專利名稱：防治番茄根結線蟲的拮抗菌及其微生物有機肥料的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種防治番茄根結線蟲的拮抗菌及其微生物有機肥料，屬于農業(yè)集約化生產技術，專用于防治番茄根結線蟲的危害。背景技術：
根結線蟲是危害作物的主要土傳病害之一。根結線蟲在全世界各地和大部分作物上都有發(fā)生，每年造成全世界糧食產量和經濟收入的巨大損失。根結線蟲侵染根系后，嚴重影響植株根系的發(fā)育，出現(xiàn)大量根結現(xiàn)象，導致植株對水分和養(yǎng)分的吸收受阻，植株出現(xiàn)矮小黃化現(xiàn)象。作物連作后，隨著連作年限的增加，根結線蟲在植物根系中產生大量的蟲卵并孵化出來，土壤中二齡幼蟲數(shù)量逐年積累，危害逐年加重，常造成作物大量減產，甚至死苗。研究結果表明，連作番茄根結線蟲病害的關鍵問題不是養(yǎng)分缺乏或營養(yǎng)不平衡，也不是土壤次生鹽漬化問題，而是土壤中的微生物區(qū)系變化及其次生代謝物質的致毒問題。另一方面，水稻、小麥、玉米、油菜等作物秸稈就地焚燒、規(guī)模化養(yǎng)殖后的畜禽糞便隨地棄置等，使大量的養(yǎng)分資源流失于土壤-植物系統(tǒng)之外，不僅嚴重污染了環(huán)境，也極大地浪費了能作為有機肥和生物有機肥生產原料的有機物資源，不利于我國農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。如何將從土壤中因作物收獲而取走的營養(yǎng)元素最大限度地歸還到土壤中去，唯一的途徑就是將這些固體有機廢棄物制成商品有機肥料再施入土壤。將這些固體有機廢棄物經過高溫發(fā)酵合成高品位的有機堆肥，再用作功能菌的載體，制成功能明確的微生物有機肥料， 具有廣闊的應用前景。三
發(fā)明內容
1.技術問題
本發(fā)明的目的是提供一種能防治連作番茄根結線蟲的拮抗菌及其微生物有機肥料，使連作番茄根結線蟲的根結發(fā)病指數(shù)減少，使大量的設施農業(yè)土壤和露地番茄連作障礙土壤得到較大程度的生物修復，確保集約化農業(yè)的順利發(fā)展。技術方案
能防治連作番茄根結線蟲的拮抗菌仍，屬于蠟狀芽孢桿菌OfeciBm caries)，保藏日期2010年9月14日，保藏號CGMCC 4161 ；地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。拮抗菌)(5的主要形態(tài)特性為革蘭氏染色陽性G+，能運動，有側生鞭毛，形狀為桿狀，產芽孢，菌落呈乳白色，圓形，邊緣不整齊，表面濕潤光滑。拮抗菌)(5的主要生理生化特性革蘭氏染色陽性G+，細胞形狀為桿狀，芽孢中生， 接觸酶陽性、V. P.反應陰性，甲基紅試驗陽性，吲哚試驗陽性，發(fā)酵葡萄糖、木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇產酸，能利用檸檬酸鹽，硝酸還原酶陽性，淀粉水解陽性，明膠水解陽性，分解酪蛋白陽性，油脂水解陽性，苯丙氨酸脫氫酶試驗陰性。用上述拮抗菌)(5生產的防治番茄根結線蟲的微生物有機肥料，該肥料中含有 IXlO8 Cfu · g—1以上的拮抗菌、全氮質量比含量為4飛％，全氮中質量比90%以上為有機氮， 總氮磷鉀養(yǎng)分質量比為6 10%、有機質質量比含量為3(Γ35%。
