專利名稱：一種甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的可濕性粉劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物農(nóng)藥，特別是涉及一種以甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的發(fā)酵產(chǎn)物為活性成分的可濕性粉劑，以及所述可濕性粉劑的制備方法，特別是涉及所述可濕性粉劑防治柑橘潰瘍病的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
柑橘潰瘍病是一種由桿狀細(xì)菌引起的危害柑橘生長的世界性病害，為國內(nèi)外植物檢疫對象，早期與柑橘瘡痂病混淆。直到1913年才被描述為2種不同的病害，并于1915年分離并鑒定了病原菌。此病起源于亞洲，且以亞洲國家發(fā)生最為普遍，故又稱亞洲病害。該病害在我國的廣東、廣西、福建、臺(tái)灣、江西、浙江、江蘇、湖南、湖北、貴州、四川、陜西等省均有分布。柑橘潰瘍病病原菌在植物組織上越冬，靠風(fēng)、雨、昆蟲和枝葉交接從傷口、氣孔和皮孔等處浸入而近距離傳播；遠(yuǎn)距離傳播主要通過帶病苗木、接穗和果實(shí)；高溫多雨、刮大風(fēng)利于病害流行。該病每年均可發(fā)生流行為害，主要為害葉片，也為害枝條和果實(shí)。以苗木、幼樹受害最重，造成落葉、枯梢、樹勢衰弱、落果等，嚴(yán)重影響果樹產(chǎn)量和品質(zhì)?？蔀楹κ|香科數(shù)十種植物，傳播途徑廣，傳 染迅速，危害嚴(yán)重，頑固難防。在我國，柑橘種植向規(guī)?；l(fā)展，隨著規(guī)模的擴(kuò)大，柑橘潰瘍病暴發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加。目前柑橘潰瘍病防治措施的研究工作還比較薄弱，進(jìn)展比較緩慢。防治柑橘潰瘍病主要依賴的化學(xué)防治且所用的藥劑品種少，生產(chǎn)上用藥防治效果不理想，更無高效特效殺菌藥劑。迄今為止，柑橘潰瘍病仍然無法根治，局部地區(qū)有蔓延趨勢。伴隨無公害水果生產(chǎn)的需要以及大量微生物農(nóng)藥的出現(xiàn)，國外已經(jīng)取得一定的研究成果，生物防治必將成為潰瘍病防治措施的研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)。因此，尋找對柑橘潰瘍病防治效果好的微生物殺菌藥劑，對控制柑橘潰瘍病的危害有重要意義。本發(fā)明所涉及的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的發(fā)酵產(chǎn)物對柑橘潰瘍病具有良好的防治效果，其防治效果高達(dá)83. 27%，且無藥害產(chǎn)生。但是，單純的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的發(fā)酵產(chǎn)物的穩(wěn)定性不好，不能長時(shí)間放置，也不適合生產(chǎn)大面積應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
為克服通常存在的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的發(fā)酵產(chǎn)物不能長時(shí)間放置以及不便與使用的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供了一種穩(wěn)定性好的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的可濕性粉劑。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，這種制劑性質(zhì)穩(wěn)定，便于長期存放，且對柑橘潰瘍病防治效果顯著。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本申請所涉及的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌屬于芽孢桿菌屬，其命名為Bacillusmethylotrophicus ;保藏登記號(hào)為CGMCC No. 6793,保藏機(jī)構(gòu)為中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏單位地址北京市朝陽區(qū)大屯路；保藏時(shí)間為2012年11月07日。實(shí)驗(yàn)室編號(hào)為LW-6。本發(fā)明的上述甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌是從煙草根際土壤分離得到的，通過菌株的分離、純化以及篩選步驟獲得的。菌株鑒定采用形態(tài)特征、生理生化實(shí)驗(yàn)、分子生物學(xué)鑒定法，以及16SrDNA同源序列比對分析最終確定上述保藏編號(hào)的菌株為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(BaciIlusmethylotrophiIus)。本申請涉及一種甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的可濕性粉劑，其特征在于，所述可濕性粉劑由以下重量份的組分組成的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的原粉50-90重量份，輕質(zhì)碳酸鈣20-60重量份,十二燒基苯磺酸鈉2-3重量份,磷酸二氫鉀1-2重量份,磷酸氫二鉀1-2重量份，分散劑亞甲基雙甲基萘磺酸鈉2-3重量份；所述甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的原粉是通過以下方法制備得到的步驟一將上述保藏登記號(hào)為CGMCC No. 6793的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌接種到LB液體培養(yǎng)基搖瓶中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期；所述LB液體培養(yǎng)基為酵母浸膏3-5g，蛋白胨8-10g, NaCl 5g，水 1000ml, pH 7· 4 7· 6 ;
