一種疏脈半蒴苣苔的離體保存方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及疏脈半蒴苣苔的離體保存方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 疏脈半蒴苣苔是苦苣苔科半蒴苣苔屬植物，分布于廣西、貴州南部和云南東南部。 生于海拔260-1600米山谷林下石上，生長(zhǎng)環(huán)境惡劣，自然界種子細(xì)小繁殖困難，在引種栽 培時(shí)較難成活，給種質(zhì)保存與利用帶來較大的困難，因此找出一種種質(zhì)資源保護(hù)的有效新 途徑，對(duì)疏脈半蒴苣苔資源的修復(fù)和再生，防止流失、退化和滅絕，保障資源的可持續(xù)利用 具有重要意義。而組織培養(yǎng)技術(shù)為如何妥善保存稀有的種質(zhì)資源提供了最便捷、穩(wěn)定的手 段。
[0003]目前暫無對(duì)于疏脈半蒴苣苔相關(guān)研宄，因此對(duì)疏脈半蒴苣苔離體保存的研宄具有 十分重要的意義。
[0004] 目前如何妥善保存稀有的種質(zhì)資源已成為一個(gè)急需解決的問題，而組織培養(yǎng)為離 體種質(zhì)保存提供了最便捷、穩(wěn)定的手段。
[0005]組織培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)是培養(yǎng)基及其培養(yǎng)條件，同一屬不同種的植物其培養(yǎng)條件也 不盡相同，因此，對(duì)同一個(gè)屬的不同種的植物組織培養(yǎng)條件的研宄也十分必要。
[0006]目前對(duì)于疏脈半蒴苣苔離體保存的研宄還比較少，申請(qǐng)人在公開號(hào)為CN 104041412 A的中國(guó)發(fā)明專利"一種貴州半蒴苣苔的組織培養(yǎng)快速繁殖方法"中公開了利用 組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖貴州半蒴苣苔的方法，但是并沒有公開貴州半蒴苣苔是如何進(jìn)行保 存的，另外申請(qǐng)人還在公開號(hào)為CN103651127A的中國(guó)發(fā)明專利"一種弄崗唇柱苣苔的離體 保存方法"一文中公開了對(duì)弄崗唇柱苣苔的離體保存時(shí)將生長(zhǎng)健壯的弄崗唇柱苣苔試管苗 單芽切下接種到最佳保存培養(yǎng)基上保存300d，但是并沒有公開此最佳保存培養(yǎng)基的具體配 比，而對(duì)于離體保存來說，其保存培養(yǎng)基的配比是其保存能否成功的一個(gè)重要條件，因此， 對(duì)其保存培養(yǎng)基的研宄和公開具有十分重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對(duì)目前存在的問題，本發(fā)明提供一種疏脈半蒴苣苔的離體保存方法，利用組織 培養(yǎng)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行離體繁殖，通過采用合適的保存培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行離體保存，不僅可以有 效挽救瀕危的疏脈半蒴苣苔物種，使之成為可再生資源，還可以為疏脈半蒴苣苔種植提供 優(yōu)良一致種苗的技術(shù)和室內(nèi)離體保存提供技術(shù)支持。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如 下技術(shù)方案：
[0008]-種疏脈半蒴苣苔的離體保存方法，包括如下步驟：
[0009] (1)外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)取野外采集的疏脈半蒴苣苔的頂芽作為外植體，在70 %乙醇 中浸泡30~45s，無菌水沖洗2~3次，投入0. 1 %升汞（添加2 %吐溫-20) 8min，再用無 菌水沖洗2~3次，切割為0. 5~1.0 cm長(zhǎng)接種在接種培養(yǎng)基上，培養(yǎng)8~15天，頂芽分化 形成嫩黃綠色叢生芽；所述培養(yǎng)基的pH值為5. 8,培養(yǎng)溫度為23~26°C，光照強(qiáng)度1400~ 20001x，光照時(shí)間為10~12h/d;
[0010] (2)叢生芽壯苗生根培養(yǎng)經(jīng)20~35d，叢生芽長(zhǎng)至2~3cm，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基培 養(yǎng)1個(gè)月后，長(zhǎng)成具根和4~6片葉的試管苗；所述培養(yǎng)基的溫度為23~26°C，光照強(qiáng)度 2000~28001x，光照時(shí)間為10~12h/d;
[0011] (3)試管苗離體保存將由叢生芽分化產(chǎn)生的具有4~6片葉的試管苗，接種到保存 培養(yǎng)基進(jìn)行離體保存，所述的培養(yǎng)基溫度為20± 1°C，光照強(qiáng)度1400~20001x，光照時(shí)間為 8~IOhAL
