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雜交鵝掌楸體胚發(fā)生同步化控制方法

文檔序號:353214閱讀:540來源:國知局
專利名稱:雜交鵝掌楸體胚發(fā)生同步化控制方法
技術領域
本發(fā)明涉及林業(yè)中的種苗繁殖生物技術領域,具體涉及一種雜交鵝掌楸體胚發(fā)生 同步化控制方法。
背景技術
木蘭科鵝掌楸屬(Liriodendron)樹種在自然界僅存兩個種,即北美鵝掌楸 (L. tulipifera Linn.)和鵝掌楸(L. chinense (Hemse.) Sarg),現(xiàn)存資源十分稀少,是我國 二級珍惜瀕危保護樹種。鵝掌楸具有生長迅速,干形直,木材用途廣,葉和花觀賞價值高等 特點,特別是南京林業(yè)大學葉培忠教授等人利用中國馬褂木與北美鵝掌楸雜交試驗成功獲 得雜交鵝掌楸(Liriodendron chinense XL. tulipifera),具有明顯的雜種優(yōu)勢,其生長速 度快,抗性強,樹姿優(yōu)美,花色美麗,葉形獨特,病蟲害少,材質紋理細膩,易加工,是集荒山 造林、工業(yè)用材、園林觀賞、綠化等多種用途于一身的優(yōu)良樹種,市場前景廣闊。目前雜交鵝掌楸主要通過人工雜交的有性繁殖及扦插、嫁接等傳統(tǒng)方法進行繁 殖。但雜交制種效率低、種子量少,F(xiàn)l代的種子發(fā)芽率很低,同時由于扦插生根難(季孔庶, 2005),而嫁接繁殖系數又低,很大程度上限制了優(yōu)良雜種的快速繁殖和利用,因此以傳統(tǒng) 的繁殖方式育苗,速度緩慢,優(yōu)良種苗數量遠遠供不應求。有學者報導過雜交鵝掌楸植物組 織培養(yǎng)途徑進行快速繁殖的一些研究(劉根林,2000 ;陳金慧等,2002 ;蔣澤平等,2004 ;蔡 桁等,2005 ;田敏等,2006),但均未見生產性應用。相對于傳統(tǒng)的育苗方式,體細胞胚胎發(fā)生 具有數量多、速度快、結構完整、再生率高等優(yōu)點。陳金慧等于2003年利用固體培養(yǎng)基培養(yǎng) 雜交鵝掌楸未成熟胚,成功誘導了雜交鵝掌楸體細胞胚胎發(fā)生,使雜交鵝掌楸的快速繁育 體系取得了重大進展,并成功進入工廠化生產育苗,在很大程度上緩解了市場供需矛盾,但 雜交鵝掌楸種苗的供應仍然不能滿足市場的需求。植株再生無疑為解決這種供需矛盾提供了一種有效方案,并且一個成熟的體胚發(fā) 生懸浮體系對進行植物體細胞雜交、遺傳轉化、植物種質資源的超低溫保存以及對植物體 胚發(fā)育等方面的研究提供了極大的便利。同時,懸浮培養(yǎng)中同步化的實現(xiàn),是利用生物反應 器建立規(guī)?;囵B(yǎng)體系的基礎,同時也是研究體胚發(fā)生分子機理的理想平臺,因此實現(xiàn)懸 浮培養(yǎng)中體胚發(fā)生的同步化控制顯得尤為重要。培養(yǎng)同步分裂的細胞群,可以在人工的控制下獲得具有同樣代謝活性和功能的細 胞所組成的大群體,為獲得同步形態(tài)發(fā)生的胚狀體奠定基礎。體胚的同步化是指促使所有 培養(yǎng)的細胞或發(fā)育中的細胞團塊進入同一個分裂時期,只有同步化了細胞才可能成批地產 出成熟胚胎。因此控制體胚的同步發(fā)生要從控制細胞的同步分裂開始,目前控制細胞同步 分裂的常用方法主要是化學誘導和物理選擇。大多時候單一的同步化控制方法并不能取得 最佳效果,這就需要將兩種或多種方法綜合應用。根據所選外植體的生物性狀及生理生化 特點采用不同的方法組合或試劑組合達到最佳的同步誘導效果。關于鵝掌楸屬體胚發(fā)生的懸浮培養(yǎng)體系,僅有kott Merkle等(1991)報道過北 美鵝掌楸的體胚發(fā)生,但未見大規(guī)模生產的報道。