所述以上微生物有機肥料的生產方法，包括
1)拮抗菌X5分別接種到改良的牛肉膏液體培養(yǎng)基，進行發(fā)酵生產，其發(fā)酵生產的條件為pH 6. 8^7. 5,培養(yǎng)溫度3(T35°C，攪拌速度為18(T300 rpm，發(fā)酵中后期形成芽孢，發(fā)酵液中的拮抗菌含菌或芽孢量SIXIOki Cfumr1 ；改良的牛肉膏液體培養(yǎng)基的配制方法稱量2. 0克牛肉膏，玉米粉5. 0克，麥麩5. 0克，土豆淀粉5. 0克，氯化鈉5. 0于燒杯中，攪拌， 使之充分溶解混勻，PH值調至7. 2^7. 4，并用自來水定容至1000 ml, 121°C滅菌20 min。2)將拮抗菌X5發(fā)酵液與腐熟后的豬糞堆肥和菜粕微生物酶解物的混合物進行固體發(fā)酵，每噸固體有機物料中加入)(5發(fā)酵液^L，混合均勻，固體發(fā)酵過程中每天翻堆1次， 使固體發(fā)酵溫度不超過50°C，發(fā)酵5天后結束，使拮抗菌X5含量達到1 X IO8 cfu 以上， 獲得含拮抗菌)(5的微生物有機肥。將此微生物有機肥在低于60°C下干燥至30%的含水量， 包裝出廠即為能防治番茄根結線蟲的微生物有機肥。其中
腐熟后的豬糞堆肥發(fā)芽指數(shù)為98%以上，有機質質量比含量> 35%，有機氮質量比含量為1. 2 2%，含水量質量比25 30%。菜粕微生物酶解物的制備方法將保藏號為CGMCC NO. 1543的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞 MUtenotrophomonas maltophiIia)菌株37_1發(fā)酵液加入到菜粕原料中，調節(jié)含水量 55飛5%和pH 6. (Γ7. 5，進行開放式固體發(fā)酵，待發(fā)酵溫度上升至50°C時立即開始翻堆，以后每天翻堆，使堆溫始終維持在35飛0°C共5天，固體發(fā)酵開始后，堆物的pH會不斷上升，每次翻堆時用含酸液體調節(jié)含水量和PH，使它們分別維持在55飛5%和6. (Γ7. 0，發(fā)酵終止時再用含酸液體進行噴灑，直至堆物PH調整為5. 0左右，再進行低溫干燥或自然涼干，即為菜粕微生物酶解物；
腐熟的豬糞堆肥和菜粕微生物酶解物的混合物制備方法將腐熟的豬糞堆肥與菜粕微生物酶解物按體積比5(Γ70% 5(Γ30%的比例充分混合，并后熟2 3天，后熟過程中翻堆2 次。用上述拮抗菌)(5微生物有機肥料專用于防治番茄根結線蟲病。有益效果
本發(fā)明涉及一種能克服或防治連作番茄根結線蟲的微生物有機肥料及其生產方法，其產品具有如下優(yōu)點
1)肥料產品中含有抑制番茄根結線蟲生長的高效拮抗菌株)(5，其抑制效果顯著，肥料中該菌株的含量達到IXlO8 cfu · g—1以上，施入土壤后能形成優(yōu)勢群，并在土壤中存活下來。2)肥料產品中含有豐富的可溶性有機碳和有機氮，能給功能菌提供十分優(yōu)越的生長環(huán)境，極大地提高了功能菌在土壤中的定殖和活力。3)本發(fā)明產品全磷和全氮含量較高，均達到4%。本產品原料之一為腐熟的豬糞堆肥，全磷和有效磷含量高，在制成的微生物有機肥料產品中無需添加任何含磷化肥，使用本產品后能使作物順利度過苗期磷素敏感期。本產品原料之一為菜粕微生物酶解物，不僅全氮含量高，而且含有豐富的氨基酸和小分子多肽，確保了肥料氮素持續(xù)穩(wěn)定的供應，使作物生長和抗逆能力大大增強。4)研究結果表明，在根結線蟲危害嚴重的土壤上施用本產品后，番茄根結指數(shù)減少40%，每株卵塊數(shù)量減少68%，每卵塊蟲卵數(shù)量減少58%，并且植株長勢良好。連續(xù)施用本肥料可有效控制根結線蟲病害的發(fā)生。四

