三疣梭子蟹絲氨酸蛋白酶同源物基因的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的說是一種三疣梭子蟹絲氨酸蛋白酶同源物（PtSPH）基因的應(yīng)用。三疣梭子蟹絲氨酸蛋白酶同源物基因編碼蛋白的重組表達(dá)產(chǎn)物可作為保鮮劑、飼料添加劑、防腐劑或蛋白酶輔助藥物中制備的應(yīng)用?？梢詾檫M(jìn)一步研究三疣梭子蟹免疫防御機制提供基礎(chǔ)，并為三疣梭子蟹的病害防治和基因輔助選育提供參考。
【專利說明】三疣梭子蟹絲氨酸蛋白酶同源物基因的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的說是一種三疣梭子蟹絲氨酸蛋白酶同源 物（PtSPH)基因的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 三撫梭子蟹（Portunus trituberculatus)是我國重要的海水養(yǎng)殖品種，但隨著養(yǎng) 殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大以及養(yǎng)殖集約化程度的不斷提高，由細(xì)菌、真菌等引起的各種病害日趨 嚴(yán)重，給三疣梭子蟹養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失。深入開展三疣梭子蟹免疫防御機制相關(guān)研究，探 索免疫防治新途徑，是實現(xiàn)其健康養(yǎng)殖的可靠保障。
[0003] 絲氨酸蛋白酶（Serine protease, SP)是一類重要且分布廣泛的蛋白酶家族，其活 性中心包含由3個保守的氨基酸殘基(組氨酸、天冬氨酸和絲氨酸)組成的催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)。 絲氨酸蛋白酶同源物（Serine protease homolog，SPH)在氨基酸序列上與SP相似，但由 于一個或多個催化殘基的缺失或突變(通常是絲氨酸被甘氨酸取代）導(dǎo)致其明顯缺乏酰胺 酶活性。近年來的研究表明，SP和SPH大多是通過絲氨酸蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)參與多種免疫過 程，如血液凝集、抗菌肽的合成和酚氧化酶原激活系統(tǒng)介導(dǎo)的黑化反應(yīng)等。
[0004] 目前已在多個物種如果蠅、煙草天蛾、淡水螯蝦、斑節(jié)對蝦中鑒定出絲氨酸蛋白酶 同源物。研究認(rèn)為，絲氨酸蛋白酶同源物雖失去蛋白酶的催化功能，但可作為模式識別因子 或是SP輔助因子，參與節(jié)肢動物酚氧化酶原系統(tǒng)的激活和抗微生物應(yīng)答。例如，在煙草天 蛾中，SPH作為輔助因子協(xié)助絲氨酸蛋白酶水解酚氧化酶原；在斑節(jié)對蝦中，SPH能介導(dǎo)細(xì) 胞黏附并具有細(xì)菌結(jié)合和抑菌活性。
[0005] 到目前為止，關(guān)于三疣梭子蟹絲氨酸蛋白酶同源物的研究尚少。因此，研究三疣梭 子蟹絲氨酸蛋白酶同源物基因的重組表達(dá)與應(yīng)用的研究，將對研究三疣梭子蟹的免疫防御 機制和進(jìn)行病害防治具有重要的理論和實踐意義，同時將有助于開發(fā)天然輔助藥物用于人 類疾病的治療。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種三疣梭子蟹絲氨酸蛋白酶同源物PtSPH基因的應(yīng)用。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0008] -種三疣梭子蟹絲氨酸蛋白酶同源物PtSPH基因的應(yīng)用，三疣梭子蟹絲氨酸蛋白 酶同源物基因編碼蛋白的重組表達(dá)產(chǎn)物可作為保鮮劑、飼料添加劑、防腐劑或蛋白酶輔助 藥物的應(yīng)用。
