專利名稱：鑒定可用于通過內(nèi)源基因激活生產(chǎn)人蛋白質(zhì)的人細(xì)胞系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用于通過內(nèi)源基因激活生產(chǎn)人蛋白質(zhì)之人細(xì)胞系的選擇方法，以便以經(jīng)濟(jì)的產(chǎn)量及適于制備藥用制品的形式生產(chǎn)人蛋白質(zhì)。此外，本發(fā)明還涉及在以此方式鑒定出的細(xì)胞系中制備人蛋白質(zhì)的方法。
在人細(xì)胞系中通過內(nèi)源基因激活制備人蛋白質(zhì)的方法是已知的。例如，WO93/09222、WO94/12650和WO95/31560中描述了通過內(nèi)源基因激活而在人細(xì)胞系中生產(chǎn)人促紅細(xì)胞生成素及其它人蛋白質(zhì)。
然而，上述文件中并沒有指出在篩選可用于制備人蛋白質(zhì)的細(xì)胞系時(shí)必須遵守某些準(zhǔn)則。因此不能確保在為其生產(chǎn)所選擇的細(xì)胞系中能以所希望的產(chǎn)量和形式并且無污染地獲得目的人蛋白質(zhì)。所以在上面所提到的文件中通常只獲得低產(chǎn)量的人蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的問題是要消除本領(lǐng)域這一狀況中的不利因素，尤其是提供在選擇適用于預(yù)定靶基因內(nèi)源激活的人起始細(xì)胞系時(shí)的有關(guān)準(zhǔn)則。
這一問題通過選擇可用于經(jīng)激活內(nèi)源性存在于其中的靶基因而制備人蛋白質(zhì)的人細(xì)胞系的方法解決，其特征在于(a)檢測(cè)具有以下特征的人細(xì)胞系(i)帶目的核酸序列的靶基因，(ii)懸浮培養(yǎng)14天內(nèi)數(shù)量至少倍增5次，及(iii)在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天內(nèi)數(shù)量至少倍增5次，及(b)用具特征(i)、(ii)、(iii)的細(xì)胞系作為起始細(xì)胞系進(jìn)行靶基因的內(nèi)源激活。
根據(jù)本發(fā)明，如果需要通過基因打靶激活人細(xì)胞系中的人靶基因和獲得能以滿意的產(chǎn)量和所期望的形式生產(chǎn)靶蛋白質(zhì)的細(xì)胞，則需檢測(cè)各細(xì)胞系是否有某些特征，這些特征是細(xì)胞系作為后面大規(guī)模生產(chǎn)靶蛋白質(zhì)的合適候選者所必須具備的。優(yōu)選如此檢測(cè)無限增殖化細(xì)胞系，尤其是腫瘤細(xì)胞系，因?yàn)樗鼈冚^非無限增殖化細(xì)胞在培養(yǎng)能力上具有重要的優(yōu)勢(shì)。
按特征(i)，檢測(cè)人細(xì)胞系以觀察靶基因，即將通過內(nèi)源基因激活而活化的基因是否確實(shí)具有所期望的核酸序列，該序列通常是天然靶基因的核酸序列。這是因?yàn)橛谰门囵B(yǎng)中的腫瘤細(xì)胞系及其它細(xì)胞系常常在其基因組中有一系列的突變。因此選擇合適細(xì)胞系的一個(gè)重要方面是該細(xì)胞是否具有編碼所期望產(chǎn)物的正確基因。序列的測(cè)定可通過以普通方式培養(yǎng)細(xì)胞并將靶基因測(cè)序而完成。如果需要，可通過PCR或其它擴(kuò)增方法在測(cè)序前完成靶基因的擴(kuò)增。
選擇細(xì)胞系的另一重要特征是其懸浮培養(yǎng)的能力。懸浮細(xì)胞更易發(fā)酵，且此發(fā)酵更易適用于較大的規(guī)模，如在容積約10-50,000升的大發(fā)酵罐中發(fā)酵。因此所選擇的細(xì)胞應(yīng)或者是懸浮細(xì)胞或者是易于懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞。為此，在持續(xù)攪拌下培養(yǎng)該細(xì)胞14天。如果在此期間細(xì)胞顯示出數(shù)量至少翻了5番，就認(rèn)為它們適于懸浮培養(yǎng)。細(xì)胞倍增數(shù)可通過周期性地測(cè)定細(xì)胞讀數(shù)而確定，如用細(xì)胞計(jì)數(shù)或檢測(cè)細(xì)胞懸浮液的光密度。
選擇人細(xì)胞的另一重要特征是在無血清培養(yǎng)基中的培養(yǎng)能力。因?yàn)閺臒o血清細(xì)胞培養(yǎng)物中純化蛋白質(zhì)方便得多，且在無血清培養(yǎng)物中不存在諸如病毒之類動(dòng)物病原體污染的危險(xiǎn)，所以被選擇的細(xì)胞應(yīng)能生長(zhǎng)于無血清培養(yǎng)基中。為此，將該細(xì)胞以1-10×105個(gè)細(xì)胞/ml的密度在裝有無血清培養(yǎng)基(如來自Boehringer Mannheim有ITS的RPMI1650)的培養(yǎng)容器中培養(yǎng)14天。如果通過細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定出該細(xì)胞在此培養(yǎng)期間其數(shù)量至少翻了5番，則認(rèn)為它們適于無血清培養(yǎng)。
對(duì)于本發(fā)明來說優(yōu)選的另一重要特征是世代時(shí)間(iv)。所選擇的細(xì)胞在諸如含小牛全血清10％的DMEM或含小牛全血清10％的RPMI1640之類的培養(yǎng)基中應(yīng)有較高增殖水平，即在培養(yǎng)一周內(nèi)它們的數(shù)量應(yīng)倍增10-256次，優(yōu)選64-128次。為此，以0.1-10×105個(gè)細(xì)胞/ml的濃度、優(yōu)選0.5-2×105個(gè)細(xì)胞/ml的濃度將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，在經(jīng)過或未經(jīng)胰酶消化后通過細(xì)胞槽方式完成細(xì)胞計(jì)數(shù)。世代時(shí)間足夠短的細(xì)胞特別適于通過內(nèi)源基因激活大規(guī)模生產(chǎn)人蛋白質(zhì)。
