本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種羽裂唇柱苣苔的組織培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

羽裂唇柱苣苔(Chirita pinnatifida(Hand.-Mazz.)B.L.Burtt)為苦苣苔科唇柱苣苔屬的多年生草本植物。分布于廣西、廣東北部、貴州東南部、湖南南部、江西、福建西部、浙江南部和西部。生于海拔600-1500米的谷林中石上或溪邊。全草可供藥用，用于跌打損傷等癥。此外，羽裂唇柱苣苔還具有極高的觀賞價值，應(yīng)用前景廣闊。

羽裂唇柱苣苔栽培難度較大，對生長環(huán)境要求苛刻。需要高空氣濕度、高土壤濕度，但是同時期根系對土壤水氣化、含氧量有嚴(yán)格要求；忌陽光直射，喜弱酸至中性栽培基質(zhì)；畏熱；喜夏季較高的日夜溫差，夏季日溫最高溫度最好不超過30℃。

目前，有關(guān)羽裂唇柱苣苔的研究極少，僅在資源調(diào)查中有少量涉及。羽裂唇柱苣苔可以采用種子繁殖或葉片扦插，而組織培養(yǎng)技術(shù)具有繁殖速度快、繁殖系數(shù)大，繁殖后代整齊一致，能保持原有品種的優(yōu)良性狀，不受季節(jié)的限制等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用各種觀賞植物中，目前尚未見有應(yīng)用于羽裂唇柱苣苔上。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對羽裂唇柱苣苔現(xiàn)有繁育技術(shù)的不足之處，本發(fā)明提供一種羽裂唇柱苣苔的組織培養(yǎng)方法，從而可以達(dá)到快速獲得羽裂唇柱苣苔優(yōu)質(zhì)種苗的目的。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種羽裂唇柱苣苔的組織培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

(1)外植體的消毒滅菌：春季取羽裂唇柱苣苔的幼嫩葉片，先用0.1-0.5％洗衣粉溶液浸泡25-30min后在流水下沖洗30min，并用軟毛刷輕輕刷洗葉片，然后轉(zhuǎn)入超凈工作臺進(jìn)行滅菌操作，先用棉球蘸取75％酒精拭擦葉片表面，無菌水沖洗2次，將葉片在75％酒精中浸泡10s，無菌水沖洗3次，再用0.1％氯化汞溶液處理6min，無菌水沖洗3次，最后再用0.1％氯化汞溶液處理6min，無菌水沖洗3次，氯化汞滅菌過程中輕輕震蕩使氯化汞充分接觸葉片；葉片切成2cm×2cm大小，接種在MS培養(yǎng)基，得到無菌葉片；

(2)不定芽的誘導(dǎo)：將獲得的無菌葉片切成1cm×1cm大小，并在葉片四周留有切口，接種在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，經(jīng)過20-25d的培養(yǎng)，葉片四周的傷口誘導(dǎo)出不定芽；

(3)繼代培養(yǎng)：將獲得的不定芽切取下來，接種在繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)25-30d，得到組培小苗；

(4)生根培養(yǎng)：選取高度為1.5-3.0cm的組培小苗，接種在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)18-20d，得到組培生根苗；

(5)煉苗移栽：將高度為2.5-4.0cm的生根苗移出培養(yǎng)室后揭去組培瓶蓋在自然條件下煉苗4洗凈培養(yǎng)基移栽到裝有基質(zhì)的50孔穴盤中；澆透定根水后，將移栽小苗置于有遮陽網(wǎng)的蔭棚下，透光率為40-50％，并采用間歇性噴霧系統(tǒng)控制空氣濕度，每2h噴霧1次，噴霧時間每次40s，確保空氣濕度85％以上，早晚澆透水各1次，移栽后7-10d，即可成活。

作為優(yōu)選，步驟(2)中的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0-2.0mg/L+NAA0.01-0.1mg/L。

作為優(yōu)選，步驟(3)中的繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0-2.0mg/L+NAA0.05mg/L+活性炭0.1g/L。

