專利名稱：脂肪性肝炎-肝癌模型動(dòng)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及脂肪性肝炎和肝癌模型動(dòng)物以及該動(dòng)物的利用方法。
背景技術(shù)：
一直以來(lái)，非酒精性脂肪性肝疾病被認(rèn)為是不會(huì)有發(fā)展的良性疾病，但是已經(jīng)清楚了盡管是非嗜酒者也會(huì)顯示與酒精性肝炎相類似的炎癥及肝纖維化的組織圖像，是預(yù)后不良的疾病。特別是近年來(lái)，以肥胖、糖尿病等為背景的代謝綜合癥備受矚目，非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatoh印atitis :NASH)是該綜合癥之一的想法越來(lái)越多。但是，其機(jī)理并不清楚，仍未確立有效的治療方法和治療藥劑。其中的一個(gè)原因在于由于人的生活習(xí)慣病是導(dǎo)致發(fā)病的原因、因而還未確立適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)動(dòng)物。發(fā)展成肝硬化、肝癌等致死性疾病的NASH病態(tài)的闡明對(duì)于有效的治療方法及治療藥物的開(kāi)發(fā)是必須的。但是，目前作為NASH模型小鼠用于研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的是瘦素受體缺損小鼠(非專利文獻(xiàn)1)、肝細(xì)胞特異性Pten缺損小鼠(非專利文獻(xiàn)幻、視黃酸受體 α的顯性負(fù)性轉(zhuǎn)基因小鼠(非專利文獻(xiàn)幻等單一轉(zhuǎn)基因小鼠或者通過(guò)喂食蛋氨酸-膽堿缺乏飼料(非專利文獻(xiàn)4)等特殊飼料來(lái)誘發(fā)疾病的動(dòng)物，但作為人類的病因，病態(tài)并非以如轉(zhuǎn)基因小鼠那樣的單一基因突變而發(fā)病和發(fā)展，而且很難認(rèn)為是由于僅攝取了特殊的營(yíng)養(yǎng)成分而導(dǎo)致的。另外，在這些小鼠中無(wú)法同時(shí)觀察到胰島素抵抗性和肝纖維化，在誘發(fā)纖維化的小鼠中在血清生化學(xué)分析中成為指標(biāo)的ALT的上升很輕微，因而為了觀察其病態(tài)， 需要很多的小鼠組織切片，相反地由于ALT的上升顯示顯著高的值，因而認(rèn)為與人類的病態(tài)是不同的。而且，由于病態(tài)在處置后會(huì)自然地治愈，藥效判定中的試驗(yàn)及評(píng)價(jià)很難，為了開(kāi)發(fā)NASH治療方法及治療藥，期待開(kāi)發(fā)符合人類臨床病態(tài)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。雖然進(jìn)行了各種研究，但現(xiàn)狀是并不存在顯示與人類相類似病態(tài)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、且詳細(xì)的病因及治療方法的篩選很難?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1 Sahai A et al. ， Am J Physiol Gastroentest Liver Physiol 287 :G1035,2004非專利文獻(xiàn)2 =Horie Y et al.，J Clin Invest 113 :1774,2004非專利文獻(xiàn) 3 =Yanagitani A et al. , Hepatology 40 :366,2004非專利文獻(xiàn) 4 =Rinella M et al.，Journal ofHepatology 40 :47,200
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題本發(fā)明的課題在于提供顯示與人類相類似的病理觀察結(jié)果的脂肪性肝炎模型動(dòng)物和肝癌模型動(dòng)物以及該動(dòng)物的利用方法。更具體地說(shuō)，本發(fā)明的課題在于提供從胰島素抵抗性變成脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化、肝癌的模型動(dòng)物的制作技術(shù)。
用于解決課題的手段本發(fā)明人為了解決上述課題而進(jìn)行了深入研究。本發(fā)明人通過(guò)向小鼠投予臟器炎癥誘導(dǎo)劑以引發(fā)胰島素抵抗性、進(jìn)而使用高脂肪食物進(jìn)行飼養(yǎng)，從而誘發(fā)脂肪肝。結(jié)果，成功地使該小鼠患上脂肪性肝炎。對(duì)該小鼠詳細(xì)地進(jìn)行研究，結(jié)果呈現(xiàn)以下的病理觀察結(jié)果。(1)在肝細(xì)胞中觀察到大脂滴性的脂肪沉積，觀察到肝細(xì)胞的氣球樣膨脹。(2)可見(jiàn)炎癥性細(xì)胞浸潤(rùn)。(3)觀察到以中央靜脈為中心的纖維化。上述病理觀察結(jié)果是人類NASH(非酒精性脂肪性肝炎)的特征。S卩，本發(fā)明人通過(guò)上述手法首次成功地制作出了顯示與人類的NASH相同病理觀察結(jié)果的小鼠。由本發(fā)明人制作的NASH模型動(dòng)物與目前的模型動(dòng)物相比，具有以下的不同點(diǎn)。(1)肝細(xì)胞的脂肪變性、纖維化并非在門靜脈周圍進(jìn)行，而是與人類的病理組織同樣地以中央靜脈為中心進(jìn)行。(2)雖然隨著病態(tài)的發(fā)展觀察到脂肪沉積、炎癥細(xì)胞的消失，但還觀察到僅在肝纖維化中觀察到的人類的被稱作“燃盡的NASH (burned-out NASH) ”的病理組織圖像。本發(fā)明的模型動(dòng)物可以說(shuō)在不改變基因即可制成的方面具有特征。