【技術領域】

本發(fā)明涉及植物培育繁殖技術領域，具體涉及一種香樟的組織培養(yǎng)方法。

背景技術：

香樟樹是一種重要的多種用途生態(tài)和經(jīng)濟樹種，其木材致密美觀，具有芳香味，防蟲擊蚊之用；香樟樹樹姿秀麗，四季常青且枝葉茂密，具有很強吸塵能力和抗霧霾能力；香樟樹的木材、根、葉及果實皆含精油，是天然樟腦，芳香油和芳香醇的重要來源，其精油和芳香醇價格每噸18-32萬之間，其精加工產(chǎn)品涉及眾多領域和行業(yè)。

在培育過程中，香樟樹通常以種子進行繁殖，后代變異極大，扦插繁殖和分蘗繁殖等能最大限度保持母本優(yōu)良特性，生產(chǎn)成本相對較低，而隨著香樟樹特色資源利用水平的不斷提高，特別是產(chǎn)業(yè)脫貧項目上，扦插繁殖難于在短時間內(nèi)滿足規(guī)模化生產(chǎn)的需求，還具有根系不發(fā)達，浪費枝條等缺點，因此，研究出一種縮短其育苗時間、提高出芽存活率，滿足規(guī)模化生產(chǎn)的香樟組培技術有著十分重要的意義。

技術實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于，提供一種香樟的組織培養(yǎng)方法，本發(fā)明的香樟的組織培養(yǎng)方法在含有不同激素配比的wpm培養(yǎng)基上誘導香樟的愈傷組織，通過誘導培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基以及生根培養(yǎng)基的培養(yǎng)，獲得香樟的再生苗，其培養(yǎng)方法取材方便，材料來源、數(shù)量充足，容易獲得無菌材料，能夠用較少的優(yōu)良母本，繁殖出大批量的種苗，適用于規(guī)?；a(chǎn)。

為了解決上述技術問題，本發(fā)明采用了如下的技術方案：

一種香樟的組織培養(yǎng)方法，具體包括如下步驟：

(一)外植體的預處理：剪取經(jīng)過挖根處理后長出的嫩芽作為外植體，將外植體剪成4-6cm的條狀物，然后用大蒜汁將外植體浸泡15-30min(浸泡時間長短視材料木質(zhì)化程度而定)，浸泡過程不斷進行振蕩，浸泡完成后用無菌水將外植體沖洗4-6次，然后放置于無菌接種盤吹干其表面水分，切去葉片以及舊的切口，切成2-2.5cm帶3個芽的莖段，將帶芽莖段置于自來水下沖洗30min，用濾紙吸干帶芽莖段備用；

(二)培養(yǎng)基的培養(yǎng)：

(1)誘導培養(yǎng)：將上述步驟獲得的帶芽莖段先接種到誘導培養(yǎng)基上，黑暗條件下培養(yǎng)5-10天，然后按光照和黑暗時間比為2:1交替進行誘導培養(yǎng)，誘導新芽長高至4-5cm后，將新芽的葉片切去，切成2-3cm的莖段；

所述誘導培養(yǎng)基含有wpm培養(yǎng)基+2.5mg/l6-ba+0.25mg/lnaa+4.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖；

(2)增殖培養(yǎng)：將步驟(1)培養(yǎng)后處理得到的莖段接種到增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)35-40天后，將新芽轉(zhuǎn)到新的增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)，增殖倍數(shù)達到3-4倍；

所述增殖培養(yǎng)基的成分為：wpm+2.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+3.5g/l瓊脂+25g/l蔗糖；

(3)生根培養(yǎng)：將經(jīng)步驟(2)增殖培養(yǎng)得到的叢芽切除其多余的側(cè)面芽或不定芽，按照高度為1.5-3cm將具有單芽的小枝剪切下來，然后將剪切后的小枝放到生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)24-26天后即可出瓶煉苗；