[0012] 步驟（1)中所述的接種培養(yǎng)基為：MS+6-BA0. 5 ~I. 5mg/l+IAA0. 5mg/l+KT0. 3mg/ 1+蔗糖2. 5%~3%和+瓊脂0? 4%~0? 45%。
[0013] 步驟（2)中所述的壯苗生根培養(yǎng)基為：1/2MS+IBA1. 0~I. 5mg/l+6-BA0. 5mg/ 1+AC0. 5% + 蔗糖 2. 5%~3% + 瓊脂 0? 4%~0? 45%。
[0014] 步驟（3)中所述的保存培養(yǎng)基為1/21^+???3331.011^/1+4〇).5%+蔗糖2.5%~ 3%+瓊脂 0.38 ~0.48%。
[0015] 本發(fā)明的有益效果：
[0016] 利用本發(fā)明快繁方法可在短期內(nèi)提供大量疏脈半蒴苣苔的優(yōu)質(zhì)種苗，得到的種苗 健壯、成活率高，利用本發(fā)明離體保存方法可以使疏脈半蒴苣苔種質(zhì)資源得到長(zhǎng)期保存，有 效解決了疏脈半蒴苣苔種質(zhì)資源保存及規(guī)?；鐔栴}。
【附圖說明】
[0017]圖1表示本發(fā)明光強(qiáng)對(duì)疏脈半蒴苣苔離體保存的影響。
[0018] 其中，橫坐標(biāo)表示光強(qiáng)（Ix)，縱坐標(biāo)表示保存天數(shù)（d)。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0020] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0021] 一種疏脈半蒴苣苔屬離體保存方法，通過以下方法實(shí)現(xiàn)：
[0022] -、疏脈半蒴苣苔經(jīng)快速繁殖得試管苗：
[0023]1、供試材料
[0024]疏脈半蒴苣苔 Hemiboea cavaleriei var. paucinervis W. T. Wang et Z. Y. Li 頂 芽。
[0025] 2、外植體的消毒處理
[0026] 將選擇的頂芽，在70%乙醇中浸泡30~45s，無菌水沖洗2~3次，投入0. 1%升 汞（添加2%吐溫-20) 8min，再用無菌水沖洗2~3次。
[0027] 3、外植體誘導(dǎo)
[0028] 將采集到的疏脈半蒴苣苔頂芽滅菌后切割為0. 5~I.Ocm長(zhǎng)的小段，按自然生長(zhǎng) 順序接種在培養(yǎng)基（MS+6-BA0. 5 ~I. 5mg/l+NAA0. 5mg/l+KT0. 3mg/l+蔗糖 2. 5%~3%和 + 瓊脂0. 4%~0. 45% )上，培養(yǎng)8~15天，頂芽分化形成叢生芽，叢生芽可切割重復(fù)培養(yǎng)。 所述培養(yǎng)基的pH值為5. 8,培養(yǎng)溫度為23~26°C，光照強(qiáng)度14000~20001x，光照時(shí)間為 10 ~12h/d〇
[0029] 4、叢生芽壯苗生根
[0030] 疏脈半蒴苣苔增殖速度30~45d平均可達(dá)1 : 4~6倍。上一步驟中頂芽培養(yǎng)天 14d左右，可得到大量叢生芽（70%以上），又經(jīng)過20~30d的培養(yǎng)可以得到高約2~3cm 芽體，轉(zhuǎn)入壯苗生根培養(yǎng)基（1/2MS+IAA1. Omg/1+ACO. 5% +蔗糖2. 5%~3% +瓊脂0? 4%~ 0. 45% )，培養(yǎng)基的溫度為23~26°C，光照強(qiáng)度2000~28001x，光照時(shí)間為10~12h/d ; 培養(yǎng)一個(gè)月左右，試管苗可進(jìn)行移栽。整個(gè)周期為2. 5~3. 5個(gè)月。
[0031] 6、試管苗移栽
[0032] 當(dāng)試管苗至少具有4~6片伸展葉，根系正常，健康，高度為6cm左右時(shí)，即可出瓶 移栽，先要經(jīng)室內(nèi)煉苗，出瓶時(shí)不能折傷葉片和根尖，清除根系上的培養(yǎng)基，分株種植，種植 基質(zhì)為石灰?guī)r：珍珠巖：泥炭土=3 : 3 : 4,基質(zhì)需經(jīng)過高溫高壓滅菌，蓋上透光率60% 的黑色遮陰網(wǎng)以保持較低光強(qiáng)，2d澆水1次以保持濕潤(rùn)。栽后放在大棚內(nèi)，隱蔽度為70 %， 棚內(nèi)溫度控制在20~26°C，注意保濕。約20d試管苗長(zhǎng)出新根，揭開遮陰網(wǎng)，單株移栽入 盆，盆土（河沙：草炭土=1 : 3)。試管苗移栽不宜太深，移栽的成活率可達(dá)96%。
[0033] 二、取上述所得疏脈半蒴苣苔試管苗進(jìn)行離體保存
[0034] 選擇上述具有4~6片葉疏脈半蒴苣苔試管苗為試驗(yàn)材料進(jìn)行離體保存。
[0035] 下面對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)基類型、溫度、光強(qiáng)、生長(zhǎng)抑制劑的篩選，保存天數(shù)均以試管苗 存活率為60 %進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