另外，本發(fā)明的模型動(dòng)物是以均一的時(shí)程100%確實(shí)地發(fā)生與向人類NASH的發(fā)展和預(yù)后非常類似的病態(tài)的動(dòng)物，是與人類的病態(tài)發(fā)展相一致的首個(gè)模型動(dòng)物。而且，本發(fā)明的模型動(dòng)物可以說(shuō)在能夠由胰島素抵抗性同時(shí)觀察到脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化的方面也發(fā)揮顯著有利的效果。而且，本發(fā)明人還首次發(fā)現(xiàn)了通過(guò)對(duì)上述NASH模型動(dòng)物繼續(xù)飼養(yǎng)，在肝硬化之后會(huì)發(fā)生肝癌。這與在人類中確認(rèn)到的病態(tài)變化相同，通過(guò)該手法制作的動(dòng)物作為人的肝癌模型動(dòng)物是非常有用的。人類的肝癌中，在肝表面顯示隆起，但在投予化學(xué)物質(zhì)制作的現(xiàn)有肝癌模型動(dòng)物中，呈現(xiàn)的是在肝表面未形成隆起的肝癌。另一方面，本發(fā)明的模型動(dòng)物可以在沒(méi)有基因改變或藥物投予等的情況下即可觀察到與人類的肝癌同樣的向肝表面的隆起，因而是接近人類肝癌的模型。而且，在化學(xué)物質(zhì)投予中雖然未觀察到肝硬化，但本發(fā)明的模型動(dòng)物中呈現(xiàn)塊狀型的索狀肝細(xì)胞癌，還觀察到炎癥性細(xì)胞的浸潤(rùn)、排擠正常肝細(xì)胞地發(fā)育而成的由肝硬化轉(zhuǎn)變的肝癌。而且，成為肝癌發(fā)生起源的是顯示與人類NASH非常類似的病態(tài)的大滴脂性的脂肪肝，由于會(huì)經(jīng)歷肝纖維化及肝硬化，因而是在到目前為止的報(bào)告中沒(méi)有的、非常有用的模型動(dòng)物。如上所述，本發(fā)明人成功地制作出了顯示與人類相類似的病理觀察結(jié)果的脂肪性肝炎模型動(dòng)物和肝癌模型動(dòng)物，從而完成了本發(fā)明。通過(guò)使用這些模型動(dòng)物，可以有效地實(shí)施疾病的治療或預(yù)防用物質(zhì)的篩選以及藥物的藥效評(píng)價(jià)。本發(fā)明涉及由胰島素抵抗性變成脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化、肝癌的模型動(dòng)物以及該動(dòng)物的利用方法，更具體地說(shuō)提供(1) 一種脂肪性肝炎模型非人類動(dòng)物，其是投予臟器炎癥誘導(dǎo)劑而制作的；(2)上述(1)所述的非人類動(dòng)物，其中，所述脂肪性肝炎為非酒精性脂肪性肝炎；(3) 一種糖尿病模型非人類動(dòng)物，其是投予臟器炎癥誘導(dǎo)劑而制作的；(4)上述(1) (3)任一項(xiàng)所述的非人類動(dòng)物，其中，所述臟器炎癥誘導(dǎo)劑是N-乙酰基-β -D-氨基葡糖苷酶抑制劑；(5)上述(1) (4)任一項(xiàng)所述的非人類動(dòng)物，其中，包含通過(guò)投予臟器炎癥誘導(dǎo)劑并使用高脂肪食物進(jìn)行飼養(yǎng)來(lái)產(chǎn)生脂肪肝的工序；(6)上述(1) ( 任一項(xiàng)所述的非人類動(dòng)物，其中，所述非人類動(dòng)物是小鼠；(7) 一種脂肪性肝炎模型非人類動(dòng)物的生產(chǎn)方法，其包含對(duì)非人類動(dòng)物的臟器誘導(dǎo)炎癥的工序；(8) 一種脂肪性肝炎的治療用或預(yù)防用物質(zhì)的篩選方法，其包含以下的工序(a) 和(b)(a)對(duì)上述(1)所述的脂肪性肝炎模型非人類動(dòng)物投予待測(cè)物質(zhì)的工序、(b)評(píng)價(jià)對(duì)脂肪性肝炎的改善效果的工序；(9) 一種針對(duì)藥物對(duì)脂肪性肝炎的改善的藥效評(píng)價(jià)方法，其包含以下的工序(a) 和(b)(a)對(duì)上述(1)所述的脂肪性肝炎模型非人類動(dòng)物投予待測(cè)藥物的工序、(b)評(píng)價(jià)對(duì)脂肪性肝炎的改善效果的工序；(10) 一種糖尿病性疾病的治療用或預(yù)防用物質(zhì)的篩選方法，其包含以下的工序
(a)和(b)(a)對(duì)上述( 所述的糖尿病性疾病模型非人類動(dòng)物投予待測(cè)物質(zhì)的工序、(b)評(píng)價(jià)對(duì)糖尿病性疾病的改善效果的工序；(11) 一種藥物的用于治療或預(yù)防糖尿病性疾病的藥劑的副作用的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)方法， 其包含以下的工序(a)和(b)(a)對(duì)上述( 所述的糖尿病性疾病模型非人類動(dòng)物投予待測(cè)藥劑的工序、(b)評(píng)價(jià)用于治療或預(yù)防糖尿病性疾病的藥劑的副作用的工序；(12) 一種肝癌模型非人類動(dòng)物，其是進(jìn)一步對(duì)上述(1) (6)任一項(xiàng)所述的非人類動(dòng)物進(jìn)行飼養(yǎng)而制作的；(13)上述(1 所述的非人類動(dòng)物，其通過(guò)以下的病理學(xué)形態(tài)而在結(jié)構(gòu)上具有特征(a)塊狀型的索狀肝細(xì)胞癌(b)炎癥性細(xì)胞的浸潤(rùn)(c)排擠正常肝細(xì)胞地發(fā)育而成的由肝硬化轉(zhuǎn)變的肝癌(14) 一種肝癌的治療用或預(yù)防用物質(zhì)的篩選方法，其包含以下的工序(a)和
