專(zhuān)利名稱(chēng)：蟲(chóng)生真菌菌核的培養(yǎng)方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及蟲(chóng)生真菌菌核的培養(yǎng)方法及其在防治害蟲(chóng)方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著化學(xué)農(nóng)藥的大量使用導(dǎo)致環(huán)境污染和害蟲(chóng)抗藥性等問(wèn)題日益突出，生物防治越來(lái)越受到人們的重視。西花薊馬Frankliniella occidentalis (Pergande) (Thysanoptera =Thripidae)是世界性的多種經(jīng)濟(jì)作物上的一種重要害蟲(chóng)。西花薊馬通過(guò)銼吸取食和傳播植物病毒對(duì)作物造成嚴(yán)重為害。西花薊馬的生活史包括地上取食階段(成蟲(chóng)，1齡和2齡若蟲(chóng))和土棲階段O齡若蟲(chóng)末期，預(yù)蛹和蛹)。大部分西花薊馬的老熟2齡若蟲(chóng)都表現(xiàn)出正趨地性和負(fù)趨光性，從植物上轉(zhuǎn)移到土壤或盆栽介質(zhì)中化蛹。依據(jù)寄主植物種類(lèi)的不同，最多有98%的薊馬在地下化蛹，并分布在1. 5 2. Ocm深的土層中，直到發(fā)育為成蟲(chóng)后從土壤中羽化出來(lái)再轉(zhuǎn)移到地上為害。此外，由于反復(fù)頻繁地施用化學(xué)藥劑，該蟲(chóng)已發(fā)展出對(duì)多種化學(xué)殺蟲(chóng)劑具抗性的種群。利用昆蟲(chóng)病原真菌防治害蟲(chóng)是生物防治的重要手段之一。蠟蚧輪枝菌(Verticillium lecanii)是地理分布和寄主范圍極廣的病原真菌，具有極大的生防潛力。在對(duì)害蟲(chóng)高致病力的蟲(chóng)生真菌菌株商品化過(guò)程中，通常是將分生孢子加工成各種劑型或者制成有保護(hù)性外殼的微膠囊等。然而，無(wú)論是通過(guò)改變培養(yǎng)條件來(lái)增強(qiáng)孢子的抗逆性，還是通過(guò)添加某種化合物使其穩(wěn)定性增加等手段，都不能從根本上改變分生孢子易失活，貨架期短這樣一個(gè)現(xiàn)狀。因此，在害蟲(chóng)生防的實(shí)際應(yīng)用中，有必要發(fā)展和應(yīng)用真菌分生孢子以外的其它發(fā)育階段作為侵染源。菌核(microsclerotia，MS)是由真菌菌絲聚集、絞纏而形成的堅(jiān)硬的休眠結(jié)構(gòu)， 具有極端耐旱等特性。微菌核本身是沒(méi)有侵染性的。但是經(jīng)過(guò)復(fù)水后，能產(chǎn)生菌絲或萌發(fā)出對(duì)靶標(biāo)寄主有侵染性的分生孢子。到目前為止，還沒(méi)有蠟蚧輪枝菌在自然條件下或?qū)嶒?yàn)室內(nèi)形成(微)菌核的任何報(bào)道。以昆蟲(chóng)病原真菌菌核防治西花薊馬等害蟲(chóng)，可以簡(jiǎn)化抗蟲(chóng)制劑的生產(chǎn)工藝，降低成本，并對(duì)環(huán)境沒(méi)有污染，因此，具有廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)分生孢子作為昆蟲(chóng)病原真菌殺蟲(chóng)劑的繁殖體存在的缺陷，本發(fā)明提供了一種液體培養(yǎng)蟲(chóng)生真菌菌核的技術(shù)，所述蟲(chóng)生真菌優(yōu)選為蠟蚧輪枝菌。本發(fā)明所提供的蟲(chóng)生真菌菌核的液體培養(yǎng)方法，需要將液體培養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件控制在一定的范圍內(nèi)。培養(yǎng)出的菌核經(jīng)過(guò)真空干燥后，可以長(zhǎng)期貯藏，在適宜的條件下仍然能萌發(fā)出菌絲和有致病力的分生孢子，該技術(shù)成本低，菌核貯藏期長(zhǎng)，非常適合推廣普及。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)一種蟲(chóng)生真菌菌核的培養(yǎng)方法，其特征是包括以下步驟1) 一級(jí)平板菌種培養(yǎng)； 2)液體種子培養(yǎng)；幻液體培養(yǎng)菌核；4)菌核的干燥。所述蟲(chóng)生真菌包括任何昆蟲(chóng)病原真菌，優(yōu)選為蠟蚧輪枝菌。