目前,通過對雜交鵝掌楸的胚胎發(fā)生過程進行的掃描電鏡觀察以及對這一過程中ATP酶活性進行的超微細胞化學定位,對于非胚性 細胞向胚性細胞的轉化,胚性細胞的進一步發(fā)育分化,以及體細胞胚胎發(fā)生中胚性細胞的 起源及發(fā)育已有了初步的了解,同時對體胚系統(tǒng)的遺傳穩(wěn)定性的分析表明,雜交鵝掌楸體 細胞胚胎再生體系具有長時間保持旺盛的體胚發(fā)生能力(陳金慧等,2006)。陳志等Q007) 也通過對影響懸浮培養(yǎng)的一些物理因素如搖床轉速、細胞起始密度,繼代周期,懸浮物的選 擇等的研究初步建立了雜交鵝掌楸胚性愈傷懸浮培養(yǎng)體系,但高頻、同步的雜交鵝掌楸體 胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)體系的建立還未見報道。

發(fā)明內容
發(fā)明目的針對現(xiàn)有技術中存在的不足,本發(fā)明的目的是提供一種雜交鵝掌楸體 胚發(fā)生同步化控制方法,為滿足雜交鵝掌楸的大規(guī)模生產提供有效的方法。技術方案為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的,本發(fā)明采用的技術方案如下本發(fā)明的雜交鵝掌楸體胚發(fā)生同步化控制方法,以懸浮培養(yǎng)條件下的胚性細胞為 起始材料,在液體培養(yǎng)基上進行擴大培養(yǎng)并使細胞分散,采用物理過篩和密度梯度離心結 合的方法使植物細胞群大小均一,同時調節(jié)激素的種類和用量誘導植物細胞胚性,調整液 體培養(yǎng)物密度分級轉接到含有適量ABA的培養(yǎng)基上,加大滲透壓,促使體胚高頻同步發(fā)生, 最后獲得生長狀態(tài)正常一致的再生植株。具體實施包括以下步驟(1)雜交鵝掌楸愈傷細胞懸浮系擴大培養(yǎng)在無菌條件下,按接種量為2g/50ml將保存在固體培養(yǎng)基上的胚性愈傷組織接入 液體誘導培養(yǎng)基I,控溫25 士 2°C,在轉速為95r ^irT1的搖床上暗培養(yǎng)2 3周,獲得初始 材料;其中,每周繼代一次,繼代按體積比為1 9將培養(yǎng)物接入液體誘導培養(yǎng)基I,液體誘 導培養(yǎng)基 I 的配方為=MS 培養(yǎng)基,2mg · L、,4-D,0. 2mg · Γ^-ΒΑ, 500mg · L^1LH, 30g · Γ1 蔗 糖;(2)激素誘導和滲透壓調節(jié)提高轉化率按體積比為1 9將步驟(1)獲得的初始材料接入液體誘導培養(yǎng)基II,控溫 25士2°C,在轉速為95r ^irT1的搖床上暗培養(yǎng)7 9d,獲得懸浮培養(yǎng)物;其中,液體誘導培 養(yǎng)基 II 的配方為=MS 培養(yǎng)基,0. 2mg · ^2,4-0,0. 5mg · L^1KT, 200mg · L^1CH, 50g · Γ1 蔗糖;(3)機械過篩和密度梯度離心物理篩選將步驟( 懸浮培養(yǎng)物經孔徑為400 μ m、280 μ m、150 μ m、38 μ m各層網篩,收集各 層細胞,將各層細胞分別鋪于濾紙上,然后置于半固體成熟培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 5周后獲得同 步的成熟胚;其中,半固體成熟培養(yǎng)基的配方為MS培養(yǎng)基,2 IOmg · L^1ABA, 2g · L^1AC, IOOmg · L-1CH, 40g · L-1 蔗糖,5g · L-1 瓊脂;(4)植株再生將成熟胚轉移至生長培養(yǎng)基上促進萌發(fā)生長,將萌發(fā)的小植株轉至植株生長培養(yǎng) 基上培養(yǎng)2 7周,即獲得再生植株;其中,生長培養(yǎng)基配方為MS培養(yǎng)基,Img · L-1ABA, 30g · L-1蔗糖,6. 5g · L-1瓊脂;植株生長培養(yǎng)基配方為=MS培養(yǎng)基,30g · L-1蔗糖,6. 