(b)(a)對(duì)上述(1 或(1 所述的肝癌模型非人類動(dòng)物投予待測(cè)物質(zhì)的工序、(b)評(píng)價(jià)對(duì)肝癌的治療效果的工序；(15) 一種藥物對(duì)肝癌治療的藥效評(píng)價(jià)方法，其包含以下的工序(a)和(b)(a)對(duì)上述(1 或(1 所述的肝癌模型非人類動(dòng)物投予待測(cè)藥物的工序、(b)評(píng)價(jià)對(duì)肝癌的治療效果的工序。發(fā)明效果為了制作與人類的發(fā)癥病態(tài)相類似的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在小鼠中引起胰島素抵抗性、進(jìn)而使用高脂肪食物進(jìn)行飼養(yǎng)，從而誘發(fā)脂肪肝。
將各周齡時(shí)的小鼠處死，以肝臟為中心，在病理組織學(xué)上對(duì)各臟器進(jìn)行解析 (HE染色、脂肪染色、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的免疫染色)，計(jì)算NAS(NAFLD活動(dòng)度積分 (NAFLD Activity Score)，參考文獻(xiàn)Kleiner DE et al. Hepatology. 2005 Jun ；41 (6) 1313-21.)，詳細(xì)地對(duì)病理圖像進(jìn)行研究。本發(fā)明的模型動(dòng)物可以使用對(duì)人使用的NAFLD活動(dòng)度積分進(jìn)行NASH的判定，作為NASH模型動(dòng)物是非常有用的。另外，在血清生化學(xué)檢查中使用FUJIFILM DRI-CHEM進(jìn)行研究，基因表達(dá)分析使用 takara Real-Time RT-PCR 進(jìn)行研究。如上所述，本發(fā)明人成功地制作了顯示與人類相同的病理觀察結(jié)果的脂肪性肝炎模型動(dòng)物(例如NASH模型動(dòng)物)和肝癌模型動(dòng)物。本發(fā)明提供穩(wěn)定且容易地制作下述動(dòng)物的技術(shù)通過(guò)在小鼠等實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物中引起胰島素抵抗性并進(jìn)行高脂肪食物負(fù)荷，從早期開(kāi)始產(chǎn)生向脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纖維化、 肝硬化發(fā)展的與人類NASH相類似的病態(tài)，且自然地產(chǎn)生伴隨所述病態(tài)發(fā)展的肝癌。另外，該動(dòng)物中由于可同時(shí)觀察到糖尿病性疾病(糖尿病性腎炎、視網(wǎng)膜病變、高脂血癥、動(dòng)脈硬化癥)，因此還提供可同時(shí)觀察到代謝綜合癥的病態(tài)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物制作技術(shù)。另外，目前作為NASH模型常用的ob/ob、db/db小鼠等由于隨著小鼠年齡增加， 病態(tài)的形成并不恒定，為了判定正確的病態(tài)而需要小鼠病態(tài)的監(jiān)測(cè)等，會(huì)產(chǎn)生為了用于實(shí)驗(yàn)的繁瑣性。而且，由于病變也很難說(shuō)是不可逆的，因而在藥效效果的判定等中會(huì)產(chǎn)生困難(Horie Y et al.，J clin Invest 113 :1774_1783，2004、Yanagitani A et al.， Hepatology 40 :366_375，2004、Anstee QM et al.，Int J Exp Path 87 1—16，2006)。但是，本發(fā)明的模型動(dòng)物在至病態(tài)完成的發(fā)病期間是恒定的，而且伴隨有不可逆的病態(tài)發(fā)展， 因而可以解決上述問(wèn)題。本發(fā)明的模型動(dòng)物可用于各種治療藥物的臨床前試驗(yàn)，而且在藥劑開(kāi)發(fā)或成為治療標(biāo)的的靶的探索中也是非常有用的。


圖1是表示本發(fā)明的小鼠的血清的生化學(xué)檢查結(jié)果的圖。圖2是表示本發(fā)明的小鼠的肝臟的脂肪染色結(jié)果的照片。圖3是表示本發(fā)明的小鼠的肝臟的免疫組織染色結(jié)果的照片。圖4是表示本發(fā)明小鼠在20周齡時(shí)的肝臟的肝臟HE染色結(jié)果的照片。圖5是表示C57BL/6J肝臟的HE染色結(jié)果的照片及表示NAFLD活動(dòng)度積分的曲線。圖6是表示C57BL/6J胰腺及脂肪組織F4/80的免疫染色結(jié)果的照片。圖7是表示8周齡時(shí)的BALB/c小鼠和C3H/HeN小鼠的肝臟F4/80及ER-TR7免疫染色結(jié)果的照片。圖8是20周齡時(shí)的C3H/HeN的肝癌的照片。圖9是表示由其他高脂肪食物負(fù)荷所產(chǎn)生的NASH模型小鼠的重現(xiàn)結(jié)果的照片。圖10是表示使用了 NASH模型小鼠的藥理效果試驗(yàn)的各結(jié)果的照片和曲線。1為表示組織學(xué)解析結(jié)果的照片、2為表示基因表達(dá)解析結(jié)果的曲線。圖11是表示糖尿病性并發(fā)癥的發(fā)病的照片。1為糖尿病性腎病、2為糖尿病性視網(wǎng)膜病變(新生血管的免疫染色圖像、⑶31)的照片。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及通過(guò)引起胰島素抵抗性而制作的脂肪性肝炎模型動(dòng)物。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，提供通過(guò)投予臟器炎癥誘導(dǎo)劑而制作的脂肪性肝炎模型動(dòng)物(本說(shuō)明書(shū)中有時(shí)記為“本發(fā)明的模型動(dòng)物”)。本發(fā)明的模型動(dòng)物是通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物投予臟器炎癥誘導(dǎo)劑后、優(yōu)選使用高脂肪食物作為飼料進(jìn)行飼養(yǎng)而制作的。