一種草魚抗細(xì)菌性敗血癥品系的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種草魚抗細(xì)菌性敗血癥品系的構(gòu)建方法：a）選擇親魚，對(duì)親魚進(jìn)行PIT電子標(biāo)記，待其性腺成熟后注射激素催熟，自然受精，自受精卵孵化至夏花、魚種培育、1齡魚、2齡魚培育均飼養(yǎng)在同一池塘中；b）分別在夏花和2齡魚階段用致病菌人工感染子代，感染后觀察19-23天，剩余個(gè)體作為抗病群體；c）采用親子鑒定方法對(duì)獲得的抗病群體進(jìn)行后裔鑒定，從親魚中挑選出抗病力強(qiáng)的親魚，第二年對(duì)獲得的抗病力強(qiáng)的親魚配組繁殖，建立草魚抗細(xì)菌性敗血癥品系。本發(fā)明的方法避免了環(huán)境效應(yīng)，能確保篩選所獲得的抗病親本是真正遺傳優(yōu)良的親本，保證了培育的抗病品系具備優(yōu)異的抗病能力，同時(shí)該方法更加易于操作，適用于大規(guī)模的抗病育種。
【專利說明】一種草魚抗細(xì)菌性敗血癥品系的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及水產(chǎn)遺傳育種領(lǐng)域，具體地說，涉及一種草魚抗細(xì)菌性敗血癥品系的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】 [0002]草魚是草食性魚類，也是我國(guó)優(yōu)良的傳統(tǒng)淡水漁業(yè)和淡水養(yǎng)殖的主要對(duì)象，草魚養(yǎng)殖在我國(guó)已有1700多年的歷史。2012年，我國(guó)草魚產(chǎn)量為444多萬(wàn)噸，占我國(guó)淡水養(yǎng)殖魚類總產(chǎn)量的20%(漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒，2012)，在世界淡水養(yǎng)殖魚類中產(chǎn)量排名第一位。但草魚易受病害的危害，包括寄生蟲、細(xì)菌、病毒等，每年給草魚養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]細(xì)菌性敗血癥也稱為細(xì)菌性出血病、爆發(fā)性出血病，最早發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)70年代末至80年代初,是由致病性嗜水氣單胞菌(A.引起的急性轉(zhuǎn)染病,從夏花魚種到成魚均可感染，嚴(yán)重地阻礙了草魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。為了控制這個(gè)疾病，已經(jīng)使用了藥物治療、接種疫苗等傳統(tǒng)的方法，但由于藥物和疫苗種類的數(shù)量有限，導(dǎo)致傳統(tǒng)的方法有其局限性。長(zhǎng)遠(yuǎn)來說，通過選育出抗病或抗逆性強(qiáng)的草魚新品種(系)來增強(qiáng)草魚抵抗疾病傳染的能力，這才是一種非常重要的途徑。
[0004]綜上所述，開展草魚抗細(xì)菌性敗血癥品種(系)選育是養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)進(jìn)一步發(fā)展需要解決的關(guān)鍵技術(shù)之一。
[0005]中國(guó)專利文獻(xiàn)CN201110292533.8，
【公開日】2012.04.11，公開了一種魚類新品系快速選育方法，包括以下步驟:a.親魚的選擇:在所有親魚中，選出活潑、遺傳性好、體重大于平均體重15~20%的親魚，作為進(jìn)行繁殖的親本；b.親本標(biāo)記:對(duì)每尾親本進(jìn)行個(gè)體標(biāo)記，每尾親本具有獨(dú)立的標(biāo)記號(hào)；c.構(gòu)建家系:親本性腺成熟后，對(duì)親本人工注射激素溶液，雌雄親本采用人工授精獲得受精卵，對(duì)所得受精卵分別單獨(dú)孵化、培育，建立家系；d.家系培育:每個(gè)家系都分別飼養(yǎng)，培育至40~50克時(shí)，不同家系中的每尾子代進(jìn)行個(gè)體標(biāo)記，每尾子代本具有獨(dú)立的標(biāo)記號(hào)，所有子代混養(yǎng)在同一個(gè)池塘中；e.確定優(yōu)勢(shì)親本組合:將親本子代培育至商品魚，比較各個(gè)家系中親本子代的生長(zhǎng)狀況，確定生長(zhǎng)狀況高于平均生長(zhǎng)狀況的家系為優(yōu)勢(shì)家系；根據(jù)各優(yōu)勢(shì)家系中子代的標(biāo)記號(hào)確定親本來源及親本標(biāo)記號(hào)建立新品系:第二年用優(yōu)勢(shì)家系中的親本繁殖，繁育的子代魚苗即為快速生長(zhǎng)新品系。通過采用以上技術(shù)方案，可在較短時(shí)間內(nèi)選育出生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)相對(duì)比較明顯的新品系，此項(xiàng)技術(shù)適用于四大家魚、鱘科魚類等性成熟時(shí)間比較長(zhǎng)的魚。