瓶體和瓶蓋，在瓶蓋上設有通氣濾膜，在瓶體內設有與瓶體軸向垂直的培養(yǎng)板，培養(yǎng)板與瓶底間距為0.3-0.7cm。該培養(yǎng)瓶通過增加培養(yǎng)板解決了試管苗倒伏的問題，但培養(yǎng)板與瓶底的距離過短，容納的培養(yǎng)液量少，只適用于短時間基礎苗的培養(yǎng)，不適用于多階段試管苗的培養(yǎng)和試管薯的誘導。
綜上所述，目前現(xiàn)有馬鈴薯試管薯生產技術依然存在著技術規(guī)程有待優(yōu)化，繁殖效率有待提高，生產成本有待降低，配套生產裝置有待于革新等問題。
技術實現(xiàn)要素：
為解決現(xiàn)有技術費時、費工、生產周期長、成本高的問題，本發(fā)明提供一種“一步三階段”高效生產馬鈴薯試管薯的方法，可簡化操作程序，縮短生產周期，提高生產效率，降低生產成本。
本發(fā)明提供的技術方案如下：
一種高效生產馬鈴薯試管薯的方法。以脫毒馬鈴薯試管苗為材料，采用改良的高鉀MS培養(yǎng)基，在光暗條件下，分階段培養(yǎng)液體馬鈴薯試管苗，誘導馬鈴薯試管薯。具體地，所述改良的高鉀MS培養(yǎng)基中N:P:K的比例為10:1:15，提高了硝態(tài)氮比例，不添加有機物質，采用“一步三階段”液體培養(yǎng)：第一階段基礎苗培養(yǎng)，向培養(yǎng)瓶中加入“試管苗培養(yǎng)基”，在25-27℃、光強2000-3000lux條件下每天光照14-16小時；第二階段壯苗培養(yǎng)，無需更換培養(yǎng)基，去頂芽(用于轉接)，在23-25℃、光強2000-3000lux條件下每天光照14-16小時；第三階段試管薯誘導，無需倒出原“試管苗培養(yǎng)基”，直接在培養(yǎng)瓶加入“試管薯誘導培養(yǎng)基”，“試管薯誘導培養(yǎng)基”體積為原“試管苗培養(yǎng)基”體積的2/3，在18-20℃、光強500-1000lux下每天光照6-8小時。
按上述方法培養(yǎng)液體馬鈴薯試管苗和誘導試管薯，其中所述高鉀MS培養(yǎng)基分成為：NH4NO3 1050mg/L、KNO3 2450mg/L、KH2PO4 300mg/L、CaCl2 440mg/L、MgSO4·7H2O 370mg/L、Fe·NaEDTA 30mg/L、H3B03 6.0mg/L、MnSO4·H2O 8.6mg/L、ZnS04·7H2O 3.4mg/L、CuS045H2O 0.20mg/L。培養(yǎng)基中N:P:K比例為10:1:15，提高了硝態(tài)氮的比例，不添加有機物質。試管苗培養(yǎng)基為：高鉀MS培養(yǎng)基+白糖30g/L+活性炭1.5g/L，pH值為5.8；試管薯誘導培養(yǎng)基為：高鉀MS培養(yǎng)基+香豆素90mg/L+白糖120g/L+活性炭8g/L，pH值為5.8。本發(fā)明采用高水平的硝態(tài)氮更利于植物吸收，促進植物生長；同時，不添加有機物，能夠減輕菌污染。
上述“一步三階段”的培養(yǎng)方法，即基礎苗培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)和試管薯誘導在一個培養(yǎng)瓶中進行，避免多次更換培養(yǎng)基、苗子轉接等過程，可節(jié)省1/2以上的操作時間。不同階段設置不同的溫度、光強和光照時間，分別適應馬鈴薯基礎苗快速生長(25-27℃，光強2000-3000lux條件下每天光照14-16小時)、馬鈴薯匍匐莖的形成(23-25℃，光強2000-3000lux下每天光照14-16小時)和試管薯的誘導(18-20℃，光強500-1000lux下每天光照6-8小時)。
同時，本發(fā)明還提供了一種適合于“一步三階段”高效生產馬鈴薯試管薯的培養(yǎng)瓶。所述培養(yǎng)瓶包括瓶蓋(2)、瓶體(3，6)，在瓶蓋(2)上設有透氣柱(1)。瓶體(3，6)分為上下兩部分，下部瓶體(6)直徑略窄于上部瓶體(3)，下部瓶體(6)有黑色涂層；在上部和下部瓶體交界處放置培養(yǎng)板(4)，培養(yǎng)板上開有培養(yǎng)孔(5)。
所述培養(yǎng)瓶可采用玻璃或塑料材質。
該培養(yǎng)瓶的設計，改進了原有類似產品的結構。下部瓶體有黑色涂層，能夠模擬根部環(huán)境，促進壯苗和結薯；培養(yǎng)板(4)寬松擱置于下部瓶體(6)上，便于培養(yǎng)板(4)擱置，不需要額外的支撐物，方便操作。