另一優(yōu)選特征是缺乏靶基因的任何可檢測(cè)性內(nèi)源表達(dá)，即轉(zhuǎn)錄和翻譯(v)。為了進(jìn)行內(nèi)源基因的激活，優(yōu)選基本上無靶基因內(nèi)源表達(dá)的細(xì)胞系。為此，可以0.01-2×106個(gè)細(xì)胞/ml、優(yōu)選0.5-1×106個(gè)細(xì)胞/ml培養(yǎng)基的密度將細(xì)胞接種培養(yǎng)24小時(shí)。在預(yù)定時(shí)間，如24小時(shí)后，取出細(xì)胞上清液，棄去細(xì)胞，并用已知檢測(cè)方法如ELISA測(cè)定細(xì)胞上清液中靶蛋白的含量。以EPO為例，檢測(cè)限度是例如10pg/EPO/ml。以106個(gè)細(xì)胞/ml的接種量培養(yǎng)時(shí)合成少于10pg蛋白質(zhì)的細(xì)胞被認(rèn)為是不產(chǎn)生該蛋白質(zhì)而尤其適合的種類。
還有另一重要且優(yōu)選的特征是被選擇細(xì)胞中靶基因的多體性(vi)。細(xì)胞中靶基因存在兩個(gè)以上染色體拷貝能有效提高同源重組的頻率。對(duì)于基因位于第7號(hào)染色體上的EPO的生產(chǎn)來說，具有3個(gè)7號(hào)染色體的Namalwa細(xì)胞(Nadkarni等，癌癥23(1969)，64-79)或Hela53細(xì)胞[Puck等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)103(1956)，173-284]被證實(shí)是尤為適合的。含多拷貝7號(hào)染色體的細(xì)胞系的其它例子是結(jié)腸腺癌細(xì)胞系SW-480(ATCC CCL-228；Leibovitz等，癌癥研究，36(1976)，4562-4567)、惡性黑素瘤細(xì)胞系SK-MEL-3(ATCC HTB69；Fogh和Tremp《體外人腫瘤細(xì)胞》，第115-159頁，J.Fogh(編輯)，Plenum出版社，紐約，1975)、結(jié)腸腺癌細(xì)胞Colo-320(ATCC CCL-220；Quinn等，癌癥研究39(1979)，4914-4924)、黑素瘤細(xì)胞系MEL-HO(DSM ACC62；Holzmann等，國際癌癥雜志(Int.J.Cancer)41(1988)，542-547)和腎癌細(xì)胞系A(chǔ)-498(DSM ACC55；Giard等，J.Natl.Cancer Inst.51(1973)，1417-1423)。
可通過使用對(duì)特定染色體和/或靶基因位點(diǎn)特異的DNA探針來核查細(xì)胞系基因組中染色體的數(shù)目。
可用于內(nèi)源基因激活的起始細(xì)胞系的又一優(yōu)選特征是目的靶蛋白的正確糖基化(vii)。與例如天然靶蛋白相比，以類似糖基化方式、尤其是有關(guān)唾液酸數(shù)目類似的方式合成靶蛋白的人細(xì)胞系是優(yōu)選使用的細(xì)胞系。正確糖基化方式的檢測(cè)優(yōu)選通過用含有處于細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子控制之下的目的靶基因的染色體外載體瞬間轉(zhuǎn)染該細(xì)胞來完成。靶基因短暫表達(dá)后，用等電聚焦分析細(xì)胞上清液和/或提取物。以EPO為例，正確糖基化的存在是非常明顯的。因此，非糖基化EPO，如來自大腸桿菌細(xì)胞的重組EPO在體外實(shí)驗(yàn)中具有類似于糖基化EPO的活性，然而在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，非糖基化EPO基本上是低效的。為了確定起始細(xì)胞系是否能產(chǎn)生正確糖基化的EPO，可用尿EPO作一比較，也可用來自CHO細(xì)胞的重組EPO作比較(已知它有一種在人體中有活性的糖基化形式，且它的糖基化作用與尿EPO大致相同)。優(yōu)選用等電聚焦完成糖基化作用的比較。
在人細(xì)胞系選擇中還有另一優(yōu)選特征是所研究的細(xì)胞系無傳染性的污染物(vii)，如無侵染性病毒顆?；蛑гw?？赏ㄟ^細(xì)胞培養(yǎng)、體內(nèi)分析和/或特異病毒蛋白質(zhì)的檢測(cè)等方式完成病毒污染物存在情況的檢查。
本發(fā)明還涉及在人細(xì)胞系中通過內(nèi)源基因激活制備人蛋白質(zhì)的方法，其特征在于使用的細(xì)胞系符合上述特征(i)、(ii)和(iii)，并另外符合上述特征(iv)、(v)、(vi)和(vii)中至少一項(xiàng)。
本發(fā)明的方法特別適用于制備人因子，諸如EPO，血小板生成素(TPO)，諸如G-CSF或GM-CSF之類的集落刺激因子，諸如tPA之類影響凝血的蛋白質(zhì)，諸如IFN-α、IFN-β或IFN-γ之類的干擾素，諸如IL-1至IL-18之類的白細(xì)胞介素，諸如MIP之類的趨化因子，諸如NGF或BDNF之類的神經(jīng)營養(yǎng)因子，諸如IFG-BP之類影響骨生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)，刺猬狀蛋白質(zhì)(hedgehog protein)，諸如TFG-β之類的腫瘤生長(zhǎng)因子，諸如HGH、ACTH、腦啡肽(encephalin)、內(nèi)啡肽之類的生長(zhǎng)激素，諸如可溶性或膜結(jié)合形式的白細(xì)胞介素或胰島素受體之類的受體，及其它蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)。特別優(yōu)選EPO的制備方法。