作為優(yōu)選，步驟(4)中的生根培養(yǎng)基為MS+IBA0.1-0.5mg/L+活性炭0.1g/L。

作為優(yōu)選，步驟(5)中的基質(zhì)是由泥炭和珍珠巖按照體積比為2:1組成。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明的羽裂唇柱苣苔的組織培養(yǎng)方法具有后代長勢良好，不定芽多，繁殖速度快、繁殖系數(shù)大，繁殖后代整齊一致，生根率高，移栽成活率高的優(yōu)點。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和本質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

實施例1：

一種羽裂唇柱苣苔的組織培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

(1)外植體的消毒滅菌：春季取羽裂唇柱苣苔的幼嫩葉片，先用0.1％洗衣粉溶液浸泡25min后在流水下沖洗干凈30min，并用軟毛刷輕輕刷洗葉片，然后轉(zhuǎn)入超凈工作臺進(jìn)行滅菌操作，先用棉球蘸取75％酒精拭擦葉片表面，無菌水沖洗2次，將葉片在75％酒精中浸泡10s，無菌水沖洗3次，再用0.1％氯化汞溶液處理6min，無菌水沖洗3次，最后再用0.1％氯化汞溶液處理6min，無菌水沖洗3次，氯化汞滅菌過程中輕輕震蕩使氯化汞充分接觸葉片；葉片切成2cm×2cm大小，接種在MS培養(yǎng)基，得到無菌葉片；

(2)不定芽的誘導(dǎo)：將獲得的無菌葉片切成1cm×1cm大小，并在葉片四周留有切口，接種在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，經(jīng)過21d的培養(yǎng)，葉片四周的傷口誘導(dǎo)出不定芽；所述的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.01mg/L；

(3)繼代培養(yǎng)：將獲得的不定芽切取下來，接種在繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)25d，得到組培小苗；所述的繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.05mg/L+活性炭0.1g/L；

(4)生根培養(yǎng)：選取高度為1.5cm的組培小苗，接種在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)20d；所述的生根培養(yǎng)基為MS+IBA 0.1mg/L+活性炭0.1g/L；

(5)煉苗移栽：將高為2.5cm的生根苗移出培養(yǎng)室后揭蓋在自然條件下煉苗4d；洗凈培養(yǎng)基移栽到裝有基質(zhì)的50孔穴盤中；澆透定根水后，將移栽小苗置于有遮陽網(wǎng)的蔭棚下，透光率為40％，并采用間歇性噴霧系統(tǒng)控制空氣濕度，每2h噴霧1次，噴霧時間每次40s，確?？諝鉂穸?5％以上，早晚澆透水各1次，移栽后7d，即可成活；所述的基質(zhì)是由泥炭和珍珠巖按照體積比為2:1組成。

實施例2：

一種羽裂唇柱苣苔的組織培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

(1)外植體的消毒滅菌：春季取羽裂唇柱苣苔的幼嫩葉片，先用0.5％洗衣粉溶液浸泡30min后在流水下沖洗30min，并用軟毛刷輕輕刷洗葉片，然后轉(zhuǎn)入超凈工作臺進(jìn)行滅菌操作，先用棉球蘸取75％酒精拭擦葉片表面，無菌水沖洗2次，將葉片在75％酒精中浸泡10s，無菌水沖洗3次，再用0.1％氯化汞溶液處理6min，無菌水沖洗3次，最后再用0.1％氯化汞溶液處理6min，無菌水沖洗3次，氯化汞滅菌過程中輕輕震蕩使氯化汞充分接觸葉片；葉片切成2cm×2cm大小，接入MS培養(yǎng)基，得到無菌葉片；

(2)不定芽的誘導(dǎo)：將獲得的無菌葉片切成1cm×1cm大小，并在葉片四周留有切口，接種在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，經(jīng)過20d的培養(yǎng)，葉片四周的傷口誘導(dǎo)出不定芽；所述的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.01mg/L；

(3)繼代培養(yǎng)：將獲得的不定芽切取下來，接種在繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)30d，得到組培小苗；所述的繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA2.0mg/L+NAA 0.05mg/L+活性炭0.1g/L；

(4)生根培養(yǎng)：選取高度難為3.0cm的組培小苗，接種在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)18d；所述的生根培養(yǎng)基為MS+IBA 0.5mg/L+活性炭0.1g/L；