本發(fā)明中使用的動(dòng)物只要是通常作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的動(dòng)物即可，沒(méi)有特別限制， 通常為非人類動(dòng)物、優(yōu)選為非人類脊椎動(dòng)物、更優(yōu)選為非人類哺乳動(dòng)物、進(jìn)一步優(yōu)選為嚙齒類。作為本發(fā)明的模型動(dòng)物的制作中可使用的動(dòng)物，具體地可舉出小鼠、大鼠、兔子、狗、雞、 猴等(有時(shí)將這些動(dòng)物僅記為“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物”)。 本發(fā)明的模型動(dòng)物的制作中所使用的動(dòng)物的遺傳背景并無(wú)特別限定，可利用具有任意遺傳背景的動(dòng)物。通?？蓛?yōu)選使用野生型的動(dòng)物。本發(fā)明中的臟器炎癥誘導(dǎo)劑(本說(shuō)明書(shū)中有時(shí)僅記為“藥劑”)只要是具有廣泛地直接或間接地對(duì)臟器誘導(dǎo)炎癥的作用的藥劑即可，并無(wú)特別限定。作為成為炎癥誘導(dǎo)對(duì)象的臟器，例如可舉出胰腺、脂肪組織、肌肉組織等。另外，本發(fā)明的臟器炎癥誘導(dǎo)劑中還包含直接或間接地對(duì)末梢組織誘導(dǎo)炎癥的藥劑等。作為本發(fā)明的臟器炎癥誘導(dǎo)劑，優(yōu)選地可舉出N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷酶抑制劑。作為本發(fā)明模型動(dòng)物的優(yōu)選方式，通過(guò)對(duì)上述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物投予N-乙?；? β -D-氨基葡糖苷酶抑制劑來(lái)制作。作為該抑制劑，例如可舉出鏈脲佐菌素、朋納克(Pugnac)等。另外，具有N-乙?；? β -D-氨基葡糖苷酶抑制活性的核酸也可作為本發(fā)明的藥劑使用。具體地可以舉出抑制O-GlcNAcase基因(GenBank登錄號(hào)匪023799.3)的表達(dá)的siRNA、該基因的反義基因或以該基因?yàn)榘械暮嗣傅?。在本發(fā)明的模型動(dòng)物的制作中，臟器炎癥誘導(dǎo)劑的投予方式并無(wú)特別限定。例如可舉出皮下投予(皮下注射等)、靜脈投予、經(jīng)口投予、腹腔投予等。投予的藥劑的量在例如為鏈脲佐菌素時(shí)通常為50 500 μ g、優(yōu)選為100 300 μ g、更優(yōu)選為200 μ g，但并不限定為這些量。投予藥劑的時(shí)機(jī)通常在出生后1 5日齡(新生仔期、優(yōu)選1 5天、更優(yōu)選2 天)、優(yōu)選是出生后2日齡。如上所述，通過(guò)投予藥劑，可以引起胰島素抵抗性。本發(fā)明的模型動(dòng)物的制作中， 優(yōu)選在如上所述投予藥劑后進(jìn)行飼養(yǎng)。通常該飼養(yǎng)優(yōu)選使用高脂肪食物作為飼料。高脂肪食物可以利用通常作為動(dòng)物用飼料市售的各種食物。作為上述高脂肪食物的主要成分，例如可舉出粗脂肪、粗蛋白質(zhì)、粗纖維、粗灰分、 可溶性無(wú)氮物、水分。本發(fā)明中使用的高脂肪食物并無(wú)特別限定，粗脂肪含量為20%以上、 優(yōu)選為30%以上，脂肪來(lái)源的卡路里占總卡路里的比例通常為50%以上、優(yōu)選為60%以上。另外，配合在高脂肪食物中的成分例如可舉出粉末牛脂、乳酪蛋白、蛋白粉、L-胱氨酸、 紅花油、結(jié)晶纖維素、麥芽糊精、乳糖、蔗糖等，這些物質(zhì)是高脂肪食物成分的一例，并非必須含有這些物質(zhì)。
上述高脂肪食物并無(wú)特別限定，例如可舉出粗脂肪含量高于通常食物(例如高約 30%以上)的食物。舉出一例時(shí)，可舉出作為研究用動(dòng)物飼料市售的High Fat Diet32(日本 CLEA 公司制)、D1M92 (Research Diets 公司制)等。對(duì)于上述高脂肪食物，例如為小鼠時(shí)，通常在2 6周齡時(shí)、優(yōu)選在3 5周齡時(shí)、 更優(yōu)選在4周齡時(shí)開(kāi)始投予。另外，每次高脂肪食物的量例如為小鼠時(shí)是3 6克左右。 通常優(yōu)選使用高脂肪食物作為飼料飼養(yǎng)1周以上。本領(lǐng)域技術(shù)人員可考慮所使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種類、大小、體重等來(lái)適當(dāng)調(diào)整(增減)高脂肪食物的量。通過(guò)使用高脂肪食物進(jìn)行飼養(yǎng)，可以誘發(fā)脂肪肝。因而，本發(fā)明的優(yōu)選方式中，提供包含通過(guò)投予臟器炎癥誘導(dǎo)劑并使用高脂肪食物進(jìn)行飼養(yǎng)來(lái)產(chǎn)生脂肪肝的工序的脂肪性肝炎模型動(dòng)物。通過(guò)上述手法制作的動(dòng)物呈現(xiàn)脂肪性肝炎的癥狀，作為脂肪性肝炎模型動(dòng)物是有用的。本發(fā)明的模型動(dòng)物的特征在于同時(shí)呈現(xiàn)在通過(guò)本發(fā)明方法制作的動(dòng)物中所觀察到的病態(tài)。優(yōu)選的特征是同時(shí)呈現(xiàn)胰島素抵抗性和/或肝纖維化，但并不僅限定于這些病態(tài)。本發(fā)明模型動(dòng)物的優(yōu)選方式中，由于可以同時(shí)觀察到糖尿病性疾病(糖尿病性腎炎、視網(wǎng)膜病變、高脂血癥、動(dòng)脈硬化癥)，因而具有還可同時(shí)觀察到代謝綜合癥的病態(tài)的特征。