圖1拮抗菌)(5
a產膠原蛋白酶；b菌體電鏡觀察結果
圖2拮抗菌)(5對根結線蟲蟲卵胚胎發(fā)育的影響(A、B、C、D為蟲卵孵化過程四個階段) a菌株)(5菌體處理后蟲卵結構變化 b菌株)(5上清液處理后蟲卵結構變化 c無菌水處理后蟲卵結構變化圖3拮抗菌對蟲卵孵化率的影響圖4拮抗菌對二齡蟲死亡率的影響五具體實施方式
(一)菌株的分離和鑒定
拮抗菌株的獲得從番茄根結線蟲發(fā)病田塊中的健康番茄植株根際土壤初篩能產生膠原蛋白酶的拮抗菌株(圖1)，然后通過盆栽試驗復篩進一步驗證拮抗菌株)(5生防效果(表 1)，最終獲得拮抗菌)(5并進行鑒定，菌種凍干-20°C保存。該菌在肉牛膏液體培養(yǎng)基發(fā)酵 60 h后，其過濾液對根結線蟲蟲卵胚胎的正常發(fā)育有顯著的破壞效果，阻礙蟲卵的正常孵化(圖2)，并且能降低蟲卵孵化率(圖3)和對二齡幼蟲有直接致死作用(圖4)。拮抗菌)(5屬于蠟狀芽孢桿菌(feciBm⑶rem)，主要生物學特性為革蘭氏染色陽性G+，細胞形狀為桿狀，芽孢中生，兼性厭氧生長，接觸酶陽性，V. P.反應陰性，甲基紅試驗陽性，噴哚試驗陽性，發(fā)酵葡萄糖、木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇產酸，能利用檸檬酸鹽，硝酸還原酶陽性，淀粉水解陽性，明膠水解陽性，分解酪蛋白陽性，油脂水解陽性，苯丙氨酸脫氫酶試驗陰性。(二)菌劑生產
1)拮抗菌私分別接種到改良的牛肉膏液體培養(yǎng)基，進行發(fā)酵生產，其發(fā)酵生產的條件為pH 6. 8^7. 5,培養(yǎng)溫度3(T35°C，攪拌速度為18(T300 rpm，發(fā)酵中后期形成芽孢，發(fā)酵液中的拮抗菌含菌或芽孢量SIXIOki Cfumr1 ；改良牛肉膏液體培養(yǎng)基的配制方法稱量 2. 0克牛肉膏，玉米粉5. 0克，麥麩5. 0克，土豆淀粉5. 0克，氯化鈉5. 0克于燒杯中，攪拌， 使之充分溶解混勻，PH值調至7. 2^7. 4，并用自來水定容至1000 ml, 121°C滅菌20 min。2)將拮抗菌X5發(fā)酵液與腐熟后的豬糞堆肥和菜粕微生物酶解物的混合物進行固體發(fā)酵，每噸固體有機物料中加入)(5發(fā)酵液^L，混合均勻，固體發(fā)酵過程中每天翻堆1次， 使固體發(fā)酵溫度不超過50°C，發(fā)酵5天后結束，使拮抗菌X5含量達到1 X IO8 cfu 以上， 獲得含拮抗菌)(5的微生物有機肥。將此微生物有機肥在低于60°C下干燥至30%的含水量， 包裝出廠即為能防治番茄根結線蟲的微生物有機肥。其中
腐熟后的豬糞堆肥由江蘇新天地生物肥料工程中心有限公司提供，本品發(fā)芽指數(shù)為 98%以上，有機質質量比含量> 35%，有機氮質量比含量為1. 2 2%，含水量質量比25 30%。菜粕微生物酶解物的制備方法(公知公用，見發(fā)明專利ZL200610086126. 0，一種農用氨基酸的生物制取方法及其肥料產品)將保藏號為CGMCC NO. 1543的嗜麥芽寡養(yǎng)單 rnMQStenotrophomorms maltophilia)菌株37_1發(fā)酵液加入到菜粕原料中，調節(jié)含水量 55飛5%和pH 6. (Γ7. 