5g · L-1 瓊脂;培養(yǎng)條件均為25士2°C,16h(光照)/8h(黑暗)培養(yǎng)。步驟(3)中,對38 150 μ m的細胞團還可繼續(xù)采用18% Ficoll密度梯度離心或 多次沖洗直接離心培養(yǎng)液的方法,去掉管狀空細胞和松散的細胞團,取密實的細胞團,調整密度至500 600細胞團/mL轉移至覆濾紙的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng),添加2 IOmg · L^1ABA 促進體胚的成熟并抑制異常胚的產生。同時,經過篩離心后的細胞團也可以在液體成熟培 養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)兩周左右,再進行二次過篩,取150 280 μ m的胚性細胞團轉半固體成熟 培養(yǎng)基培養(yǎng),其中,液體成熟培養(yǎng)基配方為MS培養(yǎng)基,2 IOmg · L^1ABA, IOOmg · L^1CH, 40g · L-1 蔗糖;步驟(3)中,150 400μπι的細胞團多為胚狀體或連體多胚,其中150 280 μ m的細胞團一般為較早期的球狀原胚,可直接轉移至覆濾紙的固體培養(yǎng)基上,并加 IOmg · L-1ABA,同時使用60 90mg · Γ1蔗糖提高滲透壓培養(yǎng)。280 400 μ m的細胞團多 為較大的胚狀體或連體多胚,這兩層細胞均可如上直接轉至半固體成熟培養(yǎng)基培養(yǎng),也可 以在液體環(huán)境下使用低濃度的2,4-D,誘導產生更多次生胚,即所謂的二次培養(yǎng),然后轉半 固體成熟培養(yǎng)基培養(yǎng);步驟(3)中,大于400 μ m的細胞團體胚發(fā)生方式多由愈傷團產生,在懸浮系中所 占比重較大,可以轉半固體成熟培養(yǎng)基,如(2)所述方法調節(jié)體胚后期同步化發(fā)育,也可以 轉回誘導培養(yǎng)基I繼續(xù)增殖,實現(xiàn)循環(huán)培養(yǎng);對于38 150 μ m的細胞團,從雜交鵝掌楸的胚性細胞團轉移至半固體成熟培養(yǎng) 基培養(yǎng)到形成再生植株僅需7 8周,中途不用更換培養(yǎng)基,成苗后用植株生長培養(yǎng)基進行 壯苗;而對于150 400 μ m的細胞團和大于400 μ m的細胞團,各階段完成發(fā)育所需時間較 長,約為11 13周,其間需更換新鮮培養(yǎng)基,且后期需采用滲透壓調節(jié)的方法,逐步降滲, 同時降低ABA含量至2mg ·廠1左右,促進體胚正常萌發(fā)。以上雜交鵝掌楸體胚發(fā)育同步化控制的完整技術路線參見圖1。有益效果經上述同步化調控后,在球形胚階段的經分級篩選的雜交鵝掌楸體胚 發(fā)育同步率達90%左右;而在心形及魚雷形胚階段的分級處理同步化率在室溫條件下為 40%左右,經過適當時間的冷藏會使同步化的比率有所提高;由球形胚階段的材料發(fā)育而 來的成熟體胚向再生植株轉化率可達70% 80%。此外,由于該同步化調控方法將材料進 行了分級處理,根據各層的狀態(tài)特點制定了不同的下游操作流程,在實驗和生產實踐中可 因材而用,如38 150 μ m材料可直接成苗不需轉換培養(yǎng)基,且能觀察到胚胎的早期發(fā)育狀 態(tài),因此可主要用來進行相關實驗的材料觀察和迅速成苗用;150 400 μ m的材料經過降 滲處理和二次培養(yǎng)可用于擴大生產使用;大于400 μ m的細胞可用于循環(huán)培養(yǎng)增殖保種用 等。分級處理的同步化調控方法降低了細胞間的養(yǎng)分競爭,刺激更多胚性細胞的生成,同時 也方便了人工針對不同狀態(tài)材料的統(tǒng)一調控,因此,不僅充分利用了植物材料,提高了同步 性,而且縮短了培養(yǎng)時間,提高了體胚發(fā)生的頻率和正常植株的轉化率,降低了人工操作的 難度,為實驗研究和工廠的進一步規(guī)?;a打下了良好的基礎。