可用已知方法完成內(nèi)源基因激活本身，優(yōu)選該方法包括以下步驟(a)制備人起始細(xì)胞系，該細(xì)胞系含至少一拷貝帶目的核酸序列的內(nèi)源靶基因，且已通過本發(fā)明的選擇準(zhǔn)則進(jìn)行了檢查而鑒定為適于表達(dá)靶基因；(b)用包含以下部分在內(nèi)的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細(xì)胞(i)與靶基因位點(diǎn)區(qū)同源的兩段側(cè)翼DNA序列以便發(fā)生同源重組，(ii)正選擇標(biāo)記基因，
(iii)若需要還有負(fù)選擇標(biāo)記基因，(iv)若需要還有擴(kuò)增基因，和(v)在人細(xì)胞中有活性的異源表達(dá)調(diào)控序列；(c)在能夠?qū)φx擇標(biāo)記基因的存在和任選負(fù)選擇標(biāo)記基因的缺失進(jìn)行選擇的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞；(d)分析按步驟可選擇出的細(xì)胞；(e)鑒定產(chǎn)生目的靶蛋白的細(xì)胞，和(f)若需要，還對(duì)所選擇細(xì)胞中的靶基因進(jìn)行擴(kuò)增。
用于制備能產(chǎn)生目的人蛋白質(zhì)之細(xì)胞的DNA構(gòu)建體包含與靶基因位點(diǎn)區(qū)域同源的兩段側(cè)翼DNA序列。合適側(cè)翼序列的選擇可通過如WO90/11354和WO91/09955所述方法進(jìn)行。優(yōu)選每段側(cè)翼序列長(zhǎng)度至少為150bp。
特別優(yōu)選同源DNA序列是選自靶基因的5’區(qū)域，如5’-非翻譯序列、編碼信號(hào)序列的外顯子和位于該區(qū)域中的內(nèi)含子。
正選擇標(biāo)記基因可以是任何適于真核細(xì)胞的選擇標(biāo)記基因，它的表達(dá)產(chǎn)生可選擇的表型，如抗生素抗性、輔源營養(yǎng)等。一個(gè)特別優(yōu)選的正選擇標(biāo)記基因是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。
可任選存在負(fù)選擇標(biāo)記基因，例如HSV胸苷激酶基因，在選擇劑存在時(shí)由于它的表達(dá)細(xì)胞會(huì)被破壞。負(fù)選擇標(biāo)記基因位于兩個(gè)側(cè)翼同源序列區(qū)之外。
若需要擴(kuò)增人細(xì)胞中內(nèi)源激活的靶基因，則DNA構(gòu)建體可含擴(kuò)增基因。合適的擴(kuò)增基因的例子是二氫葉酸還原酶基因、腺苷脫氨酶基因和鳥氨酸脫羧酶基因等。特別優(yōu)選的擴(kuò)增基因是二氫葉酸還原酶基因，尤其是編碼二氫葉酸還原酶-精氨酸突變體的基因，它比野生型基因?qū)x擇劑(氨甲喋呤)具更高的靈敏性(Simonsen等，美國國家科學(xué)院院報(bào)80(1983)，2495)。
此外，用于內(nèi)源基因活化的DNA構(gòu)建體還含有在人細(xì)胞中有活性的異源表達(dá)調(diào)控序列。該表達(dá)調(diào)控序列包括啟動(dòng)子及優(yōu)選的附加表達(dá)促進(jìn)序列，如增強(qiáng)子。啟動(dòng)子可以是能調(diào)控的或組成型的啟動(dòng)子。優(yōu)選的啟動(dòng)子是強(qiáng)病毒啟動(dòng)子，如SV40或CMV啟動(dòng)子。特別優(yōu)選的是CMV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子。
本發(fā)明還涉及在內(nèi)源性地存在于細(xì)胞中的靶基因被激活后由上述方法鑒定出的人細(xì)胞系用于獲取由活化靶基因編碼的多肽，優(yōu)選在包括如大發(fā)酵罐在內(nèi)的大規(guī)模生產(chǎn)方法中獲得該多肽的用途。
本發(fā)明還有另一主題是含有與人細(xì)胞中具活性之異源表達(dá)調(diào)控序列可操作連接的一拷貝內(nèi)源基因、并在無事先基因擴(kuò)增的情況下每106個(gè)細(xì)胞24小時(shí)內(nèi)能產(chǎn)生至少200ng由該內(nèi)源基因編碼的多肽的人細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)待該人細(xì)胞能產(chǎn)生200-3000ng多肽/106個(gè)細(xì)胞/24小時(shí)，最優(yōu)選能產(chǎn)生1000-3000ng多肽/106個(gè)細(xì)胞/24小時(shí)。
最后，本發(fā)明的又一主題是可通過基因擴(kuò)增而由上述細(xì)胞獲得、含多拷貝內(nèi)源基因(每個(gè)拷貝的內(nèi)源基因均與在該人細(xì)胞中有活性的異源表達(dá)調(diào)控序列可操作連接)每106個(gè)細(xì)胞能在24小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生至少1000ng由該內(nèi)源基因編碼的多肽的人細(xì)胞。尤其優(yōu)選通過基因擴(kuò)增可獲得的人細(xì)胞系能產(chǎn)生1000-25000ng多肽/106個(gè)細(xì)胞/24小時(shí)，最優(yōu)選能產(chǎn)生5000-25000ng多肽/106個(gè)細(xì)胞/24小時(shí)的人細(xì)胞系。