另外，本發(fā)明的模型動(dòng)物由于具有病態(tài)不會(huì)自然被治愈的特征，因而可適合用于藥效判定的試驗(yàn)或評(píng)價(jià)中。作為本發(fā)明模型動(dòng)物的優(yōu)選方式，上述脂肪性肝炎為非酒精性肝炎(NASH)。即，本發(fā)明提供投予臟器炎癥誘導(dǎo)劑而制作的非酒精性肝炎(NASH)模型動(dòng)物。該動(dòng)物具有以下特征以均一的時(shí)程確實(shí)地發(fā)生與向人類NASH的發(fā)展和預(yù)后非常類似的病態(tài)。本發(fā)明優(yōu)選方式中的非酒精性肝炎模型動(dòng)物呈現(xiàn)以下中的至少一個(gè)(優(yōu)選全部) 的病理觀察結(jié)果。(1)肝細(xì)胞中觀察到大脂滴性的脂肪沉積、觀察到肝細(xì)胞的氣球樣膨脹。(2)可見(jiàn)炎癥性細(xì)胞浸潤(rùn)。(3)觀察到以中央靜脈為中心的纖維化。因而，作為本發(fā)明模型動(dòng)物的優(yōu)選方式，是通過(guò)上述病理學(xué)形態(tài)而在結(jié)構(gòu)上帶有特征的模型動(dòng)物。本發(fā)明的上述脂肪性肝炎模型動(dòng)物通過(guò)直接繼續(xù)進(jìn)行飼養(yǎng)，呈現(xiàn)肝硬化、進(jìn)而呈現(xiàn)肝癌。因而，本發(fā)明的脂肪性肝炎模型動(dòng)物例如作為肝硬化或肝癌模型動(dòng)物的制作用動(dòng)物(起始材料)也是有用的。即，本發(fā)明提供包含本發(fā)明脂肪性肝炎模型動(dòng)物而成的肝硬化或肝癌模型動(dòng)物制作用材料。通過(guò)上述方法制作本發(fā)明模型動(dòng)物的方法也包含在本發(fā)明中。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，提供包含向非人類動(dòng)物投予臟器炎癥誘導(dǎo)劑的工序的脂肪性肝炎模型動(dòng)物的生產(chǎn)方法。另外，通過(guò)利用本發(fā)明的模型動(dòng)物，還可篩選脂肪性肝炎的治療或預(yù)防用物質(zhì)。 艮口，本發(fā)明提供包含以下的工序(a)和(b)的脂肪性肝炎的治療用或預(yù)防用物質(zhì)的篩選方法。(a)對(duì)本發(fā)明的脂肪性肝炎模型動(dòng)物投予待測(cè)物質(zhì)的工序(b)評(píng)價(jià)對(duì)脂肪性肝炎的改善效果的工序
作為本方法中使用的待測(cè)物質(zhì)，并無(wú)特別限定。例如可舉出天然化合物、有機(jī)化合物、無(wú)機(jī)化合物、蛋白質(zhì)、肽等單一化合物、以及化合物庫(kù)、基因庫(kù)的表達(dá)產(chǎn)物、細(xì)胞提取物、 細(xì)胞培養(yǎng)上清、發(fā)酵微生物產(chǎn)物、海洋生物提取物、植物提取物等，但并不限定于這些。本發(fā)明方法中的待測(cè)物質(zhì)或藥物的投予并無(wú)特別限定，例如可通過(guò)經(jīng)口或注射等來(lái)進(jìn)行。當(dāng)待測(cè)物質(zhì)為蛋白質(zhì)時(shí)，例如還可以構(gòu)建具有編碼該蛋白質(zhì)的基因的病毒載體、利用其感染力將該基因?qū)氲奖景l(fā)明的模型動(dòng)物中。工序(b)中改善效果的評(píng)價(jià)可以通過(guò)研究該模型動(dòng)物所呈現(xiàn)的病理觀察結(jié)果來(lái)判定脂肪性肝炎是否有所改善。脂肪性肝炎的病理觀察結(jié)果例如可舉出上述的病理觀察結(jié)果(病理學(xué)形態(tài))。本發(fā)明中的“改善”是指脂肪性肝炎的癥狀恢復(fù)到正常的狀態(tài)或者癥狀有所緩和。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以以本說(shuō)明書(shū)所記載的病理觀察結(jié)果為指標(biāo)，對(duì)模型動(dòng)物適當(dāng)判定脂肪性肝炎的癥狀是否有所改善。本發(fā)明的方法中，選擇在上述工序(b)中顯示改善效果的待測(cè)物質(zhì)作為脂肪性肝炎的治療或預(yù)防用物質(zhì)。另外，通過(guò)利用本發(fā)明的模型動(dòng)物，還可進(jìn)行針對(duì)藥物對(duì)脂肪性肝炎的改善的藥效評(píng)價(jià)。即，本發(fā)明提供包含以下的工序(a)和(b)的針對(duì)藥物對(duì)脂肪性肝炎的改善的藥效評(píng)價(jià)方法。(a)向本發(fā)明的脂肪性肝炎模型動(dòng)物投予待測(cè)藥物的工序(b)評(píng)價(jià)對(duì)脂肪性肝炎的改善效果的工序可通過(guò)上述方法進(jìn)行藥效評(píng)價(jià)的藥物的種類并無(wú)特別限定，例如可舉出公知的各種藥劑(低分子化合物、蛋白質(zhì)、核酸等)。對(duì)于待測(cè)藥物，當(dāng)可見(jiàn)對(duì)脂肪性肝炎的改善效果時(shí)，則判定該藥物對(duì)脂肪性肝炎具有治療效果。另外，本發(fā)明的模型動(dòng)物具有以下特征在呈現(xiàn)脂肪性肝炎的同時(shí)還呈現(xiàn)作為并發(fā)癥產(chǎn)生的糖尿病性疾病(糖尿病性腎炎、視網(wǎng)膜病變等)。因而，本發(fā)明的模型動(dòng)物作為糖尿病模型動(dòng)物是有用的。S卩，本發(fā)明提供投予臟器炎癥誘導(dǎo)劑而制作的糖尿病模型非人類動(dòng)物。使用本發(fā)明的糖尿病模型動(dòng)物，可以進(jìn)行對(duì)糖尿病并發(fā)癥(糖尿病性腎炎、視網(wǎng)膜病變等)的治療或預(yù)防藥的開(kāi)發(fā)。