圖1為雜交鵝掌楸體胚發(fā)育同步化控制的完整技術路線。其中虛線框內調控方法 為機動選擇方法。圖2是本發(fā)明雜交鵝掌楸體胚發(fā)生同步化控制方法主要工藝示意圖。其中,A為液 體誘導培養(yǎng)基I培養(yǎng)的胚性懸浮細胞系;B為液體誘導培養(yǎng)基II培養(yǎng)的胚性懸浮細胞系;C 為將懸浮培養(yǎng)物經孔徑為400 μ m、280 μ m、150 μ m、38 μ m各層網篩,收集各層細胞;D為將5各層培養(yǎng)物鋪于直徑9cm的濾紙上,然后置于半固體成熟培養(yǎng)基上培養(yǎng);Dl為細胞團顆粒 直徑介于38 150 μ m、D2為細胞團顆粒直徑介于150 280 μ m、D3為細胞團顆粒直徑介 于觀0 400 μ m、D4為細胞團顆粒直徑大于400 μ m ;E為不同層次經2 5周后獲得同步 的成熟胚;F為將成熟胚轉移至不覆濾紙的生長培養(yǎng)基上促進萌發(fā)生長;G為將萌發(fā)的小植 株轉至植株生長培養(yǎng)基上,并換大容器培養(yǎng);H為收集38 150 μ m的胚性細胞于液體誘導 培養(yǎng)基II中培養(yǎng)10 15d ;I為再次過篩,收集150 280 μ m的球形胚狀體J為將收集 到的球形胚狀體轉入液體成熟培養(yǎng)基中培養(yǎng),兩周后得到同步的成熟胚;K為將大于150 400 μ m的各層重新置于液體誘導培養(yǎng)基II中繼續(xù)培養(yǎng);L為將大于400 μ m的細胞團重新 置于液體誘導培養(yǎng)基I中完成循環(huán)培養(yǎng)。圖3是分級培養(yǎng)前的材料預培養(yǎng)狀態(tài)照片。其中,A為液體誘導培養(yǎng)基I培養(yǎng)七 天胚性細胞懸浮系;B為經液體誘導培養(yǎng)基II處理的懸浮細胞。圖4是38 150 μ m細胞層經Ficoll密度梯度離心處理的體胚發(fā)育狀況顯微照 片。其中,A為通過篩選所得38 150 μ m的懸浮培養(yǎng)細胞;B為經18% Ficoll液密度梯 度離心分離后所得培養(yǎng)細胞;C為在液體成熟培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 IOd后發(fā)育為球形胚;D為 在液體成熟培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)7 IOd后發(fā)育為心形及魚雷形胚,圖中比例尺均為200 μ m。圖5是過篩分級培養(yǎng)各層培養(yǎng)物的生長發(fā)育狀況照片和轉移至固體培養(yǎng)前液體 培養(yǎng)物的顯微照片。其中,第一橫排為顯微照片,第二橫排為照片;從左至右每列為對應一 組,A組為> 400 μ m培養(yǎng)物的生長發(fā)育狀況照片和轉移至固體培養(yǎng)前液體培養(yǎng)物的顯微照 片,B組為280 400 μ m培養(yǎng)物的生長發(fā)育狀況照片和轉移至固體培養(yǎng)前液體培養(yǎng)物的顯 微照片;C組為150 280 μ m培養(yǎng)物的生長發(fā)育狀況照片和轉移至固體培養(yǎng)前液體培養(yǎng)物 的顯微照片;D組為38 150 μ m培養(yǎng)物的生長發(fā)育狀況照片和轉移至固體培養(yǎng)前液體培 養(yǎng)物的顯微照片。圖6是轉固體培養(yǎng)不同接種密度下體胚的生長發(fā)育狀況照片。其中,第一橫排接 種量為300細胞團/mL,第二橫排接種量為600細胞團/mL ;從左至右每列為對應一組,A組 為培養(yǎng)2周,B組為培養(yǎng)4周;C組為培養(yǎng)7周。