[0009] 所述三疣梭子蟹絲氨酸蛋白酶同源物PtSPH基因編碼蛋白的重組表達(dá)產(chǎn)物能夠 特異性的結(jié)合革蘭氏陰性菌或真菌。所述革蘭氏陰性菌為溶藻弧菌，真菌為畢赤酵母。 [0010] 所述三疣梭子蟹絲氨酸蛋白酶同源物PtSPH基因編碼蛋白的重組表達(dá)產(chǎn)物，利用 帶有限制性酶切位點的引物P1和P2通過PCR擴(kuò)增三疣梭子蟹絲氨酸蛋白酶同源物基因編 碼區(qū)片段；再將pET30a載體與上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)BamHI和Xhol雙酶切，連接后轉(zhuǎn)化表 達(dá)菌株BL21 (DE3)-pLysS ;表達(dá)菌株進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，超聲波破碎處理菌體收獲重組蛋白，經(jīng) TALON柱純化、復(fù)性后得到具有活性的三疣梭子蟹Pt SPH編碼蛋白的重組表達(dá)產(chǎn)物。所述 P1 為 5' GGATCCCGCCAATCTCAGTTTGGGGAGTT3' ；P2 為 5' CTCGAGTTATTTACCACCAATTCTTACATC3 〇
[0011] 本發(fā)明所具有的優(yōu)點：
[0012] 本發(fā)明通過PCR技術(shù)擴(kuò)增編碼三疣梭子蟹絲氨酸蛋白酶同源物PtSPH成熟肽的基 因片段并將其克隆到PET30 (+)表達(dá)載體中，在大腸桿菌BL21 (DE3)-plysS實現(xiàn)體外重組表 達(dá)。重組蛋白PtSPH經(jīng)TALON柱純化和透析后，能夠結(jié)合革蘭氏陰性菌溶藻弧菌和真菌畢 赤酵母，當(dāng)重組蛋白PtSPH濃度為50 μ Μ時，對革蘭氏陰性菌溶藻弧菌和真菌畢赤酵母具有 顯著的結(jié)合活性。
[0013] 本發(fā)明基因及其重組蛋白主要在蛋白酶輔助藥物、飼料添加劑以及防腐劑和保鮮 劑生產(chǎn)中應(yīng)用，另外還可以為進(jìn)一步研究三疣梭子蟹免疫防御機制提供基礎(chǔ)，并為三疣梭 子蟹的病害防治和基因輔助選育提供參考。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1為本發(fā)明實例提供的純化的三疣梭子蟹絲氨酸蛋白酶同源物PtSPH編碼成熟 肽的基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖(其中，M :DNA marker，1 :成熟肽的基因擴(kuò)增產(chǎn)物)。
[0015] 圖2為本發(fā)明實例提供的誘導(dǎo)和純化的三疣梭子蟹絲氨酸蛋白酶同源物PtSPH重 組蛋白電泳圖(其中Μ :蛋白marker ;1 :未誘導(dǎo)菌體中表達(dá)的蛋白；2 :IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)的蛋 白；3 :純化的重組蛋白）。
[0016] 圖3為本發(fā)明實例提供的三疣梭子蟹絲氨酸蛋白酶同源物PtSPH重組蛋白對革蘭 氏陰性菌溶藻弧菌(A)和真菌畢赤酵母（B)的結(jié)合活性圖(其中Μ :蛋白marker，S :上清液， W:沖洗液，E :洗脫液)。

【具體實施方式】
[0017] 下面的實施例中將本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明不限于此。
[0018] 實施例1.