按照本發(fā)明的一個(gè)細(xì)胞實(shí)例是EPO生產(chǎn)性克隆“Aladin”，該克隆在1997年7月15日按布達(dá)佩斯協(xié)議的條款保藏于Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)，Mascheroder Weg 1b，38124Brunswick，保藏號(hào)DSM ACC 2320。
通過以下實(shí)施例和附圖及序列表進(jìn)一步解釋本發(fā)明。


圖1圖解說明5’-非編碼序列區(qū)、外顯子1和內(nèi)含子1區(qū)的EPO基因同源區(qū)域的擴(kuò)增。圖2圖解說明含有5’-非編碼序列區(qū)、外顯子1和內(nèi)含子1區(qū)的同源區(qū)域的質(zhì)粒。圖3圖解說明含勞氏肉瘤病毒啟動(dòng)子(RSV)、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(NEO)、SV40的早期聚腺苷酸化區(qū)域(SVIPA)、SV40早期啟動(dòng)子(SVI)、二氫葉酸還原酶基因(DHFR)及巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子和增強(qiáng)子(MCMV)的基因激活序列。圖4aEPO基因打靶載體p176的產(chǎn)生。圖4bEPO基因打靶載體p179和p187的產(chǎn)生。圖4cEPO基因打靶載體p189的產(chǎn)生。圖4dEPO基因打靶載體p190的產(chǎn)生。圖4eEPO基因打靶載體p192的產(chǎn)生。SEQ ID NO.1和NO.2用于PCR產(chǎn)物1的引物核苷酸序列(圖1)。SEQ ID NO.3和NO.4用于制備PCR產(chǎn)物2的引物序列(圖1)。
實(shí)施例實(shí)施例1選擇方法1.1測(cè)定世代時(shí)間將檢測(cè)過的細(xì)胞系以0.1-5×105個(gè)細(xì)胞/ml的濃度、優(yōu)選0.5-2×105個(gè)細(xì)胞/ml的濃度分別接種于含DMEM和10％FCS或RPMI1640和10％FCS的培養(yǎng)皿中，并在如ATCC為特殊細(xì)胞推薦的培養(yǎng)基及合適條件下培養(yǎng)，每2-3天，經(jīng)過或未經(jīng)胰酶消化后用計(jì)數(shù)槽、如Neubauer測(cè)定細(xì)胞數(shù)量。培養(yǎng)一周內(nèi)細(xì)胞倍增16-256次、優(yōu)選倍增64-128次的細(xì)胞被評(píng)估為陽性(+，++或+++)。1.2懸浮培養(yǎng)能力為了測(cè)定懸浮培養(yǎng)能力，將細(xì)胞在帶相應(yīng)附件的Belico旋轉(zhuǎn)儀中于37℃和7％二氧化碳的條件下，在培養(yǎng)基(見1.1，添加和不添加血清，如胎牛血清)中持續(xù)攪拌培養(yǎng)14天。在此期間至少倍增5次的細(xì)胞被評(píng)估為適于懸浮培養(yǎng)(+)。1.3在無血清培養(yǎng)基中的培養(yǎng)能力為了測(cè)定細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中的培養(yǎng)能力，將細(xì)胞以1-10×105個(gè)細(xì)胞/ml的密度，在如1.1所述條件下，用ATCC為特殊細(xì)胞推薦并含ITS(Boehringer Mannheim，Cat.NO.1074547)的基本培養(yǎng)基(即未添加血清)于培養(yǎng)容器里培養(yǎng)14天。被證實(shí)在此期間數(shù)量至少倍增5次(通過細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定)的細(xì)胞被評(píng)估為適于無血清培養(yǎng)。1.4測(cè)定靶基因的內(nèi)源表達(dá)為了確定靶蛋白是否在所選擇的細(xì)胞系中內(nèi)源性產(chǎn)生，將細(xì)胞以0.01-2×106個(gè)細(xì)胞/ml的密度、優(yōu)選0.5-1×106個(gè)細(xì)胞/ml培養(yǎng)基的密度接種培養(yǎng)24小時(shí)。24小時(shí)后取出細(xì)胞上清液，棄去細(xì)胞，并用已知方法，如用對(duì)特定蛋白質(zhì)特異的免疫測(cè)定法確定細(xì)胞上清液中細(xì)胞蛋白質(zhì)的含量。
在EPO的情形中，通過ELISA測(cè)定含量。為此，用生物素化的抗EPO抗體(Boehringer Mannheim)包被由鏈霉親和素包被的微量滴定板，并與含有蛋白質(zhì)(1％W/V)的溶液溫育，以阻斷非特異性結(jié)合。然后加入0.1ml培養(yǎng)上清液并保溫過夜。洗滌后加入過氧化物酶偶聯(lián)的單克隆抗EPO抗體(Boehringer Mannheim)2小時(shí)。用ABTS為底物，在Perkin-Elmer光度計(jì)上于405nm測(cè)定過氧化物酶反應(yīng)。