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例來對本發(fā)明做進一步的解釋。實驗材料據于施季森、陳金慧等發(fā)明專利(ZL 02 1 12947. 7)所描述的雜交鵝 掌楸體胚誘導方法,于2006-2009年重新雜交并取鵝掌楸雜交組合的未成熟胚誘導體胚, 并通過多次篩選獲得的具有穩(wěn)定發(fā)生能力的胚性細胞。誘導培養(yǎng)基I 配方為:MS, 2mg · L-12,4_D,0. 2mg · L-16_BA,500mg · L^1LH, 30g · L-1 蔗糖。誘導培養(yǎng)基II 配方為:MS,0. 2mg · L_12,4-D,0. 5mg · L^1KT, 200mg · L^1CH, 50g · L-1 蔗糖。半固體成熟培養(yǎng)基配方為MS,5mg· L^1ABA, 2mg · L^1AC, 200mg · L^1CH, 40g · L—1 蔗 糖,Sg.L—1瓊脂。植株生長培養(yǎng)基配方為MS,30g · L—1蔗糖,6. 5g · L—1瓊脂。MS培養(yǎng)基成分單位mg · Γ1
NH4NO3 :1650KNO3 :1900CaCl2 · 2H20 :440MgSO4 · 7H20 370KH2PO4 170KI :0. 83H3BO3 :6. 2MnSO4 · 4H20 :22. 3ZnSO4 · 7H20 :8. 6Na2MnO4 · 2H20 :0. 25CuSO4 · 5H20 :0. 025CoCl2 · 6H20 :0. 025FeSO4 · 7H20 (27. 8) +Na2-EDTA · 2H20 (37. 3)肌醇100煙酸0.5鹽酸吡哆醇(維生素B6) :0. 5鹽酸硫胺素(維生素Bi) 0. 1甘氨酸2實施例1一種雜交鵝掌楸體胚發(fā)生同步化控制方法,如附圖2所示的操作路線,包括以下 步驟(1)取2g左右保存在固體培養(yǎng)基上的胚性愈傷組織接種于250ml三角瓶中,加 50ml誘導培養(yǎng)基I,放置于搖床上,95r ^mirT1,暗培養(yǎng),隔周以體積比為1 9培養(yǎng)物與誘 導培養(yǎng)基I繼代,連續(xù)繼代2 3周,獲得初始材料,將初始材料充分搖散,呈均勻顆粒狀, 如圖3A所示。(2)將步驟(1)處理的初始材料倒于50ml量筒中,自動沉降!Mins,倒去上清,以 體積比為1 9培養(yǎng)物與培養(yǎng)基比例加入誘導培養(yǎng)基II,移入250ml三角瓶中,同步驟(1) 培養(yǎng)條件,繼續(xù)培養(yǎng)1周,此時得到的為分級處理前材料,如圖3B所示。(3)將步驟(2)培養(yǎng)的材料倒于從上至下網孔逐漸減小的疊垛網篩上,用MS培養(yǎng) 基沖洗2 3次;將各層網篩分別反扣于漏斗上,用少量MS將網層上的材料分別沖洗收集 起來。對38 150 μ m的材料用移液器取一滴在細胞計數器上,觀察密度,添加培養(yǎng)基,調 整材料密度至300 600細胞團/mL ;對于精確實驗要求的材料,可將該層多次沖洗或置于 用與培養(yǎng)液等滲的3%的蔗糖水溶液為溶劑,18%的Ficoll密度梯度離心液中,200g轉速 離心lOmin,收集位于Ficoll層的細胞,用液體培養(yǎng)基MS沖洗后重新在液體成熟培養(yǎng)基中 培養(yǎng),如圖4所示;大于150 μ m的材料可視情況涂布于半固體成熟培養(yǎng)基上,各層生長狀況 如圖5所示,也可以繼續(xù)分別置于誘導培養(yǎng)基I和II中繼續(xù)培養(yǎng),實現(xiàn)二次培養(yǎng)和循環(huán)培 養(yǎng);(4)用移液器將步驟(3)中調整密度后的懸浮細胞均勻涂布在墊脫脂棉的濾紙 上,9cm濾紙,約加1 