本發(fā)明涉及組織培養(yǎng)，具體是一種食用土當(dāng)歸種苗的組織培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

食用土當(dāng)歸是一種多年生草本植物，為藥食兩用的傳統(tǒng)中藥，其嫩莖葉可做菜食用，可炒食、涼拌或腌食；其根及根莖做九眼獨(dú)活入藥，具有祛風(fēng)活血、解熱鎮(zhèn)痛、利尿消腫、疏風(fēng)補(bǔ)虛的功效，用于風(fēng)濕痹痕、腰膝酸軟、頭痛目眩、水腫等癥。當(dāng)前，食用土當(dāng)歸的地上部分是國(guó)內(nèi)、國(guó)際市場(chǎng)最緊俏的野生綠色蔬菜之一，具有較大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但是其野生資源遭到掠奪式采集，加上其自身內(nèi)在因素的影響，其生長(zhǎng)大面積大幅減少。

通常情況下，土當(dāng)歸的種植周期一般為2年，第一年的3月直接栽培，十月下旬收獲肉質(zhì)根作為藥用，選擇留種母根貯藏，次年的3～4月份移栽定植，當(dāng)年的7～8月份留種母株開花結(jié)實(shí)，11月份采收，采用上述傳統(tǒng)的種植方法種植的土當(dāng)歸，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，人力、物力、財(cái)力的投資成本高，并且有將近15～25%的植株容易早抽薹造成產(chǎn)量和質(zhì)量的下降，并且，隨著種植面積的逐步擴(kuò)大，病蟲害也逐步加重，輕者影響土當(dāng)歸的產(chǎn)量和質(zhì)量，重者絕收，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。

土當(dāng)歸一般是單株增殖，但一年只增殖5-6倍，種植戶必須把耕地面積的五分之一用于采收種苗，即使有新品種供應(yīng)，為了增殖也需要很多時(shí)間和場(chǎng)地。

為了適應(yīng)市場(chǎng)需求，擴(kuò)大食用土當(dāng)歸種植面積，提高產(chǎn)量水平，增加經(jīng)濟(jì)效益，廣西資源縣銀竹老山中草藥種植專業(yè)合作社進(jìn)行了食用土當(dāng)歸種苗的組織培養(yǎng)，利用土當(dāng)歸的葉片為外植體建立其快速繁殖技術(shù)，為該物種的資源保護(hù)和可持續(xù)開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種利用食用土當(dāng)歸的葉片為外植體，組織培養(yǎng)其種苗的方法，克服現(xiàn)有土當(dāng)歸的種植生產(chǎn)周期長(zhǎng)，成本高等不足。

本發(fā)明一種食用土當(dāng)歸種苗的組織培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

（1）外植體處理：取土當(dāng)歸葉片為外植體，用清水洗去其表面的塵土，于70%酒精浸泡20-30s，無菌水沖洗2~3次，再用0.1%升汞溶液浸泡消毒7~10min，再用無菌水沖洗3~5次，最后用無菌濾紙吸干外植體表面水分；

（2）外植體的初代培養(yǎng)：將處理后的外植體用解剖刀切成1.0cm×1.0cm的小塊，接種于MS+TDZ0~0.1mg/L +6-BA0.1~0.5mg/L+NAA0.05~0.5mg/L + 蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L， pH5.8的培養(yǎng)基中，初代培養(yǎng)50天，培養(yǎng)溫度25±2℃，光照時(shí)間12h/d，光照強(qiáng)度2000~3000lx；

（3）繼代培養(yǎng)：經(jīng)初代培養(yǎng)后，葉片邊緣誘導(dǎo)產(chǎn)生大量小苗，將小苗接入MS+0.1%活性炭+蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L，pH5.8的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25±2℃，光照時(shí)間12h/d，光照強(qiáng)度2000~3000lx；繼代3天開始有根發(fā)生，培養(yǎng)35~40天長(zhǎng)成完整健壯小苗，株高2-3cm，根的數(shù)目為8-20根；

（4）煉苗與移栽：待土當(dāng)歸小苗株高2~3cm時(shí)，打開培養(yǎng)瓶蓋，在室溫下煉苗7天后，將小苗移栽至珍珠巖:紅輝沸石＝1:1混合的基質(zhì)中。

進(jìn)一步的，步驟（2）所述培養(yǎng)基的優(yōu)選為：MS +TDZ0.1 mg/L+6-BA0.1mg/L+NAA0.5mg/L +蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L。