所述生根培養(yǎng)基的成分為：wpm+2.0mg/l生根粉+4.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖；

上述三種培養(yǎng)基的制備方法是將組成培養(yǎng)基的原料混合攪拌均勻后，將其煮沸至ph值調(diào)節(jié)至5.6-6.0，然后裝入培養(yǎng)器皿中，在120-123℃高溫下蒸汽滅菌15-20min后進行冷卻，得到培養(yǎng)基備用；

(三)大棚煉苗：用鑷子將小苗從培養(yǎng)器皿中取出，用自來水將小苗根部的培養(yǎng)基洗凈，然后種植到培養(yǎng)土苗盤里并噴淋定根水，待葉面干后，噴施800-1000倍液的農(nóng)用鏈霉毒，7-15天后噴施20-30倍的沼氣液，在大棚內(nèi)培育3-5個月后進行移栽。

優(yōu)選地，所述組織培養(yǎng)方法還包括外植體準備的步驟，具體為：通過檢測取含精油量和芳香醇高的香樟樹作為母體，將母體進行挖根處理，經(jīng)過挖根處理待斷根處長出嫩芽后，取斷根位置新長出的嫩芽作為外植體。

優(yōu)選地，步驟(1)所述誘導培養(yǎng)是在溫度為26-28℃，濕度為65-80％，ph值為5.6-6.0的條件下進行的，誘導培養(yǎng)中的光照為自然光照2000-2500lux。

優(yōu)選地，步驟(2)所述增殖培養(yǎng)是在溫度為26-28℃，濕度為50-75％，ph值為5.6-6.0的條件下進行的，所述增殖培養(yǎng)光照強度為2000-3000lux，光照時度為12-14h/天。

優(yōu)選地，步驟(3)所述生根培養(yǎng)是在溫度為24-27℃，濕度為40-60％，ph值為5.6-6.0，光照強度為2000-3000lux，光照時度為12-14h/天的條件下進行的。

優(yōu)選地，步驟(3)所述生根粉為abt1號生根粉。

優(yōu)選地，所述作為外植體的嫩芽為4-6月份非下雨天期間長出的嫩芽。

本發(fā)明經(jīng)大棚煉苗得到的香樟苗從大棚內(nèi)取出，放入清水盆中，洗去根部瓊脂，然后撈出，用多菌靈處理后移栽至營養(yǎng)土中，營養(yǎng)土上層為2cm河沙，下層為4cm珍珠巖、蛭石及腐殖質(zhì)混合物，待有新葉長出后按常規(guī)苗圃育苗措施管理。

綜上所述，由于采用了上述技術方案，本發(fā)明的有益效果是：

1、本發(fā)明的一種香樟的組織培養(yǎng)方法在選擇外植體時，選擇通過檢測取含精油量和芳香醇高的香樟樹作為母體，將母體進行挖根處理，經(jīng)過挖根處理待斷根處長出嫩芽后，取斷根位置新長出的嫩芽作為外植體，用上述方法得到的外植體可以有效的保持了優(yōu)良母本的穩(wěn)定性狀，通過組織培養(yǎng)對外植體進行處理，與常規(guī)的扦插和壓條繁殖相比，組織培養(yǎng)能夠用較少的優(yōu)良母本，繁殖出大批量的種苗，適用于規(guī)?；a(chǎn)。

2、本發(fā)明的香樟的組織培養(yǎng)方法在含有不同激素配比的wpm培養(yǎng)基上誘導愈傷組織，通過誘導培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基以及生根培養(yǎng)基的培養(yǎng)，獲得香樟的再生苗，其培養(yǎng)方法取材方便，材料來源、數(shù)量充足，容易獲得無菌材料；篩選獲得植株再生的香樟無性系，可大大提高農(nóng)桿菌介導遺傳轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因獲得率，有效縮短香樟的遺傳轉(zhuǎn)化周期，是一套易于掌握、簡便節(jié)約、快速高效的再生體系。

