本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是涉及一種苦苣苔科植物組織培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

苦苣苔科(Gesneriaceae)植物多為多年生草本植物，種類(lèi)繁多，全世界約有140屬，2000余種，我國(guó)有58屬463種。有的種類(lèi)既耐旱又耐陰、耐濕，有的種類(lèi)具有很高的藥用價(jià)值，有的種類(lèi)株型、葉形、花形變化豐富，花葉兼美，觀賞價(jià)值高，具有一定的室內(nèi)觀賞盆花開(kāi)發(fā)前景；但目前大多種類(lèi)尚未進(jìn)入商品開(kāi)發(fā)階段，且由于自身的遺傳缺陷及野生資源的過(guò)度開(kāi)發(fā)，很多具有較高應(yīng)用價(jià)值的苦苣苔科植物已瀕臨滅菌。利用組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)有助于苦苣苔科植物的商品開(kāi)發(fā)和種質(zhì)資源保存，還有利于苦苣苔科植物的良種選育、人工種子培育、生理代謝研究等工作的進(jìn)一步開(kāi)展。

目前，苦苣苔的組織培養(yǎng)技術(shù)已有較多報(bào)道，但是在眾多的現(xiàn)有技術(shù)中，初代培養(yǎng)不定芽的分化率、繼代增殖培養(yǎng)的增殖系數(shù)比較低，并且生根率也沒(méi)有能夠達(dá)到100％，如專(zhuān)利CN102144556A公開(kāi)的瑤山苣苔組織培養(yǎng)及快速繁殖的方法中，其不定芽分化率僅為31.7％，而繁殖系數(shù)僅為4.6/60d，生根率為90.7％；專(zhuān)利CN103141390A公開(kāi)的紅苞半蒴苣苔的繁殖方法，其記載的繼代繁殖培養(yǎng)的增殖倍數(shù)為3.6倍；CN105325301A公開(kāi)了一種心葉小花苣苔兩步成苗組培快速繁殖的方法，其記載的不定芽分化率最高為86.9％，增殖系數(shù)最高為6.1/50d，生根率最高為89.5％/30d。CN104823855A公開(kāi)的短毛唇柱苣苔組培快繁方法中，增殖系數(shù)為15，雖然有所提高，但是仍舊不高。此外，還有諸多苦苣苔科植物的組織快繁技術(shù)，但是由于在培養(yǎng)基的選擇搭配上不夠理想，致使在培養(yǎng)過(guò)程中，愈傷組織誘導(dǎo)率、不定芽分化率、增至培養(yǎng)的增殖系數(shù)以及生根率等各階段的效果較差。因此，提供一種在各階段具有較好快繁效果的組織培養(yǎng)方法，可以極大地推動(dòng)苦苣苔科植物的經(jīng)濟(jì)效益。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種苦苣苔科植物組織培養(yǎng)方法，使得所述組織培養(yǎng)方法能夠在培養(yǎng)過(guò)程中具備較高的愈傷誘導(dǎo)率、不定芽分化率、增殖系數(shù)和生根率。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種苦苣苔科植物組織培養(yǎng)方法，包括：

步驟1、取苦苣苔科植物的外植體進(jìn)行滅菌；

步驟2、將外植體接種到初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，先進(jìn)行暗培養(yǎng)誘導(dǎo)出愈傷組織，而后進(jìn)行光培養(yǎng)分化出不定芽；所述初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用如下之一：

(1)含有0.04mg/L的TDZ、0.2～0.8mg/L的2,4-D、0.1～0.3mg/L的NAA、20～25g/L的蔗糖的MS培養(yǎng)基，pH值為5.8-6.0；

(2)含有0.8mg/L的6-BA、0.08mg/L的KT、0.1mg/L的IAA、20～25g/L的蔗糖的MS培養(yǎng)基，pH值5.8-6.0；

步驟3、將分化出不定芽的芽塊接種到繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，獲得叢生芽的有效苗，所述繼代培養(yǎng)基為含有0.01mg/L的TDZ、0.4mg/L的6-BA、0.05mg/L的NAA、200mg/L的CH(即水解酪蛋白)的MS培養(yǎng)基，pH值5.8-6.0；

步驟4、將有效苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，獲得完整無(wú)菌苗，所述生根培養(yǎng)基為含有0.2mg/L的IBA、0.1mg/L的IAA、20g/L的蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基，pH值為6.0～6.2。

對(duì)于植物組織培養(yǎng)，培養(yǎng)基是其生長(zhǎng)狀態(tài)的最關(guān)鍵因素之一，現(xiàn)有苦苣苔植物的組織培養(yǎng)方法由于對(duì)初代誘導(dǎo)分化、繼代增殖以及生根三個(gè)階段的培養(yǎng)基選擇以及組合搭配不當(dāng)，使得各階段的愈傷誘導(dǎo)率、不定芽分化率、增殖系數(shù)和生根率都比較差，本發(fā)明選擇特定的三個(gè)階段培養(yǎng)基組成了一個(gè)成體系的苦苣苔植物快繁工藝，在每一個(gè)階段都具有較好的效果。