anl,待多余液體吸干后,將培養(yǎng)物連同濾紙一起轉至半固體成熟培養(yǎng)基上(IOcm培養(yǎng)皿每皿約50ml培養(yǎng)基),封口,25士2°C,黑暗培養(yǎng);約四周后,體胚長成 子葉胚狀,轉25士2°C,1 (光照)/8h (黑暗),繼續(xù)培養(yǎng)2 3周,長成小植株,圖6為不同 接種密度情況下植株的生長狀況;將生長整齊的小植株轉至植株生長培養(yǎng)基上,改用培養(yǎng)瓶,25士2°C,1 (光 照)/ (黑暗)培養(yǎng)4 5周,待長出側根可轉入苗圃培養(yǎng)。實施例2按照實施例1的方法操作步驟⑴、(2),步驟(3)還可以采用以下操作對38 150 μ m的細胞團還可繼續(xù)采用18 % Ficoll密度梯度離心或多次沖洗 直接離心培養(yǎng)液的方法,去掉管狀空細胞和松散的細胞團,取密實的細胞團,調整密度至 500 600細胞團/mL轉移至覆濾紙的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng),添加2 IOmg -L^1ABA促進體胚 的成熟并抑制異常胚的產生。同時,經過篩離心后的細胞團也可以在液體成熟培養(yǎng)基中繼 續(xù)培養(yǎng)兩周左右,再進行二次過篩,取150 280 μ m的胚性細胞團轉半固體成熟培養(yǎng)基培 養(yǎng),其中,液體成熟培養(yǎng)基配方為=MS培養(yǎng)基,2 IOmg · L-1ABA, IOOmg · L^1CH, 40g · L-1蔗 糖;150 400 μ m的細胞團多為胚狀體或連體多胚,其中150 280 μ m的細胞團一般 為較早期的球狀原胚,可直接轉移至覆濾紙的固體培養(yǎng)基上,并加IOmg · L-1ABA,同時使用 60 90mg -L"1蔗糖提高滲透壓培養(yǎng)。280 400 μ m的細胞團多為較大的胚狀體或連體多 胚,這兩層細胞均可如上直接轉至半固體成熟培養(yǎng)基培養(yǎng),也可以在液體環(huán)境下使用低濃 度的2,4-D,誘導產生更多次生胚,即所謂的二次培養(yǎng),然后轉半固體成熟培養(yǎng)基培養(yǎng);大于400 μ m的細胞團體胚發(fā)生方式多由愈傷團產生,在懸浮系中所占比重較大, 可以轉半固體成熟培養(yǎng)基,如(2)所述方法調節(jié)體胚后期同步化發(fā)育,也可以轉回誘導培 養(yǎng)基I繼續(xù)增殖,實現(xiàn)循環(huán)培養(yǎng);對于38 150 μ m的細胞團,從雜交鵝掌楸的胚性細胞團轉移至半固體成熟培養(yǎng) 基培養(yǎng)到形成再生植株僅需7 8周,中途不用更換培養(yǎng)基,成苗后用植株生長培養(yǎng)基進行 壯苗;而對于150 400 μ m的細胞團和大于400 μ m的細胞團,各階段完成發(fā)育所需時間較 長,約為11 13周,其間需更換新鮮培養(yǎng)基,且后期需采用滲透壓調節(jié)的方法,逐步降滲, 同時降低ABA含量至2mg ·廠1左右,促進體胚正常萌發(fā)。
權利要求
1.一種雜交鵝掌楸體胚發(fā)生同步化調控方法,其特征在于,包括以下步驟(1)在無菌條件下,按接種量為2g/50ml將保存在固體培養(yǎng)基上的胚性愈傷組織接入 液體誘導培養(yǎng)基I,增殖培養(yǎng),控溫25士2°C,在轉速為95r ^irT1的搖床上暗培養(yǎng)2 3周, 獲得初始材料;其中,每周繼代一次,繼代按體積比為1 9將培養(yǎng)物接入液體誘導培養(yǎng)基 I,液體誘導培養(yǎng)基I的配方為=MS培養(yǎng)基,2mg · ^2,4-0,0. 