所述一級(jí)平板菌種培養(yǎng)是將分離純化的菌種接種于PDA培養(yǎng)基平板上，待菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)平板并產(chǎn)孢時(shí)，轉(zhuǎn)入搖瓶培養(yǎng)。培養(yǎng)條件按照真菌常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，例如，可放入25°C培養(yǎng)箱，培養(yǎng)10-14天。所述液體種子培養(yǎng)是在培養(yǎng)瓶中裝入液體種子培養(yǎng)基，接入平板菌種，接種后于恒溫?fù)u床培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度22-28°C，搖床震蕩頻率150-300rpm，培養(yǎng)時(shí)間3_4天；優(yōu)選為培養(yǎng)溫度25°C，搖床震蕩頻率150rpm。所述液體培養(yǎng)菌核是將步驟2中培養(yǎng)好的搖瓶種子接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度22-28°C，搖床震蕩頻率150-300rpm，培養(yǎng)時(shí)間3-4天；優(yōu)選為培養(yǎng)溫度25°C， 搖床震蕩頻率300rpm。所述菌核的干燥是將液體發(fā)酵好的產(chǎn)物抽真空過(guò)濾到濾紙上，將其放入抽真空干燥儀中干燥。條件為溫度22-25°C，干燥2小時(shí)后取出，測(cè)得含水量為2. 5-7. 5%，優(yōu)選 5. 0%。一級(jí)菌種培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為微生物培養(yǎng)時(shí)常用的PDA培養(yǎng)基，其成分和含量均是公知的，可通過(guò)教科書(shū)或?qū)嶒?yàn)手冊(cè)查得。液體種子培養(yǎng)時(shí)所用的液體種子培養(yǎng)基組成包括玉米粉30_40g，酵母浸膏 5-15g, KH2P042-6g, MgSO4 · 7H20 0. 4-0. 8g, FeSO4 · 7H20 12_16mg，ZnSO4 · 7H20 12_16mg 禾口 1000ml 水，優(yōu)選玉米粉 35g，酵母浸膏 10g, KH2PO4 4g，MgSO4 0. 6g，F(xiàn)eSO4 14mg，ZnSO4 Hmg 和 1000ml 水。液體培養(yǎng)菌核時(shí)所用的液體培養(yǎng)基組成包括葡萄5-10g、小于500 μ m的麥麩 10-15g、KH2PO4 2-6g, MgSO4 · 7H20 0. 4-0. 8g, FeSO4 · 7H20 12_16mg，ZnSO4 · 7H20 12_16mg 和 1000ml 水，優(yōu)選 7. 5g 葡萄糖、小于 500 μ m 的麥麩 12. 5g、KH2PO4 4g，MgSO4 · 7H20 0. 6g， FeSO4 · 7H20 14mg, ZnSO4 · 7H20 14mg 和 1000ml 水。本發(fā)明還涉及通過(guò)上述培養(yǎng)方法獲得的蟲(chóng)生真菌菌核在制備防治害蟲(chóng)的生防制劑中的應(yīng)用，所述蟲(chóng)生真菌優(yōu)選蠟蚧輪枝菌，所述害蟲(chóng)優(yōu)選西花薊馬。本發(fā)明還進(jìn)一步涉及一種防治害蟲(chóng)的生防制劑，其特征在于，包括通過(guò)上述培養(yǎng)方法獲得的蟲(chóng)生真菌菌核和輔料。所述蟲(chóng)生真菌菌核優(yōu)選蠟蚧輪枝菌菌核，所述害蟲(chóng)優(yōu)選西花薊馬；所述輔料是抗蟲(chóng)制劑制備領(lǐng)域常用的輔助試劑，本領(lǐng)域的技術(shù)人員完全可以根據(jù)制劑的類(lèi)型選擇相應(yīng)的輔料類(lèi)型。本發(fā)明所用的真菌菌株和蟲(chóng)源，如蠟蚧輪枝菌和西花薊馬，均屬于公知公用的實(shí)驗(yàn)材料，可通過(guò)常規(guī)的途徑獲得，如商業(yè)途徑等。例如，實(shí)施例中所用的蠟蚧輪枝菌購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所。本發(fā)明首次用液體深層發(fā)酵法能產(chǎn)生蟲(chóng)生真菌菌核。干燥制備的微菌核能夠保持活力，復(fù)水后能夠萌發(fā)出菌絲和孢子，增加了上述真菌作為西花薊馬土棲階段防治因子的潛力。該生產(chǎn)過(guò)程工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，生產(chǎn)過(guò)程中無(wú)污染性廢料產(chǎn)生，十分環(huán)保。用該方法獲得的蟲(chóng)生真菌防治西花薊馬等害蟲(chóng)，可以減少化學(xué)農(nóng)藥對(duì)植物和環(huán)境的污染，對(duì)人和動(dòng)物沒(méi)有傷害，因此，本發(fā)明具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1在搖床上液體深層培養(yǎng)時(shí)蠟蚧輪枝菌菌核的發(fā)育。