5，進行開放式固體發(fā)酵，待發(fā)酵溫度上升至50°C時立即開始翻堆，以后每天翻堆，使堆溫始終維持在35飛0°C共5天，固體發(fā)酵開始后，堆物的PH會不斷上升，每次翻堆時用含酸液體調節(jié)含水量和PH，使它們分別維持在55飛5%和6. (Γ7. 0，發(fā)酵終止時再用含酸液體進行噴灑，直至堆物PH調整為5. 0左右，再進行低溫干燥或自然涼干，即為菜粕微生物酶解物；
腐熟的豬糞堆肥和菜粕微生物酶解物的混合物制備方法將腐熟的豬糞堆肥與菜粕微生物酶解物按體積比5(Γ70% 5(Γ30%的比例充分混合，并后熟2 3天，后熟過程中翻堆2 次。上述能防治番茄根結線蟲的微生物有機肥產品中含有IXlO8 Cfu · g—1以上的拮抗菌、全氮質量比含量為4 5%，全氮中質量比90%以上為有機氮，總氮磷鉀養(yǎng)分質量比為 6 10%、有機質質量比含量為30 35%。
(三)溫室盆栽試驗盆栽試驗設置以下處理 對照根結線蟲發(fā)病土壤；
處理1:根結線蟲發(fā)病土壤+不加拮抗菌)(5的常規(guī)“田娘”牌有機肥；
處理2:根結線蟲發(fā)病土壤+拮抗菌)(5菌懸液；
處理3:根結線蟲發(fā)病土壤+拮抗菌X5微生物有機肥(本發(fā)明產品)。盆栽試驗中，拮抗菌X5菌懸液處理以IX IO8 cfu 土的劑量均勻拌入根結線蟲發(fā)病嚴重的土壤中；本發(fā)明肥料產品以1的施用量(w /w)均勻拌入根結線蟲發(fā)病嚴重的土壤中。三天后，將已長有3片真葉的番茄幼苗移入盆缽中，每個處理重復5次。在溫室中生長45天(25 30°C )后采樣，測定各項指標，統(tǒng)計生物防治效果，整個實驗重復3次，盆栽試驗結果如表1。
權利要求
1.能防治番茄根結線蟲的拮抗菌菌株)(5，屬于蠟狀芽孢桿菌OfeciBmcaries)，保藏日期2010年9月14日，保藏號CGMCC No. 4161 ；拮抗菌)(5屬于蠟狀芽孢桿菌OfeciBm carem)，主要形態(tài)特性為革蘭氏陽性G+，能運動，有側生鞭毛，形狀為桿狀，產芽孢，菌落呈乳白色，圓形，邊緣不整齊，表面濕潤光滑；生理生化特征接觸酶陽性、V. P.反應陰性，甲基紅試驗陽性，吲哚試驗陽性，發(fā)酵葡萄糖、木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇產酸，能利用檸檬酸鹽，硝酸還原酶陽性，淀粉水解陽性，明膠水解陽性，分解酪蛋白陽性，油脂水解陽性，苯丙氨酸脫氫酶試驗陰性。
2.用權利要求1所述拮抗菌X5生產的微生物有機肥料。
3.根據(jù)權利要求2所述的微生物有機肥料，拮抗菌)(5數(shù)量為IXlO8Cfi^g-1以上，全氮質量比含量為4飛％，全氮中質量比90%以上為有機氮，總氮磷鉀養(yǎng)分質量比為6 10%、有機質質量比含量為30 35%。