優(yōu)選的，培養(yǎng)板(4)與瓶底(7)間距2-3cm，可以容納足量的培養(yǎng)基，并為根系生長提供充足的空間，能夠滿足“一步三階段”長時間培養(yǎng)的需要；培養(yǎng)板(4)上培養(yǎng)孔直徑0.3-0.4cm，即可以保證組培苗切段直立于液體培養(yǎng)基上，又不造成操作困難。
更優(yōu)選的，透氣柱孔徑為2-3cm。
更優(yōu)選的，上部瓶體(3)內徑為8.0cm，高為12cm，培養(yǎng)板(4)直徑為7.8cm，下部瓶體(6)內徑為7.5cm。瓶體部分直徑和高度為建議尺寸，方便于整個培養(yǎng)瓶的拿取。
所述培養(yǎng)瓶可全程實現(xiàn)液體培養(yǎng)，達到壯苗促薯，降低生產成本。該培養(yǎng)瓶還解決了試管苗液體培養(yǎng)不能直立，而固體生產成本高、生長周期長、長勢弱等問題；且黑色下部瓶體模擬馬鈴薯根部生長所需的黑暗條件，有利于植株的生長和試管薯的誘導。
本發(fā)明的有益效果在于：
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的生產方法和專用培養(yǎng)瓶，可節(jié)省操作時間1/2以上，節(jié)省成本1/3以上，馬鈴薯試管薯的生產周期從原來的90-100天左右縮短為70-80天左右，單瓶結薯數(每瓶平均按25株計算)可到35-45粒，較常規(guī)方法提高50％以上。
附圖說明
圖1：是本發(fā)明的馬鈴薯試管薯專用培養(yǎng)瓶的結構示意圖。
圖中：1—透氣柱，2—瓶蓋，3—上部瓶體，4—培養(yǎng)板，5—培養(yǎng)孔，6—下部瓶體，7—瓶底。
具體實施方式
一種高效生產馬鈴薯試管薯的方法設計思路如下：以脫毒馬鈴薯試管苗為材料，采用改良的高鉀MS培養(yǎng)基，在光暗條件下，分階段培養(yǎng)液體馬鈴薯試管苗，誘導馬鈴薯試管薯。具體地，所述改良的高鉀MS培養(yǎng)基中N:P:K的比例為10:1:15，采用“一步三階段”液體培養(yǎng)：第一階段基礎苗培養(yǎng)，向培養(yǎng)瓶中加入“試管苗培養(yǎng)基”，在25-27℃、光強2000-3000lux條件下每天光照14-16小時；第二階段壯苗培養(yǎng)，無需更換培養(yǎng)基，去頂芽(用于轉接)，在23-25℃、光強2000-3000lux條件下每天光照14-16小時；第三階段試管薯誘導，無需倒出原“試管苗培養(yǎng)基”，直接在培養(yǎng)瓶加入“試管薯誘導培養(yǎng)基”，“試管薯誘導培養(yǎng)基體積為原“試管苗培養(yǎng)基”體積的2/3，在18-20℃、光強500-1000lux下每天光照6-8小時。
按上述方法培養(yǎng)液體馬鈴薯試管苗和誘導試管薯，其中所述高鉀MS培養(yǎng)基分成為：NH4NO3 1050mg/L、KNO3 2450mg/L、KH2PO4 300mg/L、CaCl2 440mg/L、MgSO4·7H2O 370mg/L、Fe·NaEDTA 30mg/L、H3B03 6.0mg/L、MnSO4·H2O 8.6mg/L、ZnS04·7H2O 3.4mg/L、CuS045H2O 0.20mg/L。培養(yǎng)基中N:P:K比例為10:1:15，提高了硝態(tài)氮的比例，不添加有機物質。試管苗培養(yǎng)基為：高鉀MS培養(yǎng)基+白糖30g/L+活性炭1.5g/L，pH值為5.8；試管薯誘導培養(yǎng)基為：高鉀MS培養(yǎng)基+香豆素90mg/L+白糖120g/L+活性炭8g/L，pH值為5.8。
實施例1：