【具體實施方式】

下面的實施例可以幫助本領域的技術人員更全面地理解本發(fā)明，但不可以以任何方式限制本發(fā)明。

實施例1

本實施例提供一種香樟的組織培養(yǎng)方法，具體包括如下步驟：

(一)外植體的準備：通過檢測取含精油量和芳香醇高的香樟樹作為母體，將母體進行挖根處理，經(jīng)過挖根處理待斷根處長出嫩芽后，取斷根位置新長出的嫩芽作為外植體，其中，嫩芽為4-6月份非下雨天期間長出的嫩芽；

(二)外植體的預處理：剪取經(jīng)過挖根處理后長出的嫩芽作為外植體，將外植體剪成4cm的條狀物，然后用大蒜汁將外植體浸泡15min，浸泡過程不斷進行振蕩，浸泡完成后用無菌水將外植體沖洗4次，然后放置于無菌接種盤吹干其表面水分，切去葉片以及舊的切口，切成2cm帶3個芽的莖段，將帶芽莖段置于自來水下沖洗30min，用濾紙吸干帶芽莖段備用；

(三)培養(yǎng)基的培養(yǎng)：

(1)誘導培養(yǎng)：將上述步驟獲得的帶芽莖段先接種到誘導培養(yǎng)基上，黑暗條件下培養(yǎng)5天，然后按光照和黑暗時間比為2:1交替進行誘導培養(yǎng)，誘導新芽長高至4cm后，將新芽的葉片切去，切成2cm的莖段；誘導培養(yǎng)是在溫度為26℃，濕度為65％，ph值為5.6的條件下進行的，誘導培養(yǎng)中的光照為自然光照2000lux；其中，誘導培養(yǎng)基含有wpm培養(yǎng)基+2.5mg/l6-ba+0.25mg/lnaa+4.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖；

(2)增殖培養(yǎng)：將步驟(1)培養(yǎng)后處理得到的莖段接種到增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)35天后，將新芽轉(zhuǎn)到新的增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)，增殖倍數(shù)達到3倍；增殖培養(yǎng)是在溫度為26℃，濕度為50％，ph值為5.6的條件下進行的，所述增殖培養(yǎng)光照強度為2000lux，光照時度為12h/天；其中，增殖培養(yǎng)基的成分為：wpm+2.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+3.5g/l瓊脂+25g/l蔗糖；

(3)生根培養(yǎng)：將經(jīng)步驟(2)增殖培養(yǎng)得到的叢芽切除其多余的側(cè)面芽或不定芽，按照高度為1.5cm將具有單芽的小枝剪切下來，然后將剪切后的小枝放到生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)24天后即可出瓶煉苗；生根培養(yǎng)是在溫度為24℃，濕度為40％，ph值為5.6，光照強度為2000lux，光照時度為12h/天的條件下進行的；其中，生根培養(yǎng)基的成分為：wpm+2.0mg/labt1號生根粉+4.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖；

上述三種培養(yǎng)基的制備方法是將組成培養(yǎng)基的原料混合攪拌均勻后，將其煮沸至ph值調(diào)節(jié)至5.6，然后裝入培養(yǎng)器皿中，在120℃高溫下蒸汽滅菌15min后進行冷卻，得到培養(yǎng)基備用；

(四)大棚煉苗：用鑷子將小苗從培養(yǎng)器皿中取出，用自來水將小苗根部的培養(yǎng)基洗凈，然后種植到培養(yǎng)土苗盤里并噴淋定根水，待葉面干后，噴施800倍液的農(nóng)用鏈霉毒，7天后噴施20倍的沼氣液，在大棚內(nèi)培育3個月后進行移栽。