在此試驗(yàn)中EPO檢測(cè)限度是10pg EPO/ml。以106個(gè)細(xì)胞/ml接種量接種產(chǎn)生少于10pg EPO/ml的細(xì)胞被認(rèn)為不產(chǎn)生此蛋白質(zhì)，因而被評(píng)估為合適的細(xì)胞(+)。1.5測(cè)定靶基因拷貝數(shù)為了確定細(xì)胞系中靶基因的拷貝數(shù)，從約108個(gè)細(xì)胞中分離人基因組DNA并定量(Sambrook等，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(1989)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)。用如AgeI和AscI或Bam HI、HindIII和SalI等限制酶切割DNA后，通過瓊脂糖凝膠電泳按大小分別分離這些DNA片段，最后將它們轉(zhuǎn)移至尼龍膜上并固定。
用對(duì)靶基因位點(diǎn)或靶基因所處的染色體特異的地高辛標(biāo)記DNA探針與該固定化DNA雜交，在嚴(yán)謹(jǐn)條件下漂洗。用輻射敏感膠片通過化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)特異性雜交信號(hào)。1.6測(cè)定靶基因的核酸序列用DNA分離試劑盒(如QIAGEN Blood & Cell Culture DNA試劑盒)從約107個(gè)細(xì)胞中分離基因組DNA。
用一對(duì)PCR引物擴(kuò)增靶基因。引物序列與靶基因編碼區(qū)側(cè)翼序列互補(bǔ)，因而能夠擴(kuò)增靶基因的整個(gè)編碼區(qū)。
PCR產(chǎn)物被直接用于序列分析或克隆到載體中后再測(cè)序。所用測(cè)序引物與來自靶基因內(nèi)含子區(qū)域的序列互補(bǔ)，以便能夠得到完整的靶基因外顯子區(qū)域序列。按制造商所給信息，用“PrismTMReady Reaction DyeTerminator Cycle Sequencing”試劑盒(PE/ABJ，F(xiàn)orest City，美國)在PE/ABI自動(dòng)測(cè)序儀上測(cè)序。1.7確定糖基化方式為了確定EPO的糖基化方式，用含有處于SV40啟動(dòng)子控制之下的人EPO基因序列4Kb HindIII/EcoRI片段的質(zhì)粒pEPO227轉(zhuǎn)染待檢測(cè)細(xì)胞系(Jacobs等)，自然313(1985)，806；Lee-Huang等，基因128(1993)，272)。在脂轉(zhuǎn)染胺存在下，用可購買到的試劑盒，按制備商說明書轉(zhuǎn)染細(xì)胞。2-5天后用ELISA測(cè)定所獲取的細(xì)胞上清液中EPO的含量。
濃縮細(xì)胞上清液，并通過等電聚焦與已知EPO產(chǎn)品比較[Righetti，P.G.，于Work，T.S.，Burdon，R.H.(編)《等電聚焦原理、方法學(xué)和應(yīng)用》，Elsevier Biomedical出版社，Amsterdam(1983)]。具有類似于已知EPO產(chǎn)品，諸如尿EPO之類的糖基化方式的人細(xì)胞被評(píng)估為合適的(+)。1.8病毒污染物的測(cè)定1.8.1通過細(xì)胞培養(yǎng)分析為了檢測(cè)待查人細(xì)胞系中可能具有的感染性病毒污染物，將該細(xì)胞裂解液與檢測(cè)細(xì)胞系共溫育以檢測(cè)致細(xì)胞病變效應(yīng)。此外，還進(jìn)行血吸附作用分析。
為了制備裂解液，用快速凍融法裂解懸浮于1ml緩沖液中的106個(gè)細(xì)胞。離心分離細(xì)胞殘余物，將上清液與檢測(cè)細(xì)胞系混合。所用的檢測(cè)細(xì)胞系是Hep G2(ATCC HB-8065，自然282(1979)，615-616)、MRC-5(ATCC-1587)和Vero(ATCC CCL-171，Jacobs，自然227(1970)，168-170)。Polio SV和流感型病毒被用作陽性對(duì)照。陰性對(duì)照是在無裂解液狀態(tài)下培養(yǎng)的檢測(cè)細(xì)胞系。為了檢測(cè)致細(xì)胞病變效應(yīng)，在至少14天的期間內(nèi)定期研究檢測(cè)細(xì)胞系。
為了進(jìn)行血吸附作用分析，對(duì)已與細(xì)胞裂解液及與對(duì)照溫育過的Vero細(xì)胞在7天后用雞、豬或人的紅細(xì)胞處理。紅細(xì)胞附著到單層培養(yǎng)細(xì)胞上表明培養(yǎng)物中有病毒污染。1.8.2體內(nèi)分析按1.8.1所述制備待研究之細(xì)胞系的裂解液，并以0.1ml的量經(jīng)腹膜內(nèi)或腦間注射入新生小鼠體內(nèi)。14天后觀察小鼠的致病率和死亡率。1.8.3病毒蛋白質(zhì)的特異性檢測(cè)通過將具EBV陽性帶的人血清與待檢細(xì)胞系的固定化細(xì)胞混合來檢測(cè)諸如EB病毒蛋白質(zhì)(核蛋白或衣殼抗原)之類的特殊病毒蛋白質(zhì)的存在情況。然后通過添加補(bǔ)體和相應(yīng)抗人補(bǔ)體C3熒光素偶聯(lián)物(用于檢測(cè)核抗原)和通過添加抗人球蛋白熒光素(用于檢測(cè)衣殼抗原)完成病毒抗原的檢測(cè)。實(shí)施例2選擇結(jié)果用第1點(diǎn)所述方法檢驗(yàn)人細(xì)胞系HepG2、HT1080、Namalwa、HeLa和HeLaS3。結(jié)果列于下表1中。表1