然而，雖然該專利文獻(xiàn)公開了適用于性成熟時(shí)間比較長(zhǎng)的魚的新品系的繁殖方法，但是其僅僅公開了技術(shù)路線，并沒有公開特定魚類新品系的選育方法。另一方面，本專利申請(qǐng)的發(fā)明人認(rèn)為，品系選育過程中環(huán)境條件對(duì)選育效果影響較大，是不可忽略的，將家系分開培育在不同的環(huán)境下直到培育至40~50克時(shí)，才注射PIT電子標(biāo)記進(jìn)行同池養(yǎng)殖對(duì)生長(zhǎng)性狀進(jìn)行選育，并不能確保所得優(yōu)勢(shì)家系是遺傳優(yōu)良的家系，后續(xù)所確定的親本來源也并不一定就是基因最為優(yōu)良的親本。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種草魚抗細(xì)菌性敗血癥品系的構(gòu)
建方法。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
一種草魚抗細(xì)菌性敗血癥品系的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
a)選擇親魚，對(duì)親魚進(jìn)行標(biāo)記，待親魚性腺成熟后人工注射激素溶液催熟，自然受精獲得受精卵，自受精卵孵化至夏花、魚種培育、I齡魚、2齡魚培育均飼養(yǎng)在同一池塘中；
b)分別在夏花和2齡魚階段采用致病性嗜水氣單胞菌人工感染子代，感染后觀察19-23天，剩余個(gè)體作為抗病群體；
c)采用親子鑒定方法對(duì)步驟b)獲得的抗病群體進(jìn)行后裔鑒定，從親魚中挑選出抗病力強(qiáng)的親魚，第二年對(duì)獲得的抗病力強(qiáng)的親魚進(jìn)行配組繁殖，建立草魚抗細(xì)菌性敗血癥品系。
[0008]步驟a)所述的“對(duì)親魚進(jìn)行標(biāo)記”是對(duì)親魚進(jìn)行PIT電子標(biāo)記。
[0009]步驟a)所述的“自然受精”是將親魚放置在產(chǎn)卵池中，采用沖水的方式模擬自然環(huán)境，讓親魚進(jìn)行產(chǎn)卵受精。
[0010]步驟a)所述的激素是促黃體素釋放激素類似物L(fēng)RH-A和地歐酮DOM的混合物。
[0011]步驟b)中所述的人工感染的方法具體是每尾子代草魚注射0.1mL 3X106CFU/ml的致病性嗜水氣單胞菌菌液。
[0012]步驟b)中感染后觀察21天，剩余個(gè)體作為抗病群體。
[0013]本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于:本專利申請(qǐng)的發(fā)明人充分認(rèn)識(shí)到環(huán)境效應(yīng)對(duì)品種選育的重要影響，將分子標(biāo)記輔助育種與傳統(tǒng)選育方法相結(jié)合，在同一環(huán)境下人工感染致病菌，同時(shí)在養(yǎng)殖時(shí)從孵化到人工感染都在同一環(huán)境(同一池塘)下培育，然后采用親子鑒定的方法建立家系，從而能有效地減小環(huán)境的影響，避免了環(huán)境效應(yīng)，確保篩選的抗病親本是真正遺傳優(yōu)良的親本，保證了培育的抗病品系具備優(yōu)異的抗病能力。這與現(xiàn)有技術(shù)中先建立家系并培育在不同環(huán)境下，然后再進(jìn)行標(biāo)記和篩選的方法相比，效果更明顯。且本發(fā)明構(gòu)建抗病品系過程中，子代草魚為親魚自然受精獲得，也進(jìn)一步克服了人為等因素的影響。另外，本發(fā)明的方法中，致病菌感染濃度恰當(dāng)，子代草魚抗病群體篩選時(shí)間合理，標(biāo)記方法簡(jiǎn)單，在同一池塘飼養(yǎng)，均使得抗病品系的培育過程更加快捷，操作更簡(jiǎn)單，適用于有較大規(guī)模的良種場(chǎng)或國(guó)家良種基地進(jìn)行草魚的抗病育種。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面對(duì)本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說明。
[0015]實(shí)施例1
I)從國(guó)家級(jí)“四大家魚”原種場(chǎng)包括江蘇邗江長(zhǎng)江系家魚原種場(chǎng)、江西瑞昌長(zhǎng)江四大家魚原種場(chǎng)和湖北石首老河長(zhǎng)江四大家魚原種場(chǎng)收集原種120組草魚親魚。采用從廣東洪騰購(gòu)買的PIT電子標(biāo)記，給每尾親魚注射了電子標(biāo)記，掃描后獲得了一個(gè)標(biāo)記號(hào)，以便配對(duì)繁殖時(shí)識(shí)別親魚來源。另外剪取每條魚的鰭條。從中優(yōu)選出行動(dòng)活潑、遺傳性能好的親魚，50組作為備選親魚。經(jīng)過I年親魚培育挑選出20組性腺發(fā)育良好的親魚。性腺成熟后，人工注射激素溶液(促黃體素釋放激素類似物L(fēng)RH-A和地歐酮DOM的混合物，其使用劑量為L(zhǎng)RH-A2 5Pg/Kg+D0M 3mg/Kg)催熟。將所有繁殖親魚放置在產(chǎn)卵池中，采用沖水的方式模擬自然環(huán)境，讓其進(jìn)行產(chǎn)卵受精。自然受精后，自孵化至夏花、魚種培育、I齡魚、2齡魚培育，飼養(yǎng)在同一池塘中。