實施例2

本實施例提供一種香樟的組織培養(yǎng)方法，具體包括如下步驟：

(一)外植體的準備：通過檢測取含精油量和芳香醇高的香樟樹作為母體，將母體進行挖根處理，經(jīng)過挖根處理待斷根處長出嫩芽后，取斷根位置新長出的嫩芽作為外植體，其中，嫩芽為4-6月份非下雨天期間長出的嫩芽；

(二)外植體的預處理：剪取經(jīng)過挖根處理后長出的嫩芽作為外植體，將外植體剪成5cm的條狀物，然后用大蒜汁將外植體浸泡22min，浸泡過程不斷進行振蕩，浸泡完成后用無菌水將外植體沖洗5次，然后放置于無菌接種盤吹干其表面水分，切去葉片以及舊的切口，切成2.2cm帶3個芽的莖段，將帶芽莖段置于自來水下沖洗30min，用濾紙吸干帶芽莖段備用；

(三)培養(yǎng)基的培養(yǎng)：

(1)誘導培養(yǎng)：將上述步驟獲得的帶芽莖段先接種到誘導培養(yǎng)基上，黑暗條件下培養(yǎng)7天，然后按光照和黑暗時間比為2:1交替進行誘導培養(yǎng)，誘導新芽長高至4cm后，將新芽的葉片切去，切成2cm的莖段；誘導培養(yǎng)是在溫度為27℃，濕度為75％，ph值為5.8的條件下進行的，誘導培養(yǎng)中的光照為自然光照2250lux；其中，誘導培養(yǎng)基含有wpm培養(yǎng)基+2.5mg/l6-ba+0.25mg/lnaa+4.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖；

(2)增殖培養(yǎng)：將步驟(1)培養(yǎng)后處理得到的莖段接種到增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)38天后，將新芽轉(zhuǎn)到新的增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)，增殖倍數(shù)達到3倍；增殖培養(yǎng)是在溫度為27℃，濕度為65％，ph值為5.8的條件下進行的，所述增殖培養(yǎng)光照強度為2500lux，光照時度為13h/天；其中，增殖培養(yǎng)基的成分為：wpm+2.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+3.5g/l瓊脂+25g/l蔗糖；

(3)生根培養(yǎng)：將經(jīng)步驟(2)增殖培養(yǎng)得到的叢芽切除其多余的側(cè)面芽或不定芽，按照高度為1.9cm將具有單芽的小枝剪切下來，然后將剪切后的小枝放到生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)25天后即可出瓶煉苗；生根培養(yǎng)是在溫度為25℃，濕度為50％，ph值為5.8，光照強度為2500lux，光照時度為13h/天的條件下進行的；其中，生根培養(yǎng)基的成分為：wpm+2.0mg/labt1號生根粉+4.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖；

上述三種培養(yǎng)基的制備方法是將組成培養(yǎng)基的原料混合攪拌均勻后，將其煮沸至ph值調(diào)節(jié)至5.8，然后裝入培養(yǎng)器皿中，在122℃高溫下蒸汽滅菌17min后進行冷卻，得到培養(yǎng)基備用；

(四)大棚煉苗：用鑷子將小苗從培養(yǎng)器皿中取出，用自來水將小苗根部的培養(yǎng)基洗凈，然后種植到培養(yǎng)土苗盤里并噴淋定根水，待葉面干后，噴施900倍液的農(nóng)用鏈霉毒，12天后噴施25倍的沼氣液，在大棚內(nèi)培育4個月后進行移栽。

實施例3

本實施例提供一種香樟的組織培養(yǎng)方法，具體包括如下步驟：

(一)外植體的準備：通過檢測取含精油量和芳香醇高的香樟樹作為母體，將母體進行挖根處理，經(jīng)過挖根處理待斷根處長出嫩芽后，取斷根位置新長出的嫩芽作為外植體，其中，嫩芽為4-6月份非下雨天期間長出的嫩芽；