從表1可見，細(xì)胞系HT1080、Namalwa和HeLaS3被認(rèn)為適用于EPO的內(nèi)源基因激活。Namalwa和HeLaS3尤其適合。實(shí)施例3克隆EPO同源區(qū)用基因組胎盤DNA(Boehringer Mannheim)，通過PCR擴(kuò)增EPO基因的同源區(qū)。從EPO基因5’-非翻譯序列、外顯子1和內(nèi)含子1區(qū)域6.3Kb長(zhǎng)的同源區(qū)制備了兩種PCR產(chǎn)物(參看圖1)。用于制備PCR產(chǎn)物1的引物具以下序列5’-CGC GGC GGA TCC CAG GGA GCT GGG TTG ACC GG-3’(SEQID NO.1)和5’-GGC CGC GAA TTC TCC GCG CCT GGC CGG GGT CCC TCA GC-3’(SEQ ID NO.2)。用于制備PCR產(chǎn)物2的引物具以下序列5’-CGC GGCGGA TCC TCT CCT CCC TCC CAA GCT GCA ATC-3’(SEQ ID NO.3)和5’-GGC CGC GAA TTC TAG AAC AGA TAG CCA GGC TGA GAG-3’(SEQ ID NO.4)。
用限制酶裂解法從PCR產(chǎn)物1和2中切出需要的片段(PCR產(chǎn)物1HindIII，PCR產(chǎn)物2HindIII和EcoRV)，并克隆入已用HindIII和EcoRV裂解的載體pCRII(Invitrogen)中。以此方式獲得的重組載體被稱為5epopcr1000(參見圖2)。實(shí)施例4 EPO基因打靶載體的構(gòu)建4.1將含NEO基因、DHFR基因和CMV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的基因激活序列(參見圖3)插入含EPO同源區(qū)的質(zhì)粒5epopcr1000之Agel位點(diǎn)，從而得到質(zhì)粒p176(參見圖4a)。為了使CMV啟動(dòng)子盡可能靠近EPO基因的翻譯起始位點(diǎn)，將限制性酶切位點(diǎn)AscI和AgeI(部分裂解)之間963bp長(zhǎng)的片段刪除掉，從而得到質(zhì)粒p179(圖46)。4.2為了達(dá)到表達(dá)的最優(yōu)化，用合成序列Met-Ser-Ala-His的核苷酸替換編碼EPO前導(dǎo)序列Met-Gly-Val-His起始部分的外顯子1內(nèi)核苷酸。通過基因組EPODNA序列的擴(kuò)增獲得該序列，例如用相應(yīng)的引物，以含有處于SV40啟動(dòng)子控制之下的人EPO基因序列3.5Kb BstEII/EcoRI片段(包括外顯子1-5)的質(zhì)粒pEPO148(Jacobs等，自然313(1985)，806，和Lee-Huang等，基因128(1993)，227)為模板擴(kuò)增該序列。從而獲得質(zhì)粒p187(圖4b)。4.3將來自Psvtk-1的單純皰疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)(PvuII/NarI片段)(圖4c)插入質(zhì)粒p187，制備得到質(zhì)粒p189。HSV-TK基因處于內(nèi)含子1，3’-末端與CMV啟動(dòng)子反方向的SV40啟動(dòng)子(EcoRV/ClaI)的控制之下，可用于同源重組的負(fù)選擇。4.4為了構(gòu)建質(zhì)粒p190，將含Simonsen等(美國國家科學(xué)院院報(bào)80(1983)，2495)所述DHFR精氨酸突變體cDNA的質(zhì)粒pHEAVY之SfiI/BglII片段亞克隆入經(jīng)SfiI和BglII酶切的質(zhì)粒pGenak-1中，該質(zhì)粒包含處于RSV啟動(dòng)子控制之下并以晚期SV40聚腺苷酸化位點(diǎn)為終止子的NEO基因，處于早期SV40啟動(dòng)子、作為終止子的早期SV40聚腺苷酸化位點(diǎn)控制之下的鼠DHFR基因(Kaufmann等，分子細(xì)胞生物學(xué)，2(1982)，1304；Okayama等，分子細(xì)胞牲學(xué)3(1983)，280和Schimke，生物化學(xué)雜志263(1988)，5989)和CMV啟動(dòng)子(Boshart等，細(xì)胞41(1995)，521)。然后將含有DHFR精氨酸突變體編碼cDNA的HpaI片斷連接到經(jīng)HpaI酶切的質(zhì)粒p189中，從而獲得質(zhì)粒p190(圖4d)4.5為了得到無HSV-TK基因的轉(zhuǎn)染載體，將質(zhì)粒p190的含基因激活序列之AscI/NheI酶切片段連接至含外顯子1的質(zhì)粒p187之AscI/NheI片段中。產(chǎn)生的質(zhì)粒被稱為p192(圖4e)。
實(shí)施例5轉(zhuǎn)染細(xì)胞為EPO生產(chǎn)選擇多種細(xì)胞系并用打靶載體轉(zhuǎn)染。5.1 Namalwa細(xì)胞將細(xì)胞培養(yǎng)于T150組織培養(yǎng)瓶中，通過電穿孔法轉(zhuǎn)染(1×107個(gè)細(xì)胞/800μl電穿孔緩沖液，緩沖液含20mM Hepes、138mM氯化鈉、5mM氯化鉀、0.7mM磷酸氫二鈉、6mM D-葡萄糖-水化物pH7.0、10μg線性化DNA，960μF，260V BioRad Gene Pulser)。電穿孔后，在40個(gè)96孔板上將細(xì)胞培養(yǎng)于含RPMI1640、10％(V/V)胎牛血清(FCS)、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉的培養(yǎng)液中。兩天后將細(xì)胞置于含G-418 1mg/ml的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-20天。通過固相ELISA檢驗(yàn)上清液中EPO的產(chǎn)量(見實(shí)施例1.4)。在24孔板及T-25組織培養(yǎng)瓶中擴(kuò)增產(chǎn)生EPO的克隆。凍存等分試樣，并用FACS(Ventage，Becton Dickin son)亞克隆諸細(xì)胞。