4
(A) 48h內(nèi)，菌絲密度增加；⑶72h時(shí)，菌絲開(kāi)始聚集形成菌核；(C) 92h時(shí)，菌核聚集更加緊密。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所用的真菌菌株和蟲(chóng)源，如蠟蚧輪枝菌和西花薊馬，均屬于公知公用的實(shí)驗(yàn)材料，可通過(guò)常規(guī)的途徑獲得，如商業(yè)途徑等。實(shí)施例中所用的蠟蚧輪枝菌購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所。實(shí)施例1蠟蚧輪枝菌菌核的培養(yǎng)1.方法 1 1. 1 一級(jí)平板菌種培養(yǎng)將分離純化的菌種接種于PDA培養(yǎng)基平板上，放入25°C培養(yǎng)箱，培養(yǎng)10_14天，待菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)平板并產(chǎn)孢時(shí)，轉(zhuǎn)入搖瓶培養(yǎng)。1. 2液體種子培養(yǎng)在IOOOml三角瓶中，裝入200ml的液體種子培養(yǎng)基，接入平板菌種，接種量為 IOOOml三角瓶接入1/8體積培養(yǎng)好的一級(jí)平板菌種，接種后置于恒溫?fù)u床，培養(yǎng)條件為 25°C，150rpm，培養(yǎng) 3-4 天；所用液體種子培養(yǎng)基組成玉米粉35g，酵母浸骨10g，KH2PO4 4g，MgSO4 · 7H20 0. 6g ；FeSO4 · 7H20 14mg, ZnSO4 · 7H20 14mg 和 1000ml 水。121°C高壓滅菌 15 分鐘，待冷卻至室溫后接種。1. 3液體培養(yǎng)菌核在IOOOml三角瓶中，裝入200ml的液體培養(yǎng)基，將步驟2中培養(yǎng)好的IOOul搖瓶種子接入培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度25°C，搖床震蕩頻率為300rpm，培養(yǎng)時(shí)間為4天。所用液體培養(yǎng)基組成7.5g葡萄糖、小于500μπι的麥麩10、12.5或158三個(gè)梯度、 KH2PO4,4g, MgSO4 · 7Η20，0· 6g ；FeSO4 · 7H20 14mg, ZnSO4 · 7H20,14mg 禾口 1000ml 水。121°C高壓滅菌15分鐘，待冷卻至室溫后接入液體種子。1.4菌核的干燥將液體發(fā)酵好的產(chǎn)物抽真空過(guò)濾到濾紙上，將其放入抽真空干燥儀中干燥，溫度為室溫02-25 °C )，干燥2小時(shí)后取出，測(cè)得含水量為5. 0%。結(jié)果在液體菌核培養(yǎng)步驟中，所用液體培養(yǎng)基中小于500 μ m的麥麩用量分別存在三個(gè)梯度，上述不同梯度下菌核產(chǎn)量分別為2. 9 X 105，3. 1 X IO5和33 X IO5個(gè)菌核/克菌。 生產(chǎn)周期為4天。2.方法 2 2. 1 一級(jí)平板菌種培養(yǎng)與實(shí)施例1中所述方法相同。2. 2液體種子培養(yǎng)與實(shí)施例1中所述方法相同。2. 3液體發(fā)酵培養(yǎng)與實(shí)施例1中所述方法相同，不同的是搖床震蕩頻率為 150rpmo2. 4菌核的干燥方法與實(shí)施例1中所述方法相同。結(jié)果在液體菌核培養(yǎng)步驟中，所用液體培養(yǎng)基中小于500 μ m的麥麩用量分別存在三個(gè)梯度，上述不同梯度下菌核產(chǎn)量分別為2. 8X 105，2. 9X IO5和3. 1 X IO5個(gè)菌核/克