步驟二 種子罐發(fā)酵培養(yǎng)將上述培養(yǎng)好的菌種按種子罐所用的培養(yǎng)基的體積比10%接種量接入30L種子罐，培養(yǎng)至對數(shù)生長期；所述種子罐所用的培養(yǎng)基配方為葡萄糖10g/L、蛋白胨2g/L、MgSO4 O. 5g/L、酵母膏2g/L、牛肉膏2g/L ;培養(yǎng)條件溶氧量為15 20%，攪拌速度200rpm，發(fā)酵溫度30°C ；步驟三大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)將上述種子罐發(fā)酵培養(yǎng)好的培養(yǎng)液按照大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵罐所用培養(yǎng)基的體積比10%接種量接入大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵罐培養(yǎng)，大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵罐所用培養(yǎng)基配方為玉米粉20g/L、豆餅粉50g/L、MgSO4 · 7H20 O. 5g/L，MnSO4 · H2O IOg/L ;培養(yǎng)條件溶氧量為15 18%，攪拌速度200rpm，發(fā)酵溫度30°C ;培養(yǎng)至最終生物量為109cfu/克，芽孢形成率達(dá)到98%以上，發(fā)酵完成；步驟四后處理將經(jīng)大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)液進(jìn)行過濾，噴霧干燥即得原粉。優(yōu)選地，上述甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的原粉70重量份，輕質(zhì)碳酸鈣34重量份，十二烷基苯磺酸鈉2. 5重量份，磷酸二氫鉀I重量份，磷酸氫二鉀1. 5重量份，分散劑亞甲基雙甲基萘磺酸鈉3重量份。所述甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的原粉中甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌含量為200-1000億活芽
孢/克。在本發(fā)明所制備得到的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的可濕性粉劑，含菌量(cfu/g)彡101。，活菌率)彡85%。本發(fā)明所述的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的可濕性粉劑的制備方法，其特征在于將各組分混合均勻，控制加工溫度在O 50°C，在氣流粉碎機(jī)中粉碎，過150目篩，即得最終產(chǎn)
品O所述甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的可濕性粉劑可用于多種植物病害，特別是用于防治柑橘病害，特別是防治柑橘潰瘍病，防治效果高達(dá)83. 27%。應(yīng)用時(shí)，使用方法為使用本發(fā)明的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的可濕性粉劑800-1000倍葉面噴霧。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供上述甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的可濕性粉劑防治柑橘病害，特別是柑橘潰瘍病的用途。
本發(fā)明克服了甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的發(fā)酵發(fā)酵產(chǎn)物不能長時(shí)間放置以及不便與使用的缺點(diǎn)，經(jīng)試驗(yàn)證明，本發(fā)明的可濕性粉劑性質(zhì)穩(wěn)定，便于長期存放，且對柑橘潰瘍病有較好的防治效果。可以預(yù)見，本發(fā)明在生物防治領(lǐng)域?qū)⒂兄鴱V闊的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明做詳細(xì)描述。實(shí)施例1制備本發(fā)明的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的可濕性粉劑配方為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的原粉70千克、輕質(zhì)碳酸鈣34千克，十二烷基苯磺酸鈉2. 5千克，磷酸二氫鉀I千克，磷酸氫二鉀1. 5千克，分散劑亞甲基雙甲基萘磺酸鈉3千克。制備方法將上述原料混合均勻，控制加工溫度在25°C左右，在氣流粉碎機(jī)中粉碎，過150目篩，即得。所述甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的原粉是通過以下方法制備得到的(I)將本發(fā)明保藏登記號(hào)為CGMCC No. 6793的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌接種到LB液體培養(yǎng)基搖瓶中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期；所述LB液體培養(yǎng)基為酵母浸膏5g，蛋白胨8g，NaCl5g,水 1000ml, pH 7· 4 7· 6 ;(2)將上述培養(yǎng)好的菌種按種子罐所用的培養(yǎng)基的體積比10%結(jié)種量接入30L種子罐，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，種子罐所用的培養(yǎng)基配方為葡萄糖10g/L、蛋白胨2g/L、MgSO4O. 5g/L、酵母膏2g/ L、牛肉膏2g/L ;培養(yǎng)條件溶氧量為15%，攪拌速度200rpm，發(fā)酵溫度30°C ； (3)將上述種子罐發(fā)酵培養(yǎng)好的培養(yǎng)液按照大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵罐所用培養(yǎng)基的體積比10%的接種量接入大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵罐培養(yǎng)，大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵罐所用培養(yǎng)基配方為玉米粉 20g/L、豆餅粉 50g/L、MgS04 · 7H20 O. 5g/L，MnSO4 · H2O 10g/L ;培養(yǎng)條件溶氧量為 15 18%，攪拌速度200rpm，發(fā)酵溫度30°C ;培養(yǎng)至最終生物量為109cfu/克，芽孢形成率達(dá)到98%以上,發(fā)酵完成；(4)發(fā)酵完成后，將經(jīng)大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)液進(jìn)行過濾，噴霧干燥即得原粉。