一種錦繡杜鵑與大字杜鵑雜交胚的繁育方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種錦繡杜鵑與大字杜鵑雜交胚的繁育方法，包括：1）初代培養(yǎng)，取錦繡杜鵑與大字杜鵑雜交種胚，在WPM培養(yǎng)基上培養(yǎng)120天，萌發(fā)出的幼苗；2）繼代培養(yǎng)，取初代培養(yǎng)基中萌發(fā)出的幼苗，接入Read培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，隔40天轉(zhuǎn)瓶一次；3）生根培養(yǎng)，選取生長(zhǎng)健壯的單苗，接入到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。本發(fā)明錦繡杜鵑與大字杜鵑雜交胚的繁育方法，對(duì)未成熟的雜交胚進(jìn)行初代培養(yǎng)萌發(fā)形成的苗，該苗經(jīng)過(guò)增殖培養(yǎng)后得到的芽苗，然后接入到生根培養(yǎng)基中成功的進(jìn)行了生根培養(yǎng)，可以大大提高錦繡杜鵑與大字杜鵑雜交胚的萌發(fā)率，促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)，縮短育種周期，具有很好的實(shí)用性和工業(yè)化前景。
【專利說(shuō)明】一種錦繡杜鵑與大字杜鵑雜交胚的繁育方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物繁育【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種錦繡杜鵑與大字杜鵑雜交胚的繁育 方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 杜鵑花是杜鵑花科杜鵑屬的植物，具有很高的觀賞、食用和藥用價(jià)值。中國(guó)約有杜 鵑花542種，是世界杜鵑花分布中心，但是大多優(yōu)良野生杜鵑仍然隱匿于山間，我國(guó)的杜鵑 花園藝栽培品種總數(shù)不到300種。國(guó)外杜鵑花雜交育種工作起步較早，截至2004年，已登記 的杜鵑花新品種達(dá)2. 8萬(wàn)個(gè)，已培育出了耐寒、大花、早花、晚花和香花品種。國(guó)內(nèi)杜鵑花育 種工作起步較晚，開(kāi)始于20世紀(jì)80年代，截至2004年，只登記了 34個(gè)品種。關(guān)于杜鵑資源 的應(yīng)用與研究，尤其是新品種選育方面，我國(guó)的研究基礎(chǔ)相當(dāng)薄弱，僅有張長(zhǎng)芹等進(jìn)行了報(bào) 道。錦繡杜鵑（R. Pulchrum)是杜鵑花科半常綠灌木，花期4-5月份，花大色艷，耐熱耐寒性 較好，產(chǎn)我國(guó)長(zhǎng)江南部，分布區(qū)域較為廣泛而且在園林中被廣為應(yīng)用的一種杜鵑花。大字杜 匿$ (R. schlippenbachi)是杜醇花科落葉灌木，葉紙質(zhì)全緣，大小不等的五片葉呈"大"字形 集生枝頂，春季可觀大花，秋季葉變艷麗紅色，異常美觀，分布于我國(guó)東北，耐寒性極強(qiáng)，是 一種重要的園林觀賞瀕危種。研究人員為獲得一些春季即可觀艷麗的大花又能秋季觀賞美 麗的色葉，耐熱又耐寒可以在我國(guó)廣泛種植的雜交新品種，豐富杜鵑花的應(yīng)用資源，往往會(huì) 進(jìn)行杜鵑遠(yuǎn)緣雜交，例如以錦繡杜鵑做母本，以大字杜鵑做父本進(jìn)行雜交，獲得新品種。但 是，杜鵑遠(yuǎn)緣雜交存在著受精后障礙，主要表現(xiàn)為雜交胚胎的敗育，種子無(wú)法萌發(fā)和后代白 化苗等，這一狀況阻礙了我國(guó)杜鵑雜交育種的進(jìn)程，在國(guó)內(nèi)外，對(duì)于杜鵑花雜交胚拯救的研 究還鮮有報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 發(fā)明目的：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種錦繡杜鵑與 大字杜鵑雜交胚的繁育方法，以錦繡杜鵑做母本，以大字杜鵑做父本進(jìn)行雜交，對(duì)雜交胚運(yùn) 用組培的方法進(jìn)行胚拯救，以提高雜交胚萌發(fā)率，縮短育種周期。
[0004] 技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0005] -種錦繡杜鵑與大字杜鵑雜交胚的繁育方法，包括以下步驟：
[0006] 1)初代培養(yǎng)
[0007] 取錦繡杜鵑與大字杜鵑雜交種胚，在WPM培養(yǎng)基上培養(yǎng)120天，部分雜交胚萌發(fā) 形成幼苗，部分雜交胚脫分化，形成愈傷組織，培養(yǎng)條件為：光照12h/d，光照強(qiáng)度16001x， 溫度25±0. 5°C ;其中，在WPM培養(yǎng)基中添加有50mg/L GA3、30g/L蔗糖和8g/L瓊脂，pH = 5. 0 ；
[0008] 2)繼代培養(yǎng)