5菌。生產(chǎn)周期為4天。3.菌核觀察蠟蚧輪枝菌液體種子接到培養(yǎng)液中后培養(yǎng)物的形成遵循這樣一個(gè)模式(圖1) :48h內(nèi)，菌絲密度增加；7 時(shí)，菌絲開(kāi)始聚集形成菌核；9 時(shí)，菌核聚集更加緊密。形成的蠟蚧輪枝菌微菌核大小不同，直徑范圍為50 300 μ m。實(shí)施例2生測(cè)試驗(yàn)(生測(cè)效率的檢測(cè))西花薊馬的飼養(yǎng)在0. 5L的筒形玻璃容器中放入3 4根豆莢，將薊馬成蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到容器內(nèi)產(chǎn)卵，容器放置在生長(zhǎng)箱中，培養(yǎng)條件設(shè)置為溫度沈"C，相對(duì)濕度60 % 70 %，光周期為L(zhǎng) D = 13 11，產(chǎn)卵1 后去除成蟲(chóng)以確保幼蟲(chóng)齡期的一致。8d后收集2齡2d 的幼蟲(chóng)(L2)備用。將蛭石、粘壤土和營(yíng)養(yǎng)土按2 1 1的比例混合。將MS-DE顆粒均勻加入到混配的土壤中，混合比率為ΙΟΟμ g/100g 土。將上述混合物裝入塑料花盆中，并均勻噴灑無(wú)離子水，直到盆底有水份滲出為止。將花盆放入塑料托盤(pán)中，經(jīng)常加水保持托盤(pán)中持續(xù)有水， 并能被虹吸到塑料盆中。對(duì)照土壤同樣處理，但不加入MS-DE顆粒。菌核混合到土壤中7d(以充分產(chǎn)孢)后，用細(xì)毛刷將30頭L2薊馬幼蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到一小段豆莢上(作為食物)，豆莢放到上述裝盆土壤的表面。盆上扣透明的兩端開(kāi)放的圓筒形塑料容器，塑料容器上端罩有防薊馬尼龍紗(120目)。在塑料容器內(nèi)壁上端加有一塊黃色粘蟲(chóng)板以誘捕羽化的成蟲(chóng)。罩有塑料容器的塑料盆放在生長(zhǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件設(shè)置同上。 每個(gè)處理重復(fù)次，整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，2次重復(fù)分別記為實(shí)驗(yàn)1和2。接入L2幼蟲(chóng)4d后，薊馬成蟲(chóng)開(kāi)始羽化，并粘到塑料容器內(nèi)的粘蟲(chóng)板上，或者在土壤表面或者在塑料容器的內(nèi)邊，每天用放大鏡觀察成蟲(chóng)羽化，連續(xù)7d直到再也沒(méi)有薊馬成蟲(chóng)出現(xiàn)。從土壤表面或塑料容器內(nèi)邊收集到的蛹和成蟲(chóng)都放到粘蟲(chóng)板上，連同誘到成蟲(chóng)的粘蟲(chóng)板一起放在襯有濕濾紙的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)(25°C )以檢測(cè)它們是否是被蠟蚧輪枝菌侵染致死。統(tǒng)計(jì)被真菌感染致死的僵蟲(chóng)和健康成蟲(chóng)。統(tǒng)計(jì)分析用對(duì)照的土壤中羽化出的成蟲(chóng)數(shù)減去處理的土壤中得到的羽化成蟲(chóng)數(shù)，得到薊馬累積死亡數(shù)。所得的死亡率進(jìn)行正弦轉(zhuǎn)換。培養(yǎng)液中生物量，芽孢和MS產(chǎn)量，干燥的MS-DE 顆粒的分生孢子產(chǎn)量以及薊馬死亡率的平均數(shù)均采用單一變量方差分析——最小顯著差測(cè)驗(yàn)(SPSS 10. 0，One-way ANOVA :LSD tests)。結(jié)果用蠟蚧輪枝菌微菌核處理的土壤中西花薊馬土棲階段的死亡率明顯高于對(duì)照(表1)，表明蠟蚧輪枝菌微菌核具有殺蟲(chóng)的潛力。表1用蠟蚧輪枝菌微菌核處理的土壤中西花薊馬土棲階段的死亡率(平均數(shù)士
標(biāo)準(zhǔn)誤)
微丨 核處fl! Trcalcd with MS對(duì)照 Control實(shí)驗(yàn)1實(shí)驗(yàn)281.2 士 3.8b83.5±5.9b4.8 士 1.3a 注同行不同字母表示在0. 05水平差異顯著(ρ < 005)。
權(quán)利要求
1.一種蟲(chóng)生真菌菌核的培養(yǎng)方法，其特征是包括以下步驟1) 一級(jí)平板菌種培養(yǎng)；2) 液體種子培養(yǎng)；幻液體培養(yǎng)菌核；4)菌核的干燥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征是所述蟲(chóng)生真菌為蠟蚧輪枝菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)方法，其特征是所述一級(jí)平板菌種培養(yǎng)是將分離純化的菌種接種于PDA培養(yǎng)基平板上，待菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)平板并產(chǎn)孢時(shí)，轉(zhuǎn)入搖瓶培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一所述的培養(yǎng)方法，其特征是所述液體種子培養(yǎng)是在培養(yǎng)瓶中裝入液體種子培養(yǎng)基，接入平板菌種，接種后于恒溫?fù)u床培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度 22-280C，搖床震蕩頻率150-300rpm，培養(yǎng)時(shí)間3_4天；優(yōu)選為培養(yǎng)溫度25°C，搖床震蕩頻率 150rpmo