實(shí)施例2本發(fā)明的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的可濕性粉劑防治柑橘潰瘍病試驗(yàn)2010年至2011年連續(xù)兩年，在陜西城固縣寶山鎮(zhèn)進(jìn)行了上述實(shí)施例1所制得的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的可濕性粉劑對柑橘潰瘍病的防治效果研究。試驗(yàn)果園面積為4hm2，規(guī)格為2mX3m，地勢平坦，排灌方便，上壤肥力中等，其他肥水、蟲害防治等管理措施相同。2010及2011年8月31日下午噴第I次藥，此時(shí)秋梢已抽出5 8cm，采用噴霧器對樹冠均勻噴霧，噴至葉片正反面和小枝濕透為度。9月15日下午噴第2次藥。9月30日、10月10日下午調(diào)查防治效果。試驗(yàn)設(shè)5各處理①上述實(shí)施例1所制得的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的可濕性粉劑的800倍液，②77 %多寧600倍液，③3 %克菌康600倍液，④80 %金納海800倍液，以清水為對照。表I不同殺菌劑對柑橘葉潰瘍病的防治效果
權(quán)利要求
1.一種甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的可濕性粉劑，其特征在于，所述可濕性粉劑由以下重量份的組分組成的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的原粉50-90重量份，輕質(zhì)碳酸鈣20-60重量份， 十二燒基苯磺酸鈉2-3重量份,磷酸二氫鉀1-2重量份,磷酸氫二鉀1-2重量份,分散劑亞甲基雙甲基萘磺酸鈉2-3重量份；所述甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的原粉是通過以下方法制備得到的步驟一將上述保藏登記號(hào)為CGMCC No. 6793的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌接種到LB液體培養(yǎng)基搖瓶中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期；所述LB液體培養(yǎng)基為酵母浸膏3-5g，蛋白胨8-10g， NaCl 5g，水 1000ml, pH 7· 4 7· 6 ;步驟二 種子罐發(fā)酵培養(yǎng)將上述培養(yǎng)好的菌種按種子罐所用的培養(yǎng)基的體積比10% 接種量接入30L種子罐，培養(yǎng)至對數(shù)生長期；所述種子罐所用的培養(yǎng)基配方為葡萄糖IOg/ L、蛋白胨2g/L、MgSO4 O. 5g/L、酵母膏2g/L、牛肉膏2g/L ;培養(yǎng)條件溶氧量為15 20%, 攪拌速度200rpm，發(fā)酵溫度30°C ；步驟三大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)將上述種子罐發(fā)酵培養(yǎng)好的培養(yǎng)液按照大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵罐所用培養(yǎng)基的體積比10%接種量接入大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵罐培養(yǎng)，大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵罐所用培養(yǎng)基配方為玉米粉 20g/L、豆餅粉 50g/L、MgSO4 · 7H20 O. 5g/L，MnSO4 · H2O 10g/L ;培養(yǎng)條件溶氧量為15 18%，攪拌速度200rpm，發(fā)酵溫度30°C;培養(yǎng)至最終生物量為IO9Cfu/ 克，芽孢形成率達(dá)到98%以上，發(fā)酵完成；步驟四后處理將經(jīng)大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)液進(jìn)行過濾，噴霧干燥即得原粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的可濕性粉劑，其特征在于，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的原粉70重量份， 輕質(zhì)碳酸韓34重量份,十二燒基苯磺酸鈉2. 5重量份,磷酸二氫鉀I重量份,磷酸氫二鉀1.5重量份，分散劑亞甲基雙甲基萘磺酸鈉3重量份。
3.根據(jù)權(quán)利要求2或3的可濕性粉劑，其中所述甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的原粉中甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌含量為200-1000億活芽孢/克。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3的可濕性粉劑防治柑橘病害的用途。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的用途，所述柑橘病害為柑橘潰瘍病。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的可濕性粉劑，其特征在于，所述可濕性粉劑采用特定方法制得的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的原粉、輕質(zhì)碳酸鈣、十二烷基苯磺酸鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀和分散劑亞甲基雙甲基萘磺酸鈉2-3重量份組成。進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及所述可濕性粉劑防治柑橘病害，特別是柑橘潰瘍病的用途。
文檔編號(hào)A01P1/00GK103039530SQ201210579898
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月27日
發(fā)明者唐滿倉, 沈小英, 馬玉明, 安德榮 申請人:陜西恒田化工有限公司