重復(fù)檢驗(yàn)這些亞克隆的EPO產(chǎn)量。5.2 HT 1080細(xì)胞除了將HT1080細(xì)胞培養(yǎng)于含DMEM、10％(V/V)FCS、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉的培養(yǎng)基中外，HT1080的其它條件與Namalwa細(xì)胞培養(yǎng)中所述相同。為了進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)染，用胰酶消化使細(xì)胞從培養(yǎng)容器的壁上脫離下來。電穿孔后，在5個(gè)96孔板上將1×107個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM、10％(V/V)FCS、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉中。5.3 Hela S3細(xì)胞除了將Hela S3細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640、10％(V/V)FCS、2mM L-谷氨酰胺、1％(V/V)NEM非必需氨基酸(Sigma)和1mM丙酮酸鈉中之外，其它條件如為Namalwa細(xì)胞所述。為了進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)染，用胰酶消化使細(xì)胞從培養(yǎng)容器的壁上脫離下來。電穿孔的條件是960μF/250V。電穿孔后，在T75組織培養(yǎng)瓶中將細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640、10％(V/V)FCS、2mM L-谷氨酰胺、1％(V/V)NEM、1mM丙酮酸鈉中。電穿孔24小時(shí)后，用胰酶消化細(xì)胞并于10個(gè)96孔板上在含600μg/ml G-418的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-15天。實(shí)施例6 EPO基因擴(kuò)增為了提高EPO的表達(dá)量，在氨甲喋呤(MTX)濃度逐步提高(100pM-1000nM)的條件下培養(yǎng)產(chǎn)生EPO的克隆。在每一MTX濃度下經(jīng)ELISA(見實(shí)施例1.4)檢驗(yàn)克隆的EPO產(chǎn)量。通過有限稀釋對(duì)高水平生產(chǎn)者進(jìn)行亞克隆。實(shí)施例7鑒定產(chǎn)生EPO的細(xì)胞系選用三個(gè)不同的細(xì)胞系(Namalwa、HeLa S3和HT1080)進(jìn)行EPO基因的激活。通過用質(zhì)粒p179、p187、p189、p190或p192轉(zhuǎn)染獲得產(chǎn)生EPO的克隆(參閱實(shí)施例2和3)。
檢驗(yàn)約160,000個(gè)NEO抗性克隆的EPO產(chǎn)量，其中12-15個(gè)克隆可重復(fù)性地以明顯產(chǎn)量分泌EPO至細(xì)胞上清液中。
其中未通過MTX的基因擴(kuò)增即令人驚奇地鑒定出共7個(gè)克隆，它們能以足夠用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的量產(chǎn)生EPO。這些克隆的EPO產(chǎn)量范圍為200ng/ml至高于1000ng/ml/106個(gè)細(xì)胞/24小時(shí)。
用500nM MTX進(jìn)行基因擴(kuò)增后，所鑒定的EPO克隆的EPO產(chǎn)量提高至超過3000ng/ml/106個(gè)細(xì)胞/24小時(shí)。進(jìn)一步提高M(jìn)TX濃度至1000nM，導(dǎo)致EPO產(chǎn)量高于7000ng/ml/106個(gè)細(xì)胞/24小時(shí)。
在無血清培養(yǎng)條件下及MTX缺乏時(shí)，所獲得的克隆也顯示有EPO產(chǎn)生。序列表(1)一般資料(i)申請(qǐng)人(A)名稱Boehringer Mannheim GmbH(B)地址Sandhofer Str.112-132(C)城市Mannheim(E)國家德國(F)郵政編碼68305(ii)發(fā)明題目可用于經(jīng)內(nèi)源基因激活生產(chǎn)人蛋白質(zhì)的人細(xì)胞系的鑒定(iii)序列數(shù)4(iV)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patent In Release #1.0，Version #1.30(EPA)(2)SEQ ID NO.1的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(Xi)序列描述SEQ ID NO.1CGCGGCGGAT CCCAGGGAGC TGGGTTGACC GG 32(2)SEQ ID NO.2的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度38個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(Xi)序列描述SEQ ID NO.2GGCCGCGAAT TCTCCGCGCC TGGCCGGGGT CCCTCAGC 38(2)SEQ ID NO.3的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(Xi)序列描述SEQ ID NO.3CGCGGCGGAT CCTCTCCTCC CTCCCAAGCT GCAATC 36(2)SEQ ID NO.4的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)堿基對(duì)(B) 類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(Xi)序列描述SEQ ID NO.4GGCCGCGAAT TCTAGAACAG ATAGCCAGGC TGAGAG 3權(quán)利要求