作為優(yōu)選，步驟1為取苦苣苔科植物的外植體用酒精和升汞進(jìn)行滅菌。

進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟1為：

取苦苣苔科植株的外植體，用自來(lái)水沖洗干凈后，移入超凈工作臺(tái)，用75％酒精浸泡30～60s，無(wú)菌水清洗2次，然后用加2滴TWeen-20的0.1％HgCl₂溶液處理5min，無(wú)菌水清洗1次；再用加2滴TWeen-20的0.1％HgCl₂溶液處理2～5min，無(wú)菌水清洗5～6次，將外植體置于無(wú)菌濾紙上吸干水分，待用。

在本發(fā)明中，所述苦苣苔科植物優(yōu)選為報(bào)春苣苔、旋朔苣苔或半蒴苣苔，其中包括多痕報(bào)春苣苔(Primulina minutihamata)、永福報(bào)春苣苔(Primulina yungfuensis)、藥用報(bào)春苣苔(Primulina medica)、豬耳朵(Boea hygrometrica)、疏脈半蒴苣苔(Hemiboea cavalerei var.paucinervis)、武宣報(bào)春苣苔(Primulina wuxuanensis)。而所選用的外植體優(yōu)選采用苦苣苔科植物的葉片和/或葉柄。其中，作為優(yōu)選，多痕報(bào)春苣苔、永福報(bào)春苣苔、藥用報(bào)春苣苔、豬耳朵采用含有0.04mg/L的TDZ、0.2～0.8mg/L的2,4-D、0.1～0.3mg/L的NAA、20～25g/L的蔗糖的MS培養(yǎng)基作為初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基，pH值為5.8-6.0；疏脈半蒴苣苔、武宣報(bào)春苣苔采用含有0.8mg/L的6-BA、0.08mg/L的KT、0.1mg/L的IAA、20～25g/L的蔗糖的MS培養(yǎng)基作為初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基，pH值5.8-6.0。

作為優(yōu)選，所述暗培養(yǎng)在20～25℃下培養(yǎng)。所述光培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)以及生根培養(yǎng)均優(yōu)選在20～25℃、光照強(qiáng)度1500～2000lx，光照時(shí)間14h/d下培養(yǎng)。

暗培養(yǎng)一般培養(yǎng)20～35d后，根據(jù)愈傷組織或芽的誘導(dǎo)分化情況將培養(yǎng)所得的愈傷組織或芽分別轉(zhuǎn)接到原培養(yǎng)基上進(jìn)行光培養(yǎng)；在增殖培養(yǎng)過(guò)程中，一般培養(yǎng)30d；而在生根培養(yǎng)中，一般培養(yǎng)1-2周。

本方法以6種苦苣苔植物的葉片和(或)葉柄為外植體材料，利用本發(fā)明組織培養(yǎng)技術(shù)和原理，經(jīng)過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)、分化及叢生芽增殖和生根的過(guò)程，快速獲得多痕報(bào)春苣苔、武宣報(bào)春苣苔、永福報(bào)春苣苔、疏脈半蒴苣苔、藥用報(bào)春苣苔、豬耳朵6種苦苣苔科植物無(wú)菌苗，其中愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)90％以上，分化率達(dá)100％，增殖系數(shù)約50～120，生根率達(dá)100％。各階段的效果數(shù)據(jù)均顯著高于現(xiàn)有技術(shù)中相關(guān)苦苣苔科植物組織培養(yǎng)方法。

由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明選擇特定的初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基，利用組織培養(yǎng)技術(shù)，通過(guò)一種新途徑獲得了多痕報(bào)春苣苔、武宣報(bào)春苣苔、永福報(bào)春苣苔、疏脈半蒴苣苔、藥用報(bào)春苣苔、豬耳朵等多種苦苣苔科植物的無(wú)菌苗，建立了穩(wěn)定、高效的組培快繁體系。

附圖說(shuō)明

圖1所示為多痕報(bào)春苣苔愈傷組織誘導(dǎo)及分化圖；

圖2所示為永福報(bào)苣苔春愈傷組織形成及分化圖；

圖3所示為藥用報(bào)春苣苔愈傷組織形成及分化圖；

圖4所示為豬耳朵愈傷組織形成及分化圖；

圖5所示為疏脈半蒴苣苔愈傷組織形成及分化圖；

圖6所示為武宣報(bào)春苣苔愈傷組織形成及分化圖；

圖7所示為多痕報(bào)春苣苔叢生芽增殖圖；

圖8所示為永福報(bào)春苣苔叢生芽增殖圖；

圖9所示為藥用報(bào)春苣苔叢生芽增殖及芽苗生根圖；

圖10所示為豬耳朵叢生芽增殖圖；

圖11所示為疏脈半蒴苣苔叢生芽增殖圖；

圖12所示為武宣報(bào)春苣苔叢生芽增殖圖；

圖13所示為多痕報(bào)春苣苔芽苗生根圖；

圖14所示為永福報(bào)春苣苔芽苗生根圖；

圖15所示為豬耳朵芽苗生根圖；

圖16所示為疏脈半蒴苣苔芽苗生根圖；

圖17所示為武宣報(bào)春苣苔芽苗生根圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明實(shí)施例公開(kāi)了一種苦苣苔科植物組織培養(yǎng)方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類(lèi)似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明所述組織培養(yǎng)方法已通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的組織培養(yǎng)方法進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