[0019] 三疣梭子蟹絲氨酸蛋白酶同源物PtSPH基因 Tryp_SPc催化結(jié)構(gòu)域重組蛋白的獲 得，具體操作如下：
[0020] 1.重組載體的構(gòu)建
[0021] 根據(jù)三疣梭子蟹絲氨酸蛋白酶同源物PtSPH的cDNA序列，設(shè)計含有限制性內(nèi)切酶 BamHI 和 Xhol 酶切位點的特異性弓丨物 P1 (5, GGATCCCGCCAATCTCAGTTTGGGGAGTT3,）和 P2 ( 5' CTCGAGTTATTTACCACCAATTCTTACATC3'），通過PCR技術(shù)擴(kuò)增編碼三疣梭子蟹絲氨酸蛋白 酶同源物PtSPH成熟肽的基因片段(參見圖1)，反應(yīng)在TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Model TP600 (Takara Bio Inc.)中進(jìn)行，反應(yīng)條件為：94°C 變性 3min;94°C 變性 45s，57°C 退火50s，72°C延伸lmin30s，30個循環(huán)；最后72°C延伸10min。將擴(kuò)增片段純化與回收，與 pMD19-T簡單載體連接（Takara)。轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Transl-Tl(TransGen)后篩選陽性克隆， 提取質(zhì)粒。使用BamHI和Xhol兩種酶酶切質(zhì)粒，用膠回收純化試劑盒對酶切產(chǎn)生的目的片 段純化回收；回收目的片段與經(jīng)BamHI和Xhol兩種酶酶切的表達(dá)載體pET30a連接，完成重 組載體的構(gòu)建。
[0022] 2.重組蛋白PtSPH的表達(dá)
[0023] 將構(gòu)建的重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3) -plysS，篩選陽性克隆并測序確認(rèn) 表達(dá)框的正確性。挑取單克隆，接種到200ml含卡那霉素（50 μ g/ml)的LB液體培養(yǎng)基 中，220rmp37°C振蕩培養(yǎng)至0.D.6(l(l=0.4-0.6。加入IPTG至終濃度為ImM誘導(dǎo)4小時后，在 4°C 4000rmp離心15分鐘，收集菌體，與-20°C凍存?zhèn)溆?。取lml菌液離心，棄去上清后，力口 入8(^1水和2(^1的蛋白上樣緩沖液（5倍稀釋)，10〇1：沸水中煮1〇1^11后離心，取上清， SDS-PAGE電泳檢測表達(dá)產(chǎn)物。
[0024] 3.重組蛋白PtSPH的純化與復(fù)性
[0025] 菌體在冰浴條件下用超聲波180W處理20-30min (每次2s，間隔2s)，離心去掉上 清，收集沉淀(含重組蛋白包涵體)。沉淀以8M的尿素溶解后，利用Clontech公司的TALON 柱純化重組產(chǎn)物。將純化的重組蛋白轉(zhuǎn)移到透析袋中，4°C條件下，在含有2mM還原谷胱苷 肽、0. 2mM氧化谷胱苷肽、ImM EDTA、50mM Tris-HCl、50mM NaCl、10%甘油和1%甘氨酸的及 梯度降低的尿素（611、4]?、31、21、1]\1、01〇的透析復(fù)性液（口!1=8.0)中透析，使重組蛋白復(fù)性， 最后在50mMTris-HCl (pH=8.0)的緩沖液透析2次，以除去溶液中其它成分。透析復(fù)性后 的重組蛋白經(jīng)PALL公司的Microsep Advance超濾離心濃縮管進(jìn)行濃縮，用碧云天公司的 BCA蛋白濃度測定試劑盒測得三疣梭子蟹絲氨酸蛋白酶同源物重組蛋白的濃度為2. 10mg/ ml (參見圖2)。
[0026] 三疣梭子蟹PtSPH基因為SEQ ID No. 1中所示的堿基序列。
[0027] 序列表 SEQ ID No. 1 為：
[0028] ggggagtagt gtttgagtgt tggtggcgta aggttctgtt actgcgtggt tccctcatca ctcggttagt gtggaggagg ctcaggttta gtacaagtcc tcccgaagac caat atg tct acc tta ggg tgg aga ate ctg eta ctg gtg gtg gtg gca agg get ctg cca gat ccc tct tee teg tee tea age agg gac agg aga caa gtg gac aca tea aat ctg teg gat gca gaa tta ett tgt egg ctg aca tct gca gta gac ggt ate aat gag aat tgt gac aca cct get tee aaa cct gac aca get gtg agt ggg aac tgc agg tgt get cct gee tgg cag tgc aag gat gac act agt cct agt gag ctg act gat ggt gga age ttc ctg aca caa gtg aat gtg ege act att ggc ate tct tgt cct aca cca gag gag gtg tgc tgc ttc aac att gat gee tct eta cag ccc caa act tta ccc ttc tct cca tct tgt gga aag ege aac tct caa gga ate