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的培養(yǎng)方法，基特征是所述液體培養(yǎng)菌核是將步驟2中培養(yǎng)好的搖瓶種子接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度22-28°C，搖床震蕩頻率 150-300rpm，培養(yǎng)時(shí)間3_4天；優(yōu)選為培養(yǎng)溫度25°C，搖床震蕩頻率300rpm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5所述的培養(yǎng)方法，其特征是步驟O)中的液體種子培養(yǎng)基組成包括玉米粉 30-40g,酵母浸膏 5-15g，KN2PO4 2. 6g，MgSO4 · 7H20 0. 4-0. 8g，F(xiàn)eSO4 · 7H20 12-16mg, ZnSO4 · 7H20 12_16mg 和 1000ml 水；優(yōu)選為包括玉米粉 35g，酵母浸膏 10g, KH2PO4 4g, MgSO4 · 7Η200· 6g, FeSO4 · 7H20 14mg, ZnSO4 · 7H20 14mg 和 1000ml 水。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的培養(yǎng)方法，其特征是步驟(3)中的液體培養(yǎng)基組成包括 5-10g 葡萄糖，小于 500 μ m 的麥麩 10-15g，KH2PO4 2_6g，MgSO4 · 7H20 0. 1-0. 8g， FeSO4 · 7H2012-16mg，ZnSO4 · 7H20 12_16mg 和 1000ml 水；優(yōu)選為包括 7. 5g 葡萄糖，小于 500 μ m 的麥麩 12. 5g, KH2PO4,4g, MgSO4 · 7H20 0. 6g, FeSO4 · 7H20 14mg, ZnSO4 · 7H20 14mg 和 1000ml 水。
8.用上述權(quán)利要求1-7所述培養(yǎng)方法獲得的蟲(chóng)生真菌菌核在制備防治害蟲(chóng)的生防制劑中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，基特征是所述蟲(chóng)生真菌為蠟蚧輪枝菌。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，其特征是所述害蟲(chóng)為西花薊馬。
11.一種防治害蟲(chóng)的生防制劑，其特征是，包括通過(guò)上述權(quán)利要求1-7所述培養(yǎng)方法獲得的蟲(chóng)生真菌菌核和輔料。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的生防制劑，其特征是，所述蟲(chóng)生真菌菌核為蠟蚧輪枝菌菌核。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的生防制劑，其特征是，所述害蟲(chóng)為西花薊馬。
全文摘要
針對(duì)分生孢子作為昆蟲(chóng)病原真菌殺蟲(chóng)劑的繁殖體存在的缺陷，本發(fā)明提供了一種液體培養(yǎng)蟲(chóng)生真菌菌核的技術(shù)，所述蟲(chóng)生真菌可以是蠟蚧輪枝菌。本發(fā)明所提供的蟲(chóng)生真菌菌核的液體培養(yǎng)方法，需要將液體培養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件控制在一定的范圍內(nèi)。培養(yǎng)出的菌核經(jīng)過(guò)真空干燥后，可以長(zhǎng)期貯藏，在適宜的條件下仍然能萌發(fā)出菌絲和有致病力的分生孢子。該技術(shù)成本低，菌核貯藏期長(zhǎng)，非常適合推廣普及。
文檔編號(hào)A01P7/04GK102206586SQ201110101659
公開(kāi)日2011年10月5日 申請(qǐng)日期2011年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月22日
發(fā)明者王海鴻, 問(wèn)錦曾, 雷仲仁 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所