更進(jìn)一步的，步驟（2）所述培養(yǎng)基的優(yōu)選為：MS +6-BA0.1mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L。

本發(fā)明方法先從土當(dāng)歸的葉片中誘導(dǎo)出愈傷組織，然后使其形成不定胚，再繼代增殖不定胚芽，通過循環(huán)培養(yǎng)分離成單個(gè)的不定胚，在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)成苗。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：選用配方合理的培養(yǎng)基，培養(yǎng)出的組培苗生根率高，穩(wěn)定性好。該方法易操作，而且不受外界條件的限制，四季皆可進(jìn)行，節(jié)約育苗占地面積，降低生產(chǎn)成本，不污染環(huán)境，可以實(shí)現(xiàn)批量生產(chǎn)。通過本發(fā)明方法生產(chǎn)土當(dāng)歸，產(chǎn)量大，成本低，周期短，極具市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。本方法不僅取材方便，不會(huì)影響土當(dāng)歸野生種群的數(shù)量；而且操作簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低、穩(wěn)定高效，能大大縮短育苗周期，將為其保護(hù)和開發(fā)利用提供技術(shù)保障。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容作進(jìn)一步說明，但并不是對(duì)本發(fā)明的限定。

實(shí)施例1

一種食用土當(dāng)歸種苗的組織培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

（1）外植體處理：取土當(dāng)歸葉片為外植體，用清水洗去其表面的塵土，于70%酒精浸泡20-30s，無菌水沖洗2~3次，再用0.1%升汞溶液浸泡消毒7~10min，再用無菌水沖洗3~5次，最后用無菌濾紙吸干外植體表面水分；

（2）外植體的初代培養(yǎng)：將處理后的外植體用解剖刀切成1.0 cm×1.0 cm的小塊，接種于MS +TDZ0.1 mg/L+6-BA0.1mg/L+NAA0.5mg/L +蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L， pH5.8的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25±2℃，光照時(shí)間12h·d-1，光照強(qiáng)度2000~3000lx，21d時(shí)切口邊緣處即開始誘導(dǎo)出叢生小芽，誘導(dǎo)率為100%，培養(yǎng)50天統(tǒng)計(jì)增殖率，單個(gè)葉片誘導(dǎo)小苗數(shù)為20~30棵；

（3）繼代培養(yǎng)：將土當(dāng)歸小苗接入MS+0.1%活性炭+蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L， pH5.8的培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25±2℃，光照時(shí)間12h·d-1，光照強(qiáng)度2000~3000lx，3天后小苗陸續(xù)誘導(dǎo)出根，繼續(xù)培養(yǎng)至40天長(zhǎng)成健壯小苗，株高2-3cm，根的數(shù)目為8-20根；

（4）煉苗與移栽：待土當(dāng)歸小苗株高2~3cm時(shí)，打開培養(yǎng)瓶蓋，在室溫下煉苗7天后進(jìn)行移栽，花盆用50%多菌靈可濕粉劑1g/L溶液浸泡30min；將小苗用50%多菌靈可濕粉劑1000倍液浸泡整株小苗 10 分鐘，移栽入經(jīng)高壓滅菌的珍珠巖和紅輝沸石體積比為1:1混合的基質(zhì)中，30天后統(tǒng)計(jì)成活率，成活率為100%。

實(shí)施例2

一種食用土當(dāng)歸種苗的組織培養(yǎng)方法，包括實(shí)施例1的方法步驟，與其不同的是：初代培養(yǎng)的外植體接種于MS+TDZ0.1 mg/L +6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L +蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L培養(yǎng)基中。13d時(shí)，葉片邊緣及外植體表面萌生大量細(xì)小芽點(diǎn)，芽在外植體上散在分布，芽健壯嫩綠，誘導(dǎo)率為66.7%。培養(yǎng)50天統(tǒng)計(jì)增殖率，單個(gè)葉片誘導(dǎo)小苗數(shù)為35~50棵。

實(shí)施例3

一種食用土當(dāng)歸種苗的組織培養(yǎng)方法，包括實(shí)施例1的方法步驟，與其不同的是：初代培養(yǎng)的外植體接種于MS +6-BA0.1mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L培養(yǎng)基中。19d時(shí)切口邊緣處即開始誘導(dǎo)出小芽，誘導(dǎo)率為100%。培養(yǎng)50天統(tǒng)計(jì)增殖率，單個(gè)葉片誘導(dǎo)小苗數(shù)為40~60棵。