馬鈴薯品種和試管薯誘導條件設計：改良的高鉀MS培養(yǎng)基，配制大量元素、微量元素，添加白糖30g/L、活性炭1.5g/L，配制成液體“試管苗培養(yǎng)基”，調整pH值為5.8，每瓶裝培養(yǎng)基約60mL；121℃，高壓滅菌備用。在超凈工作臺上，每瓶接種馬鈴薯品種“魯引1號”脫毒試管苗節(jié)段25個，分“三階段”培養(yǎng)。第一階段為基礎苗培養(yǎng)：在25℃，光強2000lux下每天光照16小時，培養(yǎng)約15天，待苗高長至6-7cm。第二節(jié)段為壯苗培養(yǎng)：無需更換培養(yǎng)基，剪取頂芽(用于轉接)，在23℃、光強2000lux下每天光照16小時，培養(yǎng)約20天，待苗高長至8-10cm。第三階段為試管薯誘導：改良的高鉀MS培養(yǎng)基，配制成大量元素、微量元素，添加香豆素90mg/L、白糖120g/L、活性炭8g/L，調整pH值為5.8，121℃，高壓滅菌；無需倒出原“試管苗培養(yǎng)基”，直接在培養(yǎng)瓶加入“試管薯誘導培養(yǎng)基”，每瓶約40mL(原“試管苗培養(yǎng)基”體積的2/3)；在18℃，光強600lux下每天光照8小時，在第45天，收獲試管薯。每瓶收獲試管薯40-45粒。
實施例2：
馬鈴薯品種和試管薯誘導條件設計：改良的高鉀MS培養(yǎng)基，配制大量元素、微量元素，添加白糖30g/L、活性炭1.5g/L，配制成液體“試管苗培養(yǎng)基”，調整pH值為5.8，每瓶裝培養(yǎng)基約60mL；121℃，高壓滅菌備用。在超凈工作臺上，每瓶接種馬鈴薯品種“荷蘭15”脫毒試管苗節(jié)段25個，分“三階段”培養(yǎng)。第一階段為基礎苗培養(yǎng)：在25℃，光強2000lux下每天光照16小時，培養(yǎng)約15天，待苗高長至6-7cm。第二節(jié)段為壯苗培養(yǎng)：無需更換培養(yǎng)基，剪取頂芽(用于轉接)，在23℃、光強2000lux下每天光照16小時，培養(yǎng)約20天，待苗高長至8-10cm。第三階段為試管薯誘導：改良的高鉀MS培養(yǎng)基，配制成大量元素、微量元素，添加香豆素90mg/L、白糖120g/L、活性炭8g/L，調整pH值為5.8，121℃，高壓滅菌；無需倒出原“試管苗培養(yǎng)基”，直接在培養(yǎng)瓶加入“試管薯誘導培養(yǎng)基”，每瓶約40mL(原“試管苗培養(yǎng)基”體積的2/3)；在18℃，光強500lux下每天光照8小時，在第45天，收獲試管薯。每瓶收獲試管薯35-40粒。
實施例3：
馬鈴薯品種和試管薯誘導條件設計：改良的高鉀MS培養(yǎng)基，配制大量元素、微量元素，添加白糖30g/L、活性炭1.5g/L，配制成液體“試管苗培養(yǎng)基”，調整pH值為5.8，每瓶裝培養(yǎng)基約60mL；121℃，高壓滅菌備用。在超凈工作臺上，每瓶接種馬鈴薯品種“荷蘭15”脫毒試管苗節(jié)段25個，分“三階段”培養(yǎng)。第一階段為基礎苗培養(yǎng)：在26℃，光強2500lux下每天光照15小時，培養(yǎng)約15天，待苗高長至6-7cm。第二節(jié)段為壯苗培養(yǎng)：無需更換培養(yǎng)基，剪取頂芽(用于轉接)，在24℃、光強2500lux下每天光照15小時，培養(yǎng)約20天，待苗高長至8-10cm。第三階段為試管薯誘導：改良的高鉀MS培養(yǎng)基，配制成大量元素、微量元素，添加香豆素90mg/L、白糖120g/L、活性炭8g/L，調整pH值為5.8，121℃，高壓滅菌；無需倒出原“試管苗培養(yǎng)基”，直接在培養(yǎng)瓶加入“試管薯誘導培養(yǎng)基”，每瓶約40mL(原“試管苗培養(yǎng)基”體積的2/3)；在19℃，光強800lux下每天光照7小時，在第45天，收獲試管薯。每瓶收獲試管薯35-40粒。
實施例4：
馬鈴薯品種和試管薯誘導條件設計：改良的高鉀MS培養(yǎng)基，配制大量元素、微量元素，添加白糖30g/L、活性炭1.5g/L，配制成液體“試管苗培養(yǎng)基”，調整pH值為5.8，每瓶裝培養(yǎng)基約60mL；121℃，高壓滅菌備用。在超凈工作臺上，每瓶接種馬鈴薯品種“荷蘭15”脫毒試管苗節(jié)段25個，分“三階段”培養(yǎng)。第一階段為基礎苗培養(yǎng)：在27℃，光強3000lux下每天光照14小時，培養(yǎng)約15天，待苗高長至6-7cm。第二節(jié)段為壯苗培養(yǎng)：無需更換培養(yǎng)基，剪取頂芽(用于轉接)，在25℃、光強3000lux下每天光照14小時，培養(yǎng)約20天，待苗高長至8-10cm。第三階段為試管薯誘導：改良的高鉀MS培養(yǎng)基，配制成大量元素、微量元素，添加香豆素90mg/L、白糖120g/L、活性炭8g/L，調整pH值為5.8，121℃，高壓滅菌；無需倒出原“試管苗培養(yǎng)基”，直接在培養(yǎng)瓶加入“試管薯誘導培養(yǎng)基”，每瓶約40mL(原“試管苗培養(yǎng)基”體積的2/3)；在20℃，光強1000lux下每天光照6小時，在第45天，收獲試管薯。每瓶收獲試管薯35-40粒。