(5)煉苗移栽：將高為4.0cm的生根苗移出培養(yǎng)室后揭蓋在自然條件下煉苗5d；洗凈培養(yǎng)基移栽到裝有基質(zhì)的50孔穴盤中；澆透定根水后，將移栽小苗置于有遮陽網(wǎng)的蔭棚下，透光率為50％，并采用間歇性噴霧系統(tǒng)控制空氣濕度，每2h噴霧1次，噴霧時間每次40s，確保空氣濕度85％以上，早晚澆透水各1次，移栽后10d，即可成活；所述的基質(zhì)是由泥炭和珍珠巖按照體積比為2:1組成。

實施例3：

一種羽裂唇柱苣苔的組織培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

(1)外植體的消毒滅菌：春季取羽裂唇柱苣苔的幼嫩葉片，先用0.2％洗衣粉溶液浸泡28min后在流水下沖洗干凈30min，并用軟毛刷輕輕刷洗葉片，然后轉(zhuǎn)入超凈工作臺進(jìn)行滅菌操作，先用棉球蘸取75％酒精拭擦葉片表面，無菌水沖洗2次，將葉片在75％酒精中浸泡10s，無菌水沖洗3次，再用0.1％氯化汞溶液處理6min，無菌水沖洗3次，最后再用0.1％氯化汞溶液處理6min，無菌水沖洗3次，氯化汞滅菌過程中輕輕震蕩使氯化汞充分接觸葉片；葉片切成2cm×2cm大小，接種在MS培養(yǎng)基，得到無菌葉片；

(2)不定芽的誘導(dǎo)：將獲得的無菌葉片切成1cm×1cm大小，并在葉片四周留有切口，接種在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，經(jīng)過25d的培養(yǎng)，葉片四周的傷口誘導(dǎo)出不定芽；所述的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L；

(3)繼代培養(yǎng)：將獲得的不定芽切取下來，接種在繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)26d，得到組培小苗；所述的繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.05mg/L+活性炭0.1g/L；

(4)生根培養(yǎng)：選取高度為2.0cm的組培小苗，接種在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)19d；所述的生根培養(yǎng)基為MS+IBA 0.3mg/L+活性炭0.1g/L；

(5)煉苗移栽：將高為3.0cm的生根苗移出培養(yǎng)室后揭蓋在自然條件下煉苗4d；洗凈培養(yǎng)基移栽到裝有基質(zhì)的50孔穴盤中；澆透定根水后，將移栽小苗置于有遮陽網(wǎng)的蔭棚下，透光率為45％，并采用間歇性噴霧系統(tǒng)控制空氣濕度，每2h噴霧1次，噴霧時間每次40s，確?？諝鉂穸?5％以上，早晚澆透水各1次，移栽后8d，即可成活；所述的基質(zhì)是由泥炭和珍珠巖按照體積比為2:1組成。

將上述實施例1-3得到的羽裂唇柱苣苔的組織培養(yǎng)方法中不定芽誘導(dǎo)、不定芽的繼代增值、不定芽生根情況以及組培苗的移栽成活率進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計，結(jié)果見表1。

表1本發(fā)明的羽裂唇柱苣苔的組織培養(yǎng)方法對不定芽誘導(dǎo)、不定芽的繼代增值、不定芽生根情況的測定

由表1可知，本發(fā)明的羽裂唇柱苣苔的組織培養(yǎng)方法得到的不定芽長勢良好，不定芽多；其誘導(dǎo)率和生根率均為100％，組培苗的移栽成活率為100％?？梢?，本發(fā)明的方法具有明顯的技術(shù)優(yōu)勢，值得進(jìn)一步推廣和應(yīng)用。

前述對本發(fā)明的具體示例性實施方案的描述是為了說明和例證的目的。這些描述并非想將本發(fā)明限定為所公開的精確形式，并且很顯然，根據(jù)上述教導(dǎo)，可以進(jìn)行很多改變和變化。對示例性實施例進(jìn)行選擇和描述的目的在于解釋本發(fā)明的特定原理及其實際應(yīng)用，從而使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)并利用本發(fā)明的各種不同的示例性實施方案以及各種不同的選擇和改變。本發(fā)明的范圍意在由權(quán)利要求書及其等同形式所限定。