專利名稱：：使用脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生乳化劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及含有脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的食品酶組合物和/或飼料酶組合物，以及所述組合物在本發(fā)明方法中的用途。本發(fā)明還涉及鑒定適宜本發(fā)明的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的方法，及如前述所鑒定的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶。本發(fā)明進一步還涉及固定化的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶。
背景技術(shù)：
：眾所周知，多年來在食品或飼料工業(yè)中應(yīng)用的磷脂酶以及脂酶(稱為脂解酶(EC.3.1.1.x)的有利用途。例如，在EP0585988中聲稱在面團中添加脂酶具有促進抗腐敗(antistaling)效應(yīng)的作用。提示從少根根霉菌(Rhizopusarrhizus)中得到的脂酶，在與起酥油/脂肪(shortening/fat)聯(lián)用時，添加到面團中可提高所生產(chǎn)的面包的質(zhì)量。W094/04035中教導(dǎo)在面團中添加脂酶可改善柔軟性而不需另外添加脂類或油類。Castello，P.ESEGP89-10Dec.1999赫爾辛基，表明外源性脂酶可以改變面包體積。脂解酶(lipolyticenzyme)可將食品中的脂質(zhì)水解出一種或多種脂肪酸，使食品中產(chǎn)生有效的(powerful)乳化劑分子，這提供了有商業(yè)價值的功用。提供最顯著的乳化特性的分子是部分水解產(chǎn)物，諸如溶血磷脂(lyso-phospholipid)、溶血糖脂(lyso-glycolipid)和甘油單酯(mono-glyceride)分子。極性脂質(zhì)水解產(chǎn)物，如溶血磷脂和溶血糖脂是具體優(yōu)選的。在制作面包時，所述原位產(chǎn)生的乳化劑可起到與乳化劑(諸如DATEM)相當?shù)淖饔?。但是，脂解酶的活性也?dǎo)致游離脂肪酸的堆積，這可能對食品產(chǎn)生不良作用。脂解酶的固有活性限制了他們的功能。本領(lǐng)域嘗試了多種方法解決此技術(shù)問題。然而，這些方法可以導(dǎo)致食品中游離脂肪酸顯著增加，特別是對于含水量高的食品，包括但不僅限于面包面團和蛋黃。磷脂酶，特別是磷脂酶A2(E.C.3.1.1.4)，在蛋或基于蛋的食品處理中應(yīng)用多年(例如參見US4,034,124和Dutihl&Groger1981J.Sci.FoodAgric.32，451-458)，磷脂酶在蛋或基于蛋的食品處理中使具有乳化劑作用的極性溶血卵磷脂蓄積，磷脂酶處理蛋或基于蛋的產(chǎn)品可提高穩(wěn)定性，如巴氏滅菌法等熱處理時的熱穩(wěn)定性，并且具有明顯的稠化作用?；诘暗漠a(chǎn)品包括但不僅限于蛋糕、蛋黃醬、色拉調(diào)料、調(diào)味醬、冰淇淋等等。磷脂酶的應(yīng)用使游離脂肪酸蓄積。游離脂肪酸的蓄積可能明顯影響產(chǎn)品香味，另外，游離脂肪酸的蓄積使產(chǎn)品易于氧化，因此產(chǎn)品保質(zhì)期短，易變色以及其它食品重要性質(zhì)如口味和質(zhì)地改變。近來，具有廣泛底物特異性的脂解酶已經(jīng)市場化用于處理蛋黃和相關(guān)食品。它們的優(yōu)勢在于不像多數(shù)的磷脂酶A2，它們不是源于哺乳動物。但是它們會導(dǎo)致游離脂肪酸顯著蓄積，不僅僅是導(dǎo)致磷脂的水解，還包括導(dǎo)致甘油三酯的水解。如同前面提到的，脂酶廣泛應(yīng)用的另一領(lǐng)域是面包制造業(yè)。八十年代早期，磷脂酶就已應(yīng)用于烘焙工藝。小麥粉中脂酶作用的底物是1.5-3％內(nèi)源性小麥脂質(zhì)，所述內(nèi)源性小麥脂質(zhì)是極性與非極性脂質(zhì)的混合物。極性脂質(zhì)分為糖脂和磷脂。這些脂質(zhì)與兩個脂肪酸和一個極性基團所酯化的甘油構(gòu)成。