[0016]2 )夏花和2齡魚階段人工感染
①夏花生長(zhǎng)階段:按照每畝10萬(wàn)尾水花發(fā)塘，培育至夏花階段，隨機(jī)挑選4000尾，采用人工感染嗜水氣單胞菌，菌株感染濃度為3X106CFU/ml，每尾注射0.lmL，感染觀察21天后，剩余個(gè)體作為抗病群體。21天后,存活498尾,剪取每尾魚的鰭條組織固定于無(wú)水乙醇中。
[0017]②2齡魚階段:根據(jù)草魚細(xì)菌性敗血癥發(fā)病情況，在7月份隨機(jī)挑選1500尾草魚，采用人工感染嗜水氣單胞菌，菌株感染濃度為3X106CFU/ml，每尾注射0.lmL，感染觀察21天后，剩余個(gè)體作為抗病群體。21天后，存活315尾，剪取每尾魚的鰭條組織固定于無(wú)水乙醇中。
[0018]3)采用親子鑒定方法，對(duì)存活的498尾夏花和315尾2齡魚進(jìn)行微衛(wèi)星標(biāo)記遺傳分析(具體方法參考文獻(xiàn):Jianjun Fu, et al.Multiplex microsatellite PCR setsfor parentage assignment of grass carp {Ctenopharyngodon idella).Aquacultureinternational, 2013，21:1195-1207.)后，建立抗病家系25個(gè)，篩選出8組抗病力強(qiáng)的親魚作為備用親魚。然后第二年利用篩選出的8組抗病力強(qiáng)的親魚配組、育苗，建立草魚抗病品系。
[0019]4)將建立的抗病品系和野生群體的抗病力進(jìn)行比較，方法如下:隨機(jī)選取抗病品系和野生群體各600尾12月齡草魚，注射PIT電子標(biāo)記后每個(gè)群體平均分成三份，放養(yǎng)于3個(gè)塑料桶中，每個(gè)塑料桶400尾，暫養(yǎng)一周后，對(duì)1200尾草魚注射嗜水氣單胞菌，濃度為3X 105CFU/ml，觀察21天，記錄抗病品系與野生群體的存活率，結(jié)果見表1，發(fā)現(xiàn)抗病品系比野生群體的存活率提高了 17.4%。
[0020]表1抗病品系和野生群體的存活率比較
【權(quán)利要求】
1.一種草魚抗細(xì)菌性敗血癥品系的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟: a)選擇親魚，對(duì)親魚進(jìn)行標(biāo)記，待親魚性腺成熟后人工注射激素溶液催熟，自然受精獲得受精卵，自受精卵孵化至夏花、魚種培育、I齡魚、2齡魚培育均飼養(yǎng)在同一池塘中； b)分別在夏花和2齡魚階段采用致病性嗜水氣單胞菌人工感染子代，感染后觀察19-23天，剩余個(gè)體作為抗病群體； c)采用親子鑒定方法對(duì)步驟b)獲得的抗病群體進(jìn)行后裔鑒定，從親魚中挑選出抗病力強(qiáng)的親魚，第二年對(duì)獲得的抗病力強(qiáng)的親魚進(jìn)行配組繁殖，建立草魚抗細(xì)菌性敗血癥品系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a)所述的“對(duì)親魚進(jìn)行標(biāo)記”是對(duì)親魚進(jìn)行pit電子標(biāo)記。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a)所述的“自然受精”是將親魚放置在產(chǎn)卵池中，采用沖水的方式模擬自然環(huán)境，讓親魚進(jìn)行產(chǎn)卵受精。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a)所述的激素是促黃體素釋放激素類似物L(fēng)RH-A和地歐酮DOM的混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟b)中所述的人工感染具體是每尾草魚注射0.1mL 3X106CFU/ml的致病性嗜水氣單胞菌菌液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟b)中感染后觀察21天，剩余個(gè)體作為抗病群體。
【文檔編號(hào)】A01K67/027GK103947607SQ201410191557
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年5月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月8日
【發(fā)明者】沈玉幫, 李家樂, 傅建軍, 孫俊龍 申請(qǐng)人:上海海洋大學(xué)