4.權利要求2或3所述微生物有機肥料的生產方法，包括將權利要求1所述的拮抗菌)(5分別接種到改良的牛肉膏液體培養(yǎng)基，進行發(fā)酵生產， 其發(fā)酵生產的條件為pH 6. 8^7. 5,培養(yǎng)溫度3(T35°C，攪拌速度為18(T300 rpm，發(fā)酵中后期形成芽孢，發(fā)酵液中的拮抗菌含菌或芽孢量> IXlO10 cfu · πιΓ1 ；2)將拮抗菌X5發(fā)酵液與腐熟后的豬糞堆肥和菜粕微生物酶解物的混合物進行固體發(fā)酵，每噸固體有機物料中加入)(5發(fā)酵液55L，混合均勻，固體發(fā)酵過程中每天翻堆1次，使固體發(fā)酵溫度不超過50°C，發(fā)酵5天后結束，使拮抗菌X5含量達到1 X IO8 cfu · g—1以上，獲得含拮抗菌X5的微生物有機肥，將此微生物有機肥在低于60°C下干燥至30%的含水量，包裝出廠即為能防治番茄根結線蟲的微生物有機肥，其中腐熟后的豬糞堆肥發(fā)芽指數(shù)為98%以上，有機質質量比含量> 35%，有機氮質量比含量為1. 2 2%，含水量質量比25 30% ；菜粕微生物酶解物的制備方法將保藏號為CGMCC NO. 1543的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌 QSteno trophomonas mal tophilia )菌株37_1發(fā)酵液加入到菜粕原料中，調節(jié)含水量 55飛5%和pH 6. (Γ7. 5，進行開放式固體發(fā)酵，待發(fā)酵溫度上升至50°C時立即開始翻堆，以后每天翻堆，使堆溫始終維持在35飛0°C共5天，固體發(fā)酵開始后，堆物的pH會不斷上升，每次翻堆時用含酸液體調節(jié)含水量和PH，使它們分別維持在55飛5%和6. (Γ7. 0，發(fā)酵終止時再用含酸液體進行噴灑，直至堆物PH調整為5. 0左右，再進行低溫干燥或自然涼干，即為菜粕微生物酶解物；腐熟的豬糞堆肥和菜粕微生物酶解物的混合物制備方法將腐熟的豬糞堆肥與菜粕微生物酶解物按體積比5(Γ70% 5(Γ30%的比例充分混合，并后熟2 3天，后熟過程中翻堆2 次。
5.根據(jù)權利要求4所述微生物有機肥料的生產方法，其中步驟1)所用改良的牛肉膏培養(yǎng)液配制方法為稱量2. 0克牛肉膏，玉米粉5. 0克，麥麩5. 0克，土豆淀粉5. 0克，氯化鈉5. 0于燒杯中，攪拌，使之充分溶解混勻，pH值調至7. 2^7. 4，并用自來水定容至1000 ml, 121°C 滅菌 20 min。
6.權利要求2或3所述微生物有機肥料的在防治番茄根結線蟲病中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及防治番茄根結線蟲的拮抗菌和利用其生產的微生物有機肥料，屬于農業(yè)集約化生產技術。固體發(fā)酵拮抗菌X5和有機肥制成微生物有機肥，肥料中含有1×108個/g以上的拮抗菌、全氮4~5%，總氮磷鉀6~10%、有機質30~35%。試驗表明，菌株X5的菌體和過濾液對根結線蟲胚胎發(fā)育過程都具有顯著的破壞作用，蟲卵孵化率減少34%，對二齡幼蟲致死率達到73%。該微生物有機肥料施入土壤后能夠使拮抗菌迅速繁殖，在根結線蟲嚴重的連作土壤中的根結發(fā)病指數(shù)減少40%，每株卵塊數(shù)量減少68%，每卵塊蟲卵數(shù)量減少58%。施用本微生物有機肥料能有效防治作物根結線蟲的危害。
文檔編號C12N1/20GK102154159SQ20101061011
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月29日 優(yōu)先權日2010年12月29日
發(fā)明者冉煒, 李 榮, 楊興明, 沈其榮, 肖同建 申請人:南京農業(yè)大學, 江蘇新天地生物肥料工程中心有限公司