例如，通過(guò)向本發(fā)明的糖尿病模型動(dòng)物投予待測(cè)物質(zhì)，探討糖尿病性疾病的改善效果，從而能夠篩選用于糖尿病性疾病的治療或預(yù)防的候選化合物。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，涉及含有以下的工序(a)和(b)的糖尿病性疾病的治療用或預(yù)防用物質(zhì)的篩選方法。(a)向本發(fā)明的糖尿病性疾病模型非人類動(dòng)物投予待測(cè)物質(zhì)的工序(b)評(píng)價(jià)對(duì)糖尿病性疾病的改善效果的工序NASH患者中糖尿病患者很多，具有各種并發(fā)癥。本發(fā)明的模型動(dòng)物由于患有糖尿病性并發(fā)癥，因而作為能夠早期判斷在臨床治驗(yàn)中發(fā)覺(jué)的副作用等風(fēng)險(xiǎn)的模型動(dòng)物是非常有用的。S卩，本發(fā)明提供使用了本發(fā)明糖尿病模型動(dòng)物的藥品的副作用的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)方法。作為本發(fā)明方法的優(yōu)選方式，涉及包含以下的工序(a)和(b)的藥物的用于治療CN 102548393 A或預(yù)防糖尿病性疾病的藥劑的副作用的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)方法。(a)向本發(fā)明的糖尿病性疾病模型非人類動(dòng)物投予待測(cè)藥劑的工序(b)評(píng)價(jià)用于治療或預(yù)防糖尿病性疾病的藥劑的副作用的工序另外，由本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明的上述脂肪性肝炎模型動(dòng)物通過(guò)直接繼續(xù)進(jìn)行飼養(yǎng)，在經(jīng)歷肝硬化后進(jìn)一步呈現(xiàn)肝癌。因而，本發(fā)明提供進(jìn)一步對(duì)上述脂肪性肝炎模型動(dòng)物進(jìn)行飼養(yǎng)而制作的肝硬化或肝癌模型動(dòng)物。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，涉及對(duì)投予臟器炎癥誘導(dǎo)劑制作的脂肪性肝炎模型動(dòng)物進(jìn)一步進(jìn)行飼養(yǎng)而制作的肝癌模型動(dòng)物。本發(fā)明的上述脂肪性肝炎模型動(dòng)物在之后呈現(xiàn)肝硬化，通過(guò)直接進(jìn)一步繼續(xù)飼養(yǎng)，可以制作肝癌模型動(dòng)物。該模型動(dòng)物的制作中，肝硬化后進(jìn)行飼養(yǎng)的期間例如以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為小鼠時(shí)為例，通常為2-20周以上、優(yōu)選為10周以上。本發(fā)明的肝癌模型動(dòng)物例如通過(guò)選自以下中的至少一個(gè)(優(yōu)選全部)的病理觀察結(jié)果(病理學(xué)形態(tài))而在結(jié)構(gòu)上帶有特征。(a)塊狀型的索狀肝細(xì)胞癌(b)炎癥性細(xì)胞的浸潤(rùn)(c)排擠正常肝細(xì)胞地發(fā)育而成的由肝硬化轉(zhuǎn)變的肝癌具有上述特征的肝癌模型動(dòng)物與現(xiàn)有的投予化學(xué)物質(zhì)(致癌物質(zhì))制作的肝癌模型動(dòng)物在顯示上述病理學(xué)形態(tài)的方面，結(jié)構(gòu)上有所不同。通過(guò)利用本發(fā)明的上述肝癌模型動(dòng)物，可以實(shí)施肝癌的治療用或預(yù)防用物質(zhì)的篩選。作為本發(fā)明上述方法的優(yōu)選方式，可舉出包含以下的工序(a)和(b)的肝癌的治療用或預(yù)防用物質(zhì)的篩選方法。(a)向本發(fā)明的肝癌模型動(dòng)物投予待測(cè)物質(zhì)的工序(b)評(píng)價(jià)對(duì)肝癌的治療效果的工序上述方法中治療效果的評(píng)價(jià)例如可以以上述肝癌的病理觀察結(jié)果為指標(biāo)來(lái)適當(dāng)實(shí)施。例如在投予了待測(cè)物質(zhì)的本發(fā)明的模型動(dòng)物中，當(dāng)塊狀型的索狀肝細(xì)胞癌消失時(shí)，則判定待測(cè)物質(zhì)具有肝癌治療效果。另外，本發(fā)明通過(guò)利用本發(fā)明的肝癌模型動(dòng)物，可以進(jìn)行藥物對(duì)肝癌治療的藥效評(píng)價(jià)。作為該方法的優(yōu)選方式，例如可舉出包含以下的工序(a)和(b)的方法。(a)向本發(fā)明的肝癌模型動(dòng)物投予待測(cè)藥物的工序(b)評(píng)價(jià)對(duì)肝癌的治療效果的工序此外，本說(shuō)明書(shū)中所引用的所有現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)作為參考納入本說(shuō)明書(shū)中。實(shí)施例以下通過(guò)實(shí)施例具體地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限定于這些實(shí)施例。(實(shí)施例1)NASH模型動(dòng)物和肝癌模型動(dòng)物的制作(a) NASH模型小鼠的制作對(duì)妊娠C57BL6J/JJcl、C3H/HeNJcl、BALB/cByJJcl (日本 CLEA 公司制)、C57BL6J/ NCrlCrlj (日本Charles River公司制)進(jìn)行飼養(yǎng)、使其生產(chǎn)。對(duì)出生后2日齡的C57BL6J/ JCL、BALB/CByJJCl、C3H/HeNJCl小鼠雄性(日本CLEA公司制)的各個(gè)胰腺β細(xì)胞的N-乙?