對比例1：
馬鈴薯品種和試管薯誘導條件設計：常規(guī)MS培養(yǎng)基，配制大量元素、微量元素，添加白糖30g/L、瓊脂粉6g/L，配制成固體培養(yǎng)基，調整pH值為5.8，每瓶裝培養(yǎng)基約40mL；121℃，高壓滅菌備用。在超凈工作臺上，每瓶接種馬鈴薯品種“魯引1號”脫毒試管苗節(jié)段25個，在25-27℃，光強2000-3000lux下每天光照16小時，培養(yǎng)20-25天，待苗高長至6-7cm。將帶有4-5個莖節(jié)的苗，去掉頂芽，打破頂端優(yōu)勢，接種在液體培養(yǎng)基(常規(guī)MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L，另外加入活性炭0.15％、白糖3％，pH值為5.8)上，每瓶接種4-5個莖段，進行淺層靜止培養(yǎng)；晝夜溫度分別為25℃和16℃，每天光照16h，光強2000Lux；培養(yǎng)10天左右，每個莖段由時腋處生出多個小苗。20-25天后，每個腋芽發(fā)育成具有5-7個莖節(jié)的健壯苗時，倒出原有液體培養(yǎng)基換成誘導培養(yǎng)基(常規(guī)MS+BA5.0mg/L+CCC500mg/L，白糖8％，活性炭0.5％，pH值為5.8)或將壯苗轉入含有誘導培養(yǎng)基的新培養(yǎng)瓶，每瓶裝培養(yǎng)基約60mL，在25℃條件下全黑暗培養(yǎng)；約40-45天，收獲試管薯。每瓶收獲試管薯25-30粒。
對比例2：
馬鈴薯品種和試管薯誘導條件設計：常規(guī)MS培養(yǎng)基，配制大量元素、微量元素，添加白糖30g/L、瓊脂粉6g/L，配制成固體培養(yǎng)基，調整pH值為5.8，每瓶裝培養(yǎng)基約40mL；121℃，高壓滅菌備用。在超凈工作臺上，每瓶接種馬鈴薯品種“荷蘭15”脫毒試管苗節(jié)段25個，在25-27℃，光強2000-3000lux下每天光照16小時，培養(yǎng)20-25天，待苗高長至6-7cm。將帶有4-5個莖節(jié)的苗，去掉頂芽，打破頂端優(yōu)勢，接種在液體培養(yǎng)基(常規(guī)MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L，另外加入活性炭0.15％、白糖3％，pH值為5.8)上，每瓶接種4-5個莖段，進行淺層靜止培養(yǎng)；晝夜溫度分別為25℃和16℃，每天光照16h，光強2000Lux；培養(yǎng)10天左右，每個莖段由時腋處生出多個小苗。20-25天后，每個腋芽發(fā)育成具有5-7個莖節(jié)的健壯苗時，倒出原有液體培養(yǎng)基換成誘導培養(yǎng)基(常規(guī)MS+BA5.0mg/L+CCC500mg/L，白糖8％，活性炭0.5％，pH值為5.8)或將壯苗轉入含有誘導培養(yǎng)基的新培養(yǎng)瓶，每瓶裝培養(yǎng)基約60mL，在25℃條件下全黑暗培養(yǎng)；約40-45天，收獲試管薯。每瓶收獲試管薯20-25粒。
將本發(fā)明的技術方案與傳統(tǒng)方法培養(yǎng)的馬鈴薯試管薯對比生產效率，匯總結果如表1所示。
表1不同培養(yǎng)技術馬鈴薯試管薯的生產效率比較
注：傳統(tǒng)方法見對比例1和2(原霽虹，等.馬鈴薯生產技術[M].武漢大學出版社,2015)
最后應該說明的是，以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分進行等同替換。實施例中所列出的尺寸，僅為優(yōu)選尺寸，凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。上述雖然結合附圖對本發(fā)明的具體實施方式進行了描述，但并非對本發(fā)明保護范圍的限制，所屬領域技術人員應該明白，在本發(fā)明的技術方案的基礎上，本領域技術人員不需要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護范圍以內。