2mg · Γ^-ΒΑ, 500mg · L^1LH, 30g · L-1 蔗糖;(2)按體積比為1 9將步驟⑴獲得的初始材料接入液體誘導培養(yǎng)基II,控溫 25士2°C,在轉速為95r ^irT1的搖床上暗培養(yǎng)7 9d,獲得懸浮培養(yǎng)物;其中,液體誘導培 養(yǎng)基 II 的配方為=MS 培養(yǎng)基,0. 2mg · ^2,4-0,0. 5mg · L^1KT, 200mg · L^1CH, 50g · Γ1 蔗糖;(3)將步驟( 懸浮培養(yǎng)物過孔徑40(^111、28(^111、15(^111、384 111網篩,并按不同孔 徑分層收集細胞,分別鋪于濾紙上,然后置于半固體成熟培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 5周后獲得同 步的成熟胚;其中,半固體成熟培養(yǎng)基的配方為MS培養(yǎng)基,2 IOmg · L^1ABA, 2g · L^1AC, IOOmg · L-1CH, 40g · L-1 蔗糖,5g · L-1 瓊脂;(4)將成熟胚轉移至生長培養(yǎng)基上促進萌發(fā)生長,將萌發(fā)的小植株轉至植株生長培養(yǎng) 基上培養(yǎng),即獲得再生植株;其中,生長培養(yǎng)基配方為MS培養(yǎng)基,Img · L1ABAdOg · Γ1蔗 糖,6. 5g · L-1瓊脂;植株生長培養(yǎng)基配方為=MS培養(yǎng)基,30g · L-1蔗糖,6. 5g · L-1瓊脂;培養(yǎng) 條件均為25士2°C,l^i (光照)/ (黑暗)培養(yǎng)。
2.根據權利要求1所述的雜交鵝掌楸體胚發(fā)生同步化控制方法,其特征在于步驟 (3)中,收集38 150 μ m的胚性細胞于液體誘導培養(yǎng)基II中培養(yǎng)10 15d,再次過篩, 收集150 280μπι的球形胚狀體,將收集到的球形胚狀體轉入液體成熟培養(yǎng)基中培養(yǎng),兩 周后得到同步的成熟胚。其中,液體成熟培養(yǎng)基的配方為MS培養(yǎng)基,2 IOmg · L-1ABA, IOOmg · L-1CHJOg · L-1 蔗糖。
3.根據權利要求1所述的雜交鵝掌楸體胚發(fā)生同步化控制方法,其特征在于步驟(3) 中,收集150 280 μ m和280 400 μ m的細胞團,分別將其轉至步驟3所述半固體成熟培 養(yǎng)基或進行步驟( 培養(yǎng)。
4.根據權利要求1所述的雜交鵝掌楸體胚發(fā)生同步化控制方法,其特征在于步驟(3) 中,將大于400μπι的細胞團按照步驟(1)繼續(xù)增殖,并依次按照步驟(2)、(3)和(4)操作, 實現(xiàn)循環(huán)培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雜交鵝掌楸體胚發(fā)生同步化調控方法。該方法利用生長激素調節(jié)機理,逐步降低2,4-D濃度,附加0.5mg·L-1KT誘導出較為均一的胚性細胞團,然后采用機械過篩的方法將胚性細胞團分級培養(yǎng),并根據細胞團大小和體胚發(fā)生方式的不同,選用不同的后續(xù)同步化控制方法。經上述同步化調控后,在球形胚階段的經分級篩選的雜交鵝掌楸體胚發(fā)育同步率達90%左右;而在心形及魚雷形胚階段的分級處理同步化率在室溫條件下為40%左右,經過適當時間的冷藏會使同步化的比率有所提高;由球形胚階段的材料發(fā)育而來的成熟體胚向再生植株轉化率可達70%~80%。
文檔編號A01H4/00GK102037896SQ201010298850
公開日2011年5月4日 申請日期2010年9月28日 優(yōu)先權日2010年9月28日
發(fā)明者施季森, 李婷婷, 陳金慧, 龍偉 申請人:南京林業(yè)大學
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