1.可用于通過激活內(nèi)源性地存在于細(xì)胞中的靶基因而制備人蛋白質(zhì)的人細(xì)胞系的選擇方法，其特征在于(a)檢驗(yàn)人細(xì)胞系中是否存在以下特征(i)有所需核酸序列的靶基因，(ii)懸浮培養(yǎng)14天內(nèi)數(shù)量至少倍增5次，及(iii)在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天內(nèi)數(shù)量至少倍增5次，和(b)使用符合特征(i)、(ii)和(iii)的細(xì)胞系作為靶基因內(nèi)源激活的起始細(xì)胞系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于使用的人細(xì)胞系(iv)其世代時(shí)間是在培養(yǎng)基中一周內(nèi)數(shù)量倍增16-256次。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征在于使用的人細(xì)胞系在培養(yǎng)基中一周內(nèi)數(shù)量倍增64-128次。
4.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于使用的人細(xì)胞系(v)基本上無靶基因的內(nèi)源性表達(dá)。
5.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于使用的人細(xì)胞系(vi)含有2個(gè)以上染色體拷貝的靶基因。
6.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于使用的人細(xì)胞系(vii)以類似于天然靶蛋白的糖基化方式合成細(xì)胞蛋白質(zhì)。
7.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于使用的人細(xì)胞系(viii)無可檢測(cè)到的感染性污染物。
8.在人細(xì)胞系中通過內(nèi)源基因激活制備人蛋白質(zhì)的方法，其特征在于所用細(xì)胞系符合權(quán)利要求1中所定義的特征(i)、(ii)和(iii)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其特征在于所用細(xì)胞系還符合如權(quán)利要求2、4、5、6和7中任一項(xiàng)所限定的特征(iv)、(v)、(vi)、(vii)和(viii)中至少一條。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其用于制備選自下組的人類因子EPO，TPO，集落刺激因子，影響凝血的蛋白質(zhì)，干擾素，白細(xì)胞介素，趨化因子，神經(jīng)營養(yǎng)因子，影響骨生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)，刺猬狀蛋白質(zhì)，腫瘤生長(zhǎng)因子，生長(zhǎng)激素，ACTH，腦啡肽、內(nèi)啡肽、受體及其它結(jié)合蛋白的蛋白質(zhì)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其用于制備EPO。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的方法鑒定出的人細(xì)胞系在經(jīng)激活內(nèi)源性存在于該細(xì)胞中的靶基因后獲得由活化靶基因所編碼多肽的用途。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的用途，其用于從大發(fā)酵罐中獲得多肽。
14.一種人細(xì)胞系，其特征在于含有與在該人細(xì)胞中有活性的異源啟動(dòng)子可操作連接的一拷貝內(nèi)源基因，并且能夠以至少200ng多肽/106個(gè)細(xì)胞/24小時(shí)的量生產(chǎn)該內(nèi)源基因所編碼的多肽。
15.可通過基因擴(kuò)增由權(quán)利要求14的細(xì)胞獲得的人細(xì)胞系，其特征在于含有均與在該人細(xì)胞中有活性的異源啟動(dòng)子可操作連接的多拷貝內(nèi)源基因，并且能夠以至少1000ng多肽/106個(gè)細(xì)胞/24小時(shí)的量生產(chǎn)該內(nèi)源基因所編碼的多肽。
全文摘要
可用于通過內(nèi)源基因激活生產(chǎn)人蛋白質(zhì)的人細(xì)胞系的選擇方法使得可以經(jīng)濟(jì)上可行的量、適于生產(chǎn)藥物組合物的形式生產(chǎn)蛋白質(zhì)。除此之外還公開了在用此方式鑒定出的細(xì)胞系中生產(chǎn)人蛋白質(zhì)的方法。
文檔編號(hào)C12N15/62GK1265144SQ98807498
公開日2000年8月30日 申請(qǐng)日期1998年7月22日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月23日
發(fā)明者M·布蘭德特, R·弗朗茲, U·帕薩拉 申請(qǐng)人:羅切診斷學(xué)有限公司