[0009] 取初代培養(yǎng)基中萌發(fā)出的幼苗，接入繼代增殖培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)，隔40天轉(zhuǎn)瓶 一次；在繼代增殖培養(yǎng)基基中加入：1〇?50g/L蔗糖，5?15mg/L2iP，0. 01?0? 20mg/L NAA，0?0. 80% (質(zhì)量百分比）AC，8g/L瓊脂；培養(yǎng)條件為：光照12h/d，光照強(qiáng)度16001x， 溫度25 ±0. 5°C ;其中，繼代增殖培養(yǎng)基選自MS、Anderson、Read和WPM，pH = 5. 0 ;
[0010] 3)生根培養(yǎng)
[0011] 選取生長(zhǎng)健壯的單苗，接入到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基的基本 培養(yǎng)基為1/2WPM，添加有10?30g/L蔗糖，瓊脂8g/L，pH = 5. 0,光照12h/d，光照強(qiáng)度 16001x，溫度 25±0. 5°C。
[0012] 步驟1)中，所述的錦繡杜鵑與大字杜鵑雜交種胚由以下方法制備：于授粉3個(gè)月 后采收蒴果，刮去蒴果表面的絨毛，置于超凈工作臺(tái)上，用75%乙醇消毒30s，無(wú)菌水沖洗3 遍，再用10% NaClO消毒15min，無(wú)菌水沖洗5遍，瞭干用解剖刀切開(kāi)取種胚即可。
[0013] 步驟2)中，繼代增殖培養(yǎng)基優(yōu)選為Read培養(yǎng)基。
[0014] 步驟2)中，繼代增殖培養(yǎng)基優(yōu)選加入20?30g/L蔗糖。
[0015] 步驟2)中，繼代增殖培養(yǎng)基優(yōu)選加入10?12mg/L2ip，0. 5mg/L NAA，0. 17? 0. 3% ACo
[0016] 步驟3)中，在所述生根培養(yǎng)基中優(yōu)選添加有10g/L蔗糖。
[0017] 步驟3)中，培養(yǎng)40天后，即能生根。
[0018] 有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明錦繡杜鵑與大字杜鵑雜交胚的繁育方法，對(duì) 未成熟的雜交胚進(jìn)行初代培養(yǎng)萌發(fā)形成的苗，該苗經(jīng)過(guò)增殖培養(yǎng)后得到的芽苗，然后接入 到生根培養(yǎng)基中成功的進(jìn)行了生根培養(yǎng)，可以大大提高錦繡杜鵑與大字杜鵑雜交胚的萌發(fā) 率，促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)，縮短育種周期，具有很好的實(shí)用性和工業(yè)化前景。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1是雜交幼苗增殖率復(fù)合極差圖；
[0020] 圖2是雜交幼苗增殖系數(shù)復(fù)合極差圖；
[0021] 圖3是雜交胚愈傷組織芽誘導(dǎo)率復(fù)合極差圖；
[0022] 圖4是雜交胚愈傷組織芽誘導(dǎo)系數(shù)復(fù)合極差圖。

【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0024] 以下實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)材料為：以南京本地的錦繡杜鵑為母本，以廬山地區(qū) 采集的大字杜鵑花粉為父本進(jìn)行雜交，授粉3個(gè)月后，取雜交蒴果，剝胚。
[0025] 實(shí)施例1
[0026] -種錦繡杜醇與大字杜醇雜交胚的繁育方法，包括：未成熟的雜交胚在初代培養(yǎng) 基中培養(yǎng)，初代培養(yǎng)后萌發(fā)形成的苗轉(zhuǎn)入繼代增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)增殖培養(yǎng)后得到的 芽苗接入到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。
[0027] 1)初代培養(yǎng)
[0028] 于授粉3個(gè)月后采收蒴果，刮去蒴果表面的絨毛，置于超凈工作臺(tái)上，用75%乙醇 消毒30s，無(wú)菌水沖洗3遍，再用10% NaClO消毒15min，無(wú)菌水沖洗5遍，瞭干用解剖刀切 開(kāi)取種胚，在WPM培養(yǎng)基上培養(yǎng)120天，其中，在WPM培養(yǎng)基中添加有50mg/L GA3、30g/L蔗 糖和8g/L瓊脂，pH = 5. 0。培養(yǎng)條件為：光照12h/d，光照強(qiáng)度16001x，溫度25±0. 5°C。 培養(yǎng)120天后統(tǒng)計(jì)雜交胚萌發(fā)率、出苗率和出愈率；萌發(fā)率=萌發(fā)的數(shù)量八接種的總數(shù) 量-污染數(shù)）X 100%，結(jié)果為50. 1%;出苗率=直接萌發(fā)成苗的/萌發(fā)的總數(shù)X 100%，結(jié) 果為37.8% ;出愈率=直接萌發(fā)成愈傷的/萌發(fā)的總數(shù)X100%，結(jié)果為12. 3%。
[0029] 2)繼代培養(yǎng)