gta acc aat ttt gtt gga ttt gag aat ege caa tct cag ttt ggg gag ttc cct tgg atg gca get gta atg aca tee cag aeg ttt gga ccg gac gca gca cct ctg tac ate tgt ggg gga tea etc ate cac age cag ata gtg ett act get gee cat tat atg caa gat aag aca gee agt gaa eta get gta aga ett gga gag tgg aac ttc agg gaa cag tea gaa tct gtg cca cac cag gag tat gga att caa gag gtg ttg ata cac ccc aaa tac gtc ggc acc gtc ttg gca tat gat gtg gee ett etc ate ett gac cag cca gca aca ett ggc cac act gtt gac acc ate tgc ctg cca cca cca aac tat gat ttc aga gac cac aca tgt gtt gtg tct ggg tgg ggc aaa gat atg ttc agt gag act ggt aaa ttc caa caa ate ctg aag tea att gat ctg cca ccg gtg gac cac aac tee tgt gag aga gca atg aga aca aca ege ctg ggc aca age ttc aac ctg cac gag agt ttc ttg tgt get gga gga gag gee ggc aag gat gee tgc gag ggt gat ggt ggc tea ccc ttg gee tec ttt aag tet act gat cct aat aaa tac tac cag get ggt gtg gtg tet tgg ggc att ggt tec ggc caa get ggc ttg cca gga gtt tac get gat gtc age aag get gtt cca tgg att aat acc att att cag gaa aaa ttt gga cat gat gta aga att ggt ggt aaa taa aattatttct tctctctact ctaatctacc aataatcatt tcccatgcca aagtcacatc caaattagga gttttgagga ttgcaacaaa caaactttca aaataaagat CtC&CC&t&t
[0029] (a)序列特征：
[0030] ?長度：1507bp，有效長度 571-1350
[0031] ?類型：堿基序列
[0032] 籲鏈型：單鏈
[0033] #拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)：線性
[0034] (b)分子類型：雙鏈DNA
[0035] (c)假設(shè)：否
[0036] (d)反義：否
[0037] (e)最初來源：三疣梭子蟹絲氨酸蛋白酶同源物
[0038] (f)特異性名稱：gene
[0039] 三疣梭子蟹PtSPH基因為SEQ ID No. 2中所示的氨基酸序列
[0040] 序列表 SEQ ID No. 2 為：
[0041] MSTLGWRILLLVVVARALPDPSSSSSSRDRRQVDTSNLSDAELLCRLTSAVDGINENCDTPA SKPDTA VSGNCRCAPAWQCKDDTSPSELTDGGSFLTQVNVRTIGISCPTPEEVCCFNIDASL QPQTLPFSPSCGKRNSQGIV TNFVGFENRQSQFGEFPWMAAVMTSQTFGPDAAPLYICGGSL IHSQIVLTAAHYMQDKTASELAVRLGEffNFREQS ESVPHQEYGIQEVLIHPKYVGTVLAYDV ALLILDQPATLGHTVDTICLPPPNYDFRDHTCVVSGffGKDMFSETGKF QQILKSIDLPPVDH NSCERAMRTTRLGTSFNLHESFLCAGGEAGKDACE⑶GGSPLACFKSTDPNKYYQAGVVSWG IGCGQAGLPGVYADVSKAVPffINTIIQEKFGHDVRIGGK
[0042] (a)序列特征：
[0043] ?長度：411bp，有效長度 153-411
[0044] ?類型：堿基序列
[0045] ?鏈型：單鏈
[0046] ?拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)：線性
[0047] (b)假設(shè)：否
[0048] (c)反義：否
[0049] (d)最初來源：三撫梭子蟹絲氨酸蛋白酶同源物
[0050] (e)特異性名稱：PRT
[0051] 其具有完整的編碼蛋白含有411個氨基酸，其中編碼序列的1-17個氨基酸為信號 肽，成熟肽包含394個氨基酸，預(yù)測的分子量為44. 44kDa，等電點為5. 07。成熟肽具有典型 的Tryp_SPc催化結(jié)構(gòu)域（259個氨基酸)，其催化結(jié)構(gòu)域包含保守的催化三聯(lián)體殘基，其中 第三個活性位點絲氨酸（Ser)被甘氨酸（Gly)取代。
[0052] 實施例2.