以下就本發(fā)明所提供的一種苦苣苔科植物組織培養(yǎng)方法做進(jìn)一步說(shuō)明。

實(shí)施例1：本發(fā)明所述苦苣苔科植物組織培養(yǎng)方法

外植體滅菌：

取研究用健康苦苣苔植株(多痕報(bào)春苣苔、武宣報(bào)春苣苔、永福報(bào)春苣苔、疏脈半蒴苣苔、藥用報(bào)春苣苔、豬耳朵)的葉片和葉柄，用自來(lái)水沖洗干凈后，移入超凈工作臺(tái)，用75％酒精浸泡30～60s，無(wú)菌水清洗2次，然后用0.1％HgCl₂(加2滴TWeen-20)溶液處理5min，無(wú)菌水清洗1次；再用0.1％HgCl₂(加2滴TWeen-20)溶液處理一次，葉片2～3min，葉柄3～5min，無(wú)菌水清洗5～6次。將葉片或葉柄置于無(wú)菌濾紙上吸干水分，葉片剪成0.5cm×0.5cm大小的塊，葉柄切成0.5～1.0cm長(zhǎng)的小段，待用。

愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化：

將已滅菌并處理好的葉片，接種于初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度20～25℃，先進(jìn)行暗培養(yǎng)，待愈傷長(zhǎng)出后進(jìn)行光培養(yǎng)(光照強(qiáng)度1500～2000lx，光照時(shí)間14h/d)。所用培養(yǎng)基為：(1)MS+TDZ 0.04mg/L+2,4-D 0.2～0.8mg/L+NAA 0.1～0.3mg/L，用于多痕報(bào)春苣苔、永福報(bào)春苣苔、藥用報(bào)春苣苔、豬耳朵的初代誘導(dǎo)培養(yǎng)；(2)MS+6-BA 0.8mg/L+KT 0.08mg/L+IAA 0.1mg/L，用于疏脈半蒴苣苔和武宣報(bào)春苣苔的初代誘導(dǎo)培養(yǎng)。其中培養(yǎng)基的蔗糖含量為20～25g/L，pH為5.8～6.0。

暗培養(yǎng)20～35d后，根據(jù)愈傷組織或芽的誘導(dǎo)分化情況將培養(yǎng)所得的愈傷組織或芽分別轉(zhuǎn)接到原培養(yǎng)基上進(jìn)行光培養(yǎng)，各苦苣苔誘導(dǎo)分化情況見(jiàn)圖1-6。

增殖培養(yǎng)：

將初代培養(yǎng)所得的芽塊分割成每塊帶1～2個(gè)芽的小塊，轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度20～25℃，光照強(qiáng)度1500～2000lx，光照時(shí)間14h/d。所用培養(yǎng)基為：MS+TDZ 0.01mg/L+6-BA 0.4mg/L+NAA 0.05mg/L+CH 200mg/L，pH為5.8～6.0。約30d后，每個(gè)瓶?jī)?nèi)的有效苗(長(zhǎng)出3～4片葉，葉綠而平展，生長(zhǎng)正常的小苗)數(shù)均達(dá)30～40株，各苦苣苔叢生芽增殖情況情況見(jiàn)圖7-12。

生根培養(yǎng)：

將上述培養(yǎng)所得的無(wú)菌健壯有效苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度20～25℃，光照強(qiáng)度1500～2000lx，光照時(shí)間14h/d。所用培養(yǎng)基為：1/2MS+IBA 0.2mg/L+IAA 0.1mg/L，培養(yǎng)基糖含量為20g/L，pH為6.0～6.2。培養(yǎng)1～2周后，無(wú)菌芽苗開(kāi)始生根，獲得完整無(wú)菌苗，各苦苣苔生根情況見(jiàn)圖13-17。

實(shí)施例2：組織培養(yǎng)試驗(yàn)

試驗(yàn)對(duì)象：多痕報(bào)春苣苔、武宣報(bào)春苣苔、永福報(bào)春苣苔、疏脈半蒴苣苔、藥用報(bào)春苣苔、豬耳朵；

外植體：葉片和葉柄；

結(jié)果見(jiàn)表1。

表1

由表1結(jié)果可知，相比較現(xiàn)有專(zhuān)利的愈傷誘導(dǎo)率、不定芽分化率、叢生芽增殖系數(shù)以及生根率，本發(fā)明在各方面均達(dá)到了更優(yōu)的效果，特別是叢生芽增殖系數(shù)是極其顯著的高于當(dāng)前各專(zhuān)利技術(shù)中的效果。

以上所述只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利的保護(hù)范圍。