[0036] 1、培養(yǎng)基對(duì)疏脈半蒴苣苔離體保存的影響
[0037] 將試驗(yàn)材料接種到試驗(yàn)設(shè)計(jì)MS、1/2MS、1/4MS三種培養(yǎng)基上，接種10瓶，每瓶5株 單芽；培養(yǎng)基中2. 5~3. 0 %蔗糖和0. 38~0. 48 %的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5. 8,培養(yǎng)溫 度25±1°C，光強(qiáng)16001x，光照12~14h/d;結(jié)果表明，疏脈半蒴苣苔在MS培養(yǎng)基上保存時(shí) 間最長(zhǎng)，考慮到成本問題，本發(fā)明采用1/2MS為基本培養(yǎng)基。
[0038] 表1培養(yǎng)基對(duì)疏脈半蒴苣苔離體保存時(shí)間的影響
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種疏脈半蒴苣苔的離體保存方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)：取野外采集的疏脈半蒴苣苔的頂芽作為外植體，在70%乙醇中 浸泡30~45s，無菌水沖洗2~3次，投入添加2 %吐溫-20的0. 1 %升汞中8min，再用無 菌水沖洗2~3次，切割為0. 5~I.Ocm長(zhǎng)接種在接種培養(yǎng)基上，培養(yǎng)8~15d，頂芽分化 形成嫩黃綠色叢生芽；所述培養(yǎng)基的pH值為5. 8,培養(yǎng)溫度為23~26°C，光照強(qiáng)度1400~ 20001x，光照時(shí)間為10~12h/d; (2) 叢生芽壯苗生根培養(yǎng)：經(jīng)20~35d，叢生芽長(zhǎng)至2~3cm，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基培養(yǎng)1個(gè) 月后，長(zhǎng)成具根和4~6片葉的試管苗；所述培養(yǎng)基的溫度為23~26°C，光照強(qiáng)度2000~ 28001x，光照時(shí)間為10~12h/d; (3) 試管苗離體保存：將由叢生芽分化產(chǎn)生的具有4~6片葉的試管苗，接種到保存培 養(yǎng)基進(jìn)行離體保存，培養(yǎng)溫度為20±1°C，光照強(qiáng)度1400~20001x，光照時(shí)間為8~10小 時(shí)/天。
2. 如權(quán)利要求1所述的疏脈半蒴苣苔的離體保存方法，其特征在于，步驟（1)中所述的 誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+6-BA0? 5 ~I. 5mg/l+IAA0? 5mg/l+KT0? 3mg/l+蔗糖 2. 5%~3% + 瓊 脂 0.4%~0.45%。
3. 如權(quán)利要求1所述的疏脈半蒴苣苔的離體保存方法，其特征在于，步驟（2)中所述的 壯苗生根培養(yǎng)基為：1/2MS+IBA1. 0 ~I. 5mg/l+6-BA0. 5mg/l+AC0. 5% + 蔗糖 2. 5%~3% + 瓊脂 0.4%~0.45%。
4. 如權(quán)利要求1所述的疏脈半蒴苣苔的離體保存方法，其特征在于，步驟（3)中所述 的保存培養(yǎng)基為1/21^+???333 1.〇11^/1+4(：0.5%+蔗糖2.5%~3%+瓊脂0.38%~ 0? 48%〇
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種疏脈半蒴苣苔的離體保存方法，包括如下步驟：(1)取疏脈半蒴苣苔頂芽進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)得叢生芽；(2)將誘導(dǎo)得到的叢生芽進(jìn)行壯苗生根得到具有4～6片葉的試管苗；(3)將具有4～6片葉的試管苗接種到保存培養(yǎng)基進(jìn)行離體保存。本發(fā)明保存培養(yǎng)基為1/2MS+PPP3331.0mg/l+AC0.5％+蔗糖2.5％～3％+瓊脂0.38％～0.48％。培養(yǎng)基溫度為20±1℃，光照強(qiáng)度1400～2000lx，光照時(shí)間為8～10h/d。利用本發(fā)明快繁方法可在短期內(nèi)提供大量疏脈半蒴苣苔的優(yōu)質(zhì)種苗，得到的種苗健壯、成活率高，利用本發(fā)明離體保存方法可以使疏脈半蒴苣苔種質(zhì)資源得到長(zhǎng)期保存，有效解決了疏脈半蒴苣苔種質(zhì)資源保存及規(guī)?；鐔栴}。
【IPC分類】A01H4-00
【公開號(hào)】CN104756864
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410739915
【發(fā)明人】李翠, 韋瑩, 郭曉云, 張占江, 繆劍華, 趙以民, 韋坤華, 李林軒, 呂惠珍, 王一諾, 王曉峰
【申請(qǐng)人】廣西壯族自治區(qū)藥用植物園
【公開日】2015年7月8日
【申請(qǐng)日】2014年12月9日