[0053] 三疣梭子蟹絲氨酸蛋白酶同源物PtSPH重組蛋白微生物結(jié)合試驗：
[0054] 1.重組蛋白及菌懸液的準(zhǔn)備：將上述實施例重組蛋白PtSPH溶于1XPBS緩沖液 (pH=7. 4)使蛋白濃度達(dá)到2. 0mg/ml，4°C備用。在無菌條件，挑取單克隆的溶藻弧菌將其接 種到TSB (胰蛋白胨大豆肉湯3%，NaCll%)培養(yǎng)基中，畢赤酵母種到Y(jié)PD (酵母提取物1%，胰 蛋白胨2%，葡萄糖2%)培養(yǎng)基中，而后于28°C和37°C振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。離心收集菌 體，加入37%的甲醛混勻，于37°C溫和震蕩lh以破壞細(xì)胞的蛋白酶活性。離心收集菌體，并 用1 XPBS緩沖液（pH=7. 4)懸浮菌體，制備成細(xì)菌懸浮液（3X 108CFU/ml)，4°C備用。
[0055] 2.重組蛋白PtSPH微生物結(jié)合活性檢測：在無菌的2ml離心管中分別加入 0. 5ml的菌懸液，實驗組加入0. 5ml2. Omg/ml上述實施例所得重組蛋白PtSPH，陰性對照組 (blank)加入0. 5ml50mMlXPBS溶液，總體積lml，4°C溫和搖動孵育40min。然后2000g4°C 離心5min，取出上清液并4°C保留備用；菌體沉淀用lXPBS(pH=7. 4)沖洗3次，沖洗液4°C 保留備用；最后菌體沉淀用1XSDS-PAGE上樣緩沖液洗脫，洗脫液4°C保留備用。上清液 (S)、沖洗液（W)和洗脫液（E)分別進(jìn)行15%SDS-PAGE電泳檢測。
[0056] 發(fā)現(xiàn)上述實施例重組蛋白PtSPH能夠結(jié)合革蘭氏陰性菌溶藻弧菌和真菌畢赤酵 母(參見圖3)，當(dāng)重組蛋白PtSPH濃度為50 μ Μ時，重組蛋白PtSPH對畢赤酵母的結(jié)合活性 比對溶藻弧菌的結(jié)合活性高。
[0057] 上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0001] SEQUENCE LISTING <no)中(1科學(xué) <12CI> 一"魏棱子蟹MM醴蛋|!1_闕疆__園謙|$用 --1 ur ^ i m --- 2 ' I 70*: ff<i i.i'iil I n v?*rs ?ηπ ;1 I <210> I <2I1> 1507 m2>腦 <2：t3> :：￡Λ 梭干蟹 II* 酸 a&_BS?J .工0> ^22I> im 〈Z22' (ΒΠ ). , (vm) 、.痛)> ] ggggaguigt gtt tgaglgt tggtggcgta aggticigtt actgrgtggf tccetmtca 60 rt '^ggr t agt giggnggngg i 貧 ri ginr?mgirr f rrcgcingor rant of gt v\ I 20 aed faggot g^agnatcrt gctactggtg fi^eictcuicc nj^otccctd ISO tcdcgicct caagcaggga caggci|iiiciu:i glggacacot coaatcigtc ggotgcagoa 240 UddUgte ggct.gaciiU* tgciiKtugdi： g^UHcui.ilK amatIglK^ cacaccl^ct 300 t.cci.mucctg <ir<ic<igcist gugig^iguac igcciggigig ciccigccig· gc?igih rc<mg 360 gat.g<ic<icta glcctagl?