；?β -D-氨基葡糖苷酶(0-GlcNAcase)特異性地賦予細(xì)胞毒性(例如以20 μ L/只皮下注射鏈脲佐菌素10mg/mL(SIGMA公司制)等)，對(duì)胰腺賦予炎癥，直接或間接地對(duì)末梢組織引起炎癥，從而引起胰島素抵抗性。給予CE-2(日本CLEA公司制)的飼料、滅菌水進(jìn)行飼養(yǎng)直至4周齡，滿4周齡時(shí)斷奶后，給予粗脂肪含量高于通常食物(或高約30%以上的)High Fat Diet食物(日本CLEA公司制)或D12492 (Research Diets公司制)、滅菌水，飼養(yǎng)至 20周齡。(b)組織學(xué)研究在各周齡下，使小鼠禁食M小時(shí)后，在乙醚麻醉下處死、采血，使用OCT化合物 (sakura fine technical公司制)將各臟器冷凍后切片，進(jìn)行病理學(xué)解析。本模型中，在血清生化學(xué)的檢查中，與正常個(gè)體群相比，空腹時(shí)血糖、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)及中性脂肪的值高，患有胰島素抵抗性及高脂血癥(圖1)。組織學(xué)上，在5周齡時(shí)觀察到伴隨肝細(xì)胞膨脹的明顯的脂肪肝，在8周齡時(shí)肝臟內(nèi)的脂肪基本消失，顯示與人的燃盡的NASH相同的組織學(xué)病態(tài)發(fā)展(圖2)。在6周齡時(shí)，在肝臟內(nèi)觀察到以巨噬細(xì)胞為代表的炎癥性細(xì)胞的浸潤(rùn)和集簇，纖維化以肝臟的中央靜脈為中心發(fā)展。進(jìn)而，當(dāng)觀察經(jīng)時(shí)變化時(shí)，8周齡時(shí)纖維化以將中心動(dòng)脈連接的方式發(fā)展、10周齡時(shí)顯示再生結(jié)節(jié)的形成、成為肝硬化狀態(tài)(圖幻。另外， 由病理組織圖像計(jì)算NAS的結(jié)果是NASH期的平均值為5，由該值的變化還可判定藥理效果 (圖 5)。而且，本小鼠的NASH發(fā)病機(jī)理是以胰腺中的炎癥為誘因，誘發(fā)作為末梢組織的肝臟或脂肪組織中的慢性炎癥，顯示胰島素抵抗性，通過(guò)全身性炎癥的持續(xù)而達(dá)到脂肪肝 (圖6)。之后，隨著小鼠年齡的增長(zhǎng)，再生結(jié)節(jié)肥大化，在20周齡時(shí)觀察到炎癥性細(xì)胞的浸潤(rùn)、異形肝細(xì)胞的增加及排擠正常肝細(xì)胞地發(fā)育而成的癌(圖4)。另外，在其他體系小鼠中也可在組織學(xué)上使NASH病變-肝癌發(fā)病(圖7、8)，即便改變可具有的高脂肪食物也可重現(xiàn) NASH病變(圖9)。另外，使用本模型，將作為高血壓治療藥的血管緊張素受體拮抗劑(ARB)經(jīng)口投予2周，嘗試NASH治療。結(jié)果，與臨床上的報(bào)告相一致(Georgescu E. F. et al.，15 :942)， ARB投予組與未治療組相比，觀察到肝臟的組織學(xué)上的改善及基因檢查中的炎癥及纖維化的改善效果，顯示與臨床很高的相同性(圖10)。進(jìn)而，由于在本模型小鼠中還同時(shí)引起了脂肪組織中的炎癥，因而胰島素抵抗性進(jìn)一步增強(qiáng)，通過(guò)慢性的高血糖的持續(xù)，呈現(xiàn)由于細(xì)小血管障礙等所導(dǎo)致的糖尿病疾病的并發(fā)癥(糖尿病性腎病、視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)障礙)。因而，對(duì)于其他臟器中的病變?cè)敿?xì)地進(jìn)行探討時(shí)，在10周齡時(shí)觀察到以炎癥性巨噬細(xì)胞及成纖維細(xì)胞在腎小球體內(nèi)及周圍的集聚為特征的腎小球纖維化及間質(zhì)性纖維化，發(fā)生了糖尿病性腎病(圖11)。另外，在20周齡時(shí)的眼中使用CD31抗體探討新生血管的形成時(shí)，本模型小鼠中在視網(wǎng)膜中觀察到它們的過(guò)形成，呈現(xiàn)糖尿病性視網(wǎng)膜病變(圖11)。由以上可知，通過(guò)本發(fā)明，可以提供從脂肪肝至肝癌的NASH模型動(dòng)物。通過(guò)這些動(dòng)物，可以促進(jìn)人類NASH的病因和病態(tài)解析以及其治療技術(shù)、治療藥物等的開(kāi)發(fā)。產(chǎn)業(yè)上的可利用性作為脂肪蓄積在肝臟上的原因，可舉出酒精、肥胖、糖尿病、脂質(zhì)代謝異常、藥劑、 高度的營(yíng)養(yǎng)不良等，大致可分類為酒精性及非酒精性。認(rèn)為該酒精性脂肪肝會(huì)發(fā)展成肝炎、肝纖維癥、肝硬化，而非酒精性則停留于脂肪肝、病態(tài)不會(huì)發(fā)展。但是，在90年代后半期， 在歐美國(guó)家隨著肥胖人口的增加和疾病概念的普及，成為繼C型肝炎、酒精性肝炎之后的頻率很高的疾病，據(jù)報(bào)道該病態(tài)也會(huì)進(jìn)一步發(fā)展成肝硬化、進(jìn)而肝癌，因而備受關(guān)注。在日本，以遺傳性的胰島素分泌不足為背景，由于飲食生活的歐美化、運(yùn)動(dòng)不足，肥胖人口有所增加，同時(shí)被診斷為NASH的患者數(shù)也有增加的傾向。因此需要盡早準(zhǔn)備并確立NASH治療方法及治療藥劑。本發(fā)明與人類的NASH病態(tài)的發(fā)展?fàn)顟B(tài)非常類似，還可以依據(jù)治療對(duì)象決定對(duì)胰島素抵抗性、脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纖維、肝硬化階段進(jìn)行解析的時(shí)期。另外，通過(guò)探索與由各階段發(fā)展相關(guān)的病因，對(duì)人類NASH及肝纖維化、肝硬化的全新的治療方法和治療藥齊U、生物標(biāo)記物的開(kāi)發(fā)也可以作出貢獻(xiàn)，還可以探討NASH病變中的藥物動(dòng)力學(xué)。另外，由于最終會(huì)發(fā)展成肝癌，因而還可探討抑制癌等藥劑、肝癌發(fā)病機(jī)理、肝癌確立過(guò)程中的靶分子藥物的探索。而且，除了上述之外，由于還可同時(shí)解析糖尿病性疾病，因而不僅對(duì)肝臟、對(duì)作為生物個(gè)體的全身性病變的關(guān)聯(lián)性及其治療方法和治療藥劑、生物標(biāo)記物的開(kāi)發(fā)等也可作出很大貢獻(xiàn)。