該極性基團對這些脂質(zhì)的表面活性產(chǎn)生貢獻。對這些脂質(zhì)中的脂肪酸之一的酶解能使脂質(zhì)具有更高的表面活性。公知的，諸如DATEM等具有高表面活性的乳化劑被添加到面團中可產(chǎn)生顯著作用。然而，脂酶(E.C.3.1.1.X)在生面類產(chǎn)品中使用會對酵母活性產(chǎn)生損害作用，和/或?qū)γ姘w積產(chǎn)生負面影響，對面包體積的負面影響往往以劑量過大來解釋。劑量過大可導(dǎo)致面筋彈力下降，這使面團過硬，使面包體積縮小。另外，或可選，這些脂酶會降解添加到面團中的起酥油、油脂和乳脂，導(dǎo)致面團和烘焙食品的味道變壞。劑量過大和味道變壞歸因于面團中游離脂肪酸的蓄積。據(jù)EP1193314，EP0977869和WO01/39602中記載，在制作面包的過程中應(yīng)用作用于糖脂的脂解酶有很大的好處，其部分水解產(chǎn)物-溶血糖脂具有強的乳化作用，顯然導(dǎo)致與游離脂肪酸的不良蓄積相比更高比例的積極乳化劑作用。但是，酶對甘油三酯具有顯著的非選擇性作用，從而產(chǎn)生不必要的大量游離脂肪酸。WO00/32758報導(dǎo)了同樣發(fā)現(xiàn)，除對長鏈而非短鏈脂肪酸有選擇性的變體外，還公開了對磷脂和/或糖脂有增強活性的脂解酶變體。WO01/39602也公開了后一特性，認為對防止游離短鏈脂肪酸蓄積造成的味道變壞尤為重要。然而，會產(chǎn)生大量的游離脂肪酸。在W002/094123提到高甘油三酯活性問題，使用脂解酶作用于面團中的極性脂質(zhì)(如磷脂和糖脂)，而對于甘油三酯或1-甘油單酯基本沒有活性。但會產(chǎn)生大量的游離脂肪酸。有些脂解酶對極性脂質(zhì)(如糖脂/磷脂)處于溶解狀態(tài)時呈現(xiàn)低活性或者無活性。此類酶的應(yīng)用被認為是優(yōu)選的，因為這類酶可以使高極性可溶脂質(zhì)(lyso-lipid)聚集從而產(chǎn)生最佳功效。但是游離脂肪酸也同時會蓄積。這種選擇性功能是磷脂酶A2和公開在EP0977869，EP1193314，和WO01/39602中的糖脂的特點。已制備了低選擇性脂解酶的變異酶，與其母體酶相比對極性可溶脂質(zhì)活性更低(WO03/060112)。但會有顯著的游離脂肪酸生成。WO00/05396中指出含有一種乳化劑食品的加工過程中，食品原料與酶接觸，在酶的作用下，從脂肪酸酯中可就生成乳化劑，并且第二功能性成分從第二成分中產(chǎn)生。WO00/05396還教導(dǎo)了脂酶或脂酶的具體用途。但在WO00/05396中沒有講到脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的具體用法，另外，WO00/05396談到，含水量高的食品中使用酯酶和脂酶會導(dǎo)致顯著的游離脂肪酸蓄積。使用脂酶包括磷脂酶和糖脂酶伴隨產(chǎn)生的缺點可由脂質(zhì)釋放的游離脂肪酸累積導(dǎo)致的。在過去的二十年間，脂解酶在食品中的應(yīng)用受限是由于游離脂肪酸有害的蓄積與有積極作用的可溶脂質(zhì)的生成之間存在的一種平衡關(guān)系。雖然在本領(lǐng)域內(nèi)進行了大量的嘗試，其中一些明顯改善了功能，但現(xiàn)有技術(shù)沒有一個方法能完全說明并解決根本問題，即用脂解酶原位生產(chǎn)的食品中有游離脂肪酸大量蓄積。未加工的原料或食品產(chǎn)品中存在高水平游離脂肪酸(FFA)普遍被認為是質(zhì)量缺陷，食品生產(chǎn)商和消費者往往在食品規(guī)范中規(guī)定了FFA的最高水平。過量的FFA水平可能會導(dǎo)致器官感覺上和/或功能上的缺陷。脂解作用可導(dǎo)致食品的水解酸敗，形成特異的“肥皂”氣味，這種“肥皂”氣味對食品如乳制品或植物油中的重要成分中等鏈長度(C8-C12)的脂肪酸尤為顯著，盡管這種脂肪酸不會高水平存在。一個更普遍的感覺器官不足是由于脂解酶和氧化過程的聯(lián)合效用。當在酰基脂質(zhì)中非酯化時不飽和脂肪酸對酶促氧化作用比其發(fā)生酯化時更為敏感。已確認高水平FFA導(dǎo)致食品功能性缺陷，但仍不能很好的解釋。不局限于理論，未發(fā)生改變的脂質(zhì)水解成羧酸使[H+]增加，并產(chǎn)生與其它化合物或金屬離子結(jié)合的羰基。游離脂肪酸還可以通過疏水性相互作用與蛋白質(zhì)結(jié)合，在烹飪過程中與淀粉結(jié