<ι gcig<iclgal liglggfmffd led.gac<ic<i <igigy<ilglg 120 at t g grat ci cl! g t rcuicciccri g1 gel gel i c?ia ciii iga1 gee 1^0 tctciacagc cccaaaciit acccltctcl cccilcitglg gficicigcgcaa clcicaagga 51(J uiUtgiigg cgccaaiclt: agt l igg^ga κ? iced igg 600 cil^gca^i: Lg UicJtgat:<Jic LCfigcitgl 11 κ H<·^- ^ c fig cat: c U: t ^IciCciUl^t G60 tcutccacag ccagatiigtg ettaclgetg cccattatal gc?uigiiti.mg 720 h e a g e c ? g t g a a c t a g € l t aa^ac 11 gga ^aglg^aac l t eagsganea ^teagaalct 780 ^t^ccacacc aggagtataa11caa?a^ gtgtlgatac ae.cccaaula cfitcggcacc 840 gt·:: tigKcat nlgatglffgc cc I leti：a 1 c ctt ^ncv.a.gi： ragcHacrict tggr.carac: i 900
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【權(quán)利要求】
1. 一種三疣梭子蟹絲氨酸蛋白酶同源物PtSPH基因的應(yīng)用，其特征在于：三疣梭子蟹 絲氨酸蛋白酶同源物基因編碼蛋白的重組表達(dá)產(chǎn)物可作為保鮮劑、飼料添加劑、防腐劑或 蛋白酶輔助藥物的應(yīng)用。
2. 按權(quán)利要求1所述的三疣梭子蟹絲氨酸蛋白酶同源物PtSPH基因的應(yīng)用，其特征在 于：所述三疣梭子蟹絲氨酸蛋白酶同源物基因編碼蛋白的重組表達(dá)產(chǎn)物能夠特異性的結(jié)合 革蘭氏陰性菌或真菌。
3. 按權(quán)利要求2所述的三疣梭子蟹絲氨酸蛋白酶同源物PtSPH基因的應(yīng)用，其特征在 于：所述革蘭氏陰性菌為溶藻弧菌，真菌為畢赤酵母。
4. 按權(quán)利要求1所述的三疣梭子蟹絲氨酸蛋白酶同源物PtSPH基因的應(yīng)用，其特征 在于：所述三疣梭子蟹絲氨酸蛋白酶同源物基因編碼蛋白的重組表達(dá)產(chǎn)物，利用帶有限制 性酶切位點的引物P1和P2通過PCR擴(kuò)增三疣梭子蟹絲氨酸蛋白酶同源物基因編碼區(qū)片 段；再將pET30a載體與上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)BamHI和Xhol雙酶切，連接后轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株 BL21 (DE3) -pLysS ;表達(dá)菌株進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，超聲波破碎處理菌體收獲重組蛋白，經(jīng)TALON 柱純化、復(fù)性后得到具有活性的三疣梭子蟹PtSPH編碼蛋白的重組表達(dá)產(chǎn)物。
5. 按權(quán)利要求4所述的三疣梭子蟹絲氨酸蛋白酶同源物PtSPH基因的應(yīng)用，其特征在 于：所述 P1 為 5' GGATCCCGCCAATCTCAGITTGGGGAGTT3' ；P2 為 5' CTCGAGTTAITTACCACCAATTCT TACATC3' 。
【文檔編號】A23K1/16GK104120139SQ201310153427
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2013年4月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月28日
【發(fā)明者】崔朝霞, 劉媛, 宋呈文, 李倩倩 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所