[0030] 1、雜交苗的繼代增殖培養(yǎng)基的篩選
[0031] 取等量的初代培養(yǎng)基中萌發(fā)出的幼苗，分別接入MS、Anderson、Read、WPM4種不同 基本培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，隔40天轉(zhuǎn)瓶一次。培養(yǎng)條件為：光照12h/d，光照強(qiáng)度16001x，溫度 25±0.5°C。其中，每種培養(yǎng)基中均加入：10. 00mg/L2iP，30g/L蔗糖，8g/L瓊脂，pH = 5.0。 培養(yǎng)40天后統(tǒng)計(jì)增殖率與增殖系數(shù)，結(jié)果如表1所示。增殖率=發(fā)生增殖的苗數(shù)八接入 苗數(shù)-死亡數(shù)）X 100% ;增殖系數(shù)=總苗數(shù)八接入苗數(shù)-死亡數(shù)），下同。
[0032] 表1雜交幼苗增殖培養(yǎng)基本培養(yǎng)基篩選統(tǒng)計(jì)（三次重復(fù)）

【權(quán)利要求】
1. 一種錦繡杜鵑與大字杜鵑雜交胚的繁育方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 初代培養(yǎng) 取錦繡杜鵑與大字杜鵑雜交種胚，在WPM培養(yǎng)基上培養(yǎng)120天，部分雜交胚萌發(fā)形成 幼苗，部分雜交胚脫分化，形成愈傷組織，培養(yǎng)條件為：光照12h/d，光照強(qiáng)度16001x，溫度 25±0. 5°C ;其中，在WPM培養(yǎng)基中添加有50mg/L GA3、30g/L蔗糖和8g/L瓊脂，pH=5. 0 ; 2) 繼代培養(yǎng) 取初代培養(yǎng)基中萌發(fā)出的幼苗，接入繼代增殖培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)，隔40天轉(zhuǎn)瓶 一次，直至長(zhǎng)出健壯單苗；在繼代增殖培養(yǎng)基基中加入：l(T50g/L蔗糖，5~15mg/L 2iP， 0. 01?0. 20mg/L NAA，(T〇. 80%AC，8g/L瓊脂；培養(yǎng)條件為：光照12h/d，光照強(qiáng)度16001x，溫 度25±0.51：;其中，繼代增殖培養(yǎng)基選自]^、411(16^〇11、1^3(1和'^]\1，口11=5.0; 3) 生根培養(yǎng) 選取生長(zhǎng)健壯的單苗，接入到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基的基本培養(yǎng)基 為1/2WPM，添加有l(wèi)(T30g/L蔗糖，瓊脂8g/L，pH=5.0,光照12h/d，光照強(qiáng)度16001x，溫度 25±0. 5°C。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的錦繡杜鵑與大字杜鵑雜交胚的繁育方法，其特征在于：步 驟1)中，所述的錦繡杜鵑與大字杜鵑雜交種胚由以下方法制備：于授粉3個(gè)月后采收蒴 果，刮去蒴果表面的絨毛，置于超凈工作臺(tái)上，用75%乙醇消毒30s，無(wú)菌水沖洗3遍，再用 10%NaC10消毒15min,無(wú)菌水沖洗5遍,晾干用解剖刀切開(kāi)取種胚即可。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的錦繡杜鵑與大字杜鵑雜交胚的繁育方法，其特征在于：步驟 2)中，繼代增殖培養(yǎng)基為Read培養(yǎng)基。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的錦繡杜鵑與大字杜鵑雜交胚的繁育方法，其特征在于：步驟 2)中，繼代增殖培養(yǎng)基加入2(T30g/L蔗糖。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的錦繡杜鵑與大字杜鵑雜交胚的繁育方法，其特征在于：步驟 2) 中，繼代增殖培養(yǎng)基加入 l(Tl2mg/L 2ip，0. 5mg/L NAA，0. 17?0? 3% AC。
6. 根據(jù)權(quán)利要求I所述的錦繡杜鵑與大字杜鵑雜交胚的繁育方法，其特征在于：步驟 3) 中，在所述生根培養(yǎng)基中添加有10g/L蔗糖。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的錦繡杜鵑與大字杜鵑雜交胚的繁育方法，其特征在于：步驟 3)中，培養(yǎng)40天后，即能生根。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK104303999SQ201410432155
【公開(kāi)日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年8月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月27日
【發(fā)明者】耿興敏, 徐雁南, 楊君凱, 吳影倩, 王良桂 申請(qǐng)人:南京林業(yè)大學(xué)