(二)外植體的預處理：剪取經(jīng)過挖根處理后長出的嫩芽作為外植體，將外植體剪成6cm的條狀物，然后用大蒜汁將外植體浸泡30min，浸泡過程不斷進行振蕩，浸泡完成后用無菌水將外植體沖洗6次，然后放置于無菌接種盤吹干其表面水分，切去葉片以及舊的切口，切成2.5cm帶3個芽的莖段，將帶芽莖段置于自來水下沖洗30min，用濾紙吸干帶芽莖段備用；

(三)培養(yǎng)基的培養(yǎng)：

(1)誘導培養(yǎng)：將上述步驟獲得的帶芽莖段先接種到誘導培養(yǎng)基上，黑暗條件下培養(yǎng)10天，然后按光照和黑暗時間比為2:1交替進行誘導培養(yǎng)，誘導新芽長高至5cm后，將新芽的葉片切去，切成3cm的莖段；誘導培養(yǎng)是在溫度為28℃，濕度為80％，ph值為6.0的條件下進行的，誘導培養(yǎng)中的光照為自然光照2500lux；其中，誘導培養(yǎng)基含有wpm培養(yǎng)基+2.5mg/l6-ba+0.25mg/lnaa+4.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖；

(2)增殖培養(yǎng)：將步驟(1)培養(yǎng)后處理得到的莖段接種到增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)40天后，將新芽轉(zhuǎn)到新的增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)，增殖倍數(shù)達到4倍；增殖培養(yǎng)是在溫度為28℃，濕度為75％，ph值為6.0的條件下進行的，所述增殖培養(yǎng)光照強度為3000lux，光照時度為12-14h/天；其中，增殖培養(yǎng)基的成分為：wpm+2.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+3.5g/l瓊脂+25g/l蔗糖；

(3)生根培養(yǎng)：將經(jīng)步驟(2)增殖培養(yǎng)得到的叢芽切除其多余的側(cè)面芽或不定芽，按照高度為3cm將具有單芽的小枝剪切下來，然后將剪切后的小枝放到生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)26天后即可出瓶煉苗；生根培養(yǎng)是在溫度為27℃，濕度為60％，ph值為6.0，光照強度為3000lux，光照時度為14h/天的條件下進行的；其中，生根培養(yǎng)基的成分為：wpm+2.0mg/labt1號生根粉+4.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖；

上述三種培養(yǎng)基的制備方法是將組成培養(yǎng)基的原料混合攪拌均勻后，將其煮沸至ph值調(diào)節(jié)至6.0，然后裝入培養(yǎng)器皿中，在123℃高溫下蒸汽滅菌20min后進行冷卻，得到培養(yǎng)基備用；

(四)大棚煉苗：用鑷子將小苗從培養(yǎng)器皿中取出，用自來水將小苗根部的培養(yǎng)基洗凈，然后種植到培養(yǎng)土苗盤里并噴淋定根水，待葉面干后，噴施1000倍液的農(nóng)用鏈霉毒，15天后噴施30倍的沼氣液，在大棚內(nèi)培育5個月后進行移栽。

效果驗證

為了進一步說明本發(fā)明香樟的組織培養(yǎng)方法的應用價值，實施人分為以下四組做對比試驗：

第一組：實施例1所述的組織培養(yǎng)方法；

第二組：實施例2所述的組織培養(yǎng)方法；

第三組：實施例3所述的組織培養(yǎng)方法；

第四組：培養(yǎng)基配方更換為wpm培養(yǎng)基+2.5mg/l6-ba+0.5mg/liba-d+30g/l蔗糖，其他方式嚴格按照實施例2進行。

s1：觀察上述四組在組培苗情況，記錄各組的生根苗數(shù)、生根率和多根率，結果見表1；

表1四組香樟組培苗情況表

根據(jù)上表可知：采用本發(fā)明的組織培養(yǎng)方法培育得到的香樟種苗，生根苗數(shù)多，生根率以及多根率高，適用于大規(guī)模種植，值得推廣。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。