權(quán)利要求
1.一種脂肪性肝炎模型非人類動(dòng)物，其是投予臟器炎癥誘導(dǎo)劑而制作的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非人類動(dòng)物，其中，所述脂肪性肝炎為非酒精性脂肪性肝炎。
3.一種糖尿病模型非人類動(dòng)物，其是投予臟器炎癥誘導(dǎo)劑而制作的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的非人類動(dòng)物，其中，所述臟器炎癥誘導(dǎo)劑為N-乙酰基-β -D-氨基葡糖苷酶抑制劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4任一項(xiàng)所述的非人類動(dòng)物，其中，包含通過(guò)投予臟器炎癥誘導(dǎo)劑并使用高脂肪食物進(jìn)行飼養(yǎng)來(lái)產(chǎn)生脂肪肝的工序。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 5任一項(xiàng)所述的非人類動(dòng)物，其中，所述非人類動(dòng)物為小鼠。
7.一種脂肪性肝炎模型非人類動(dòng)物的生產(chǎn)方法，其包含對(duì)非人類動(dòng)物的臟器誘導(dǎo)炎癥的工序。
8.一種脂肪性肝炎的治療用或預(yù)防用物質(zhì)的篩選方法，其包含以下的工序(a)和(b)(a)向權(quán)利要求1所述的脂肪性肝炎模型非人類動(dòng)物投予待測(cè)物質(zhì)的工序；(b)評(píng)價(jià)對(duì)脂肪性肝炎的改善效果的工序。
9.一種針對(duì)藥物對(duì)脂肪性肝炎的改善的藥效評(píng)價(jià)方法，其包含以下的工序(a)和(b)(a)向權(quán)利要求1所述的脂肪性肝炎模型非人類動(dòng)物投予待測(cè)藥物的工序；(b)評(píng)價(jià)對(duì)脂肪性肝炎的改善效果的工序。
10.一種糖尿病性疾病的治療用或預(yù)防用物質(zhì)的篩選方法，其包含以下的工序(a)和(b)(a)向權(quán)利要求3所述的糖尿病性疾病模型非人類動(dòng)物投予待測(cè)物質(zhì)的工序；(b)評(píng)價(jià)對(duì)糖尿病性疾病的改善效果的工序。
11.一種藥物的用于治療或預(yù)防糖尿病性疾病的藥劑的副作用的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)方法，其包含以下的工序(a)和(b)(a)向權(quán)利要求3所述的糖尿病性疾病模型非人類動(dòng)物投予待測(cè)藥劑的工序；(b)評(píng)價(jià)用于糖尿病性疾病的治療或預(yù)防的藥劑的副作用的工序。
12.—種肝癌模型非人類動(dòng)物，其是對(duì)權(quán)利要求1 6任一項(xiàng)所述的非人類動(dòng)物進(jìn)一步進(jìn)行飼養(yǎng)而制作的。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的非人類動(dòng)物，其通過(guò)以下的病理學(xué)形態(tài)而在結(jié)構(gòu)上帶有特征(a)塊狀型的索狀肝細(xì)胞癌、(b)炎癥性細(xì)胞的浸潤(rùn)、(c)排擠正常肝細(xì)胞地發(fā)育而成的由肝硬化轉(zhuǎn)變的肝癌。
14.一種肝癌的治療用或預(yù)防用物質(zhì)的篩選方法，其包含以下的工序(a)和(b)(a)向權(quán)利要求12或13所述的肝癌模型非人類動(dòng)物投予待測(cè)物質(zhì)的工序；(b)評(píng)價(jià)對(duì)肝癌的治療效果的工序。
15.一種針對(duì)藥物對(duì)肝癌治療的藥效評(píng)價(jià)方法，其包含以下的工序(a)和(b)(a)向權(quán)利要求12或13所述的肝癌模型非人類動(dòng)物投予待測(cè)藥物的工序；(b)評(píng)價(jià)對(duì)肝癌的治療效果的工序。
全文摘要
本發(fā)明通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物投予臟器炎癥誘導(dǎo)劑而引起胰島素抵抗性、進(jìn)而使用高脂肪食物進(jìn)行飼養(yǎng)，從而誘發(fā)脂肪肝。結(jié)果，對(duì)該動(dòng)物成功地使其患有脂肪性肝炎。該動(dòng)物顯示與人類相類似的病理觀察結(jié)果。通過(guò)使用該模型動(dòng)物，可以有效地實(shí)施疾病的治療或預(yù)防用物質(zhì)的篩選以及藥物的藥效評(píng)價(jià)。
文檔編號(hào)A01K67/027GK102548393SQ20098016172
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2009年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月31日
發(fā)明者米山博之, 藤井莊人 申請(qǐng)人:斯特里克再生醫(yī)學(xué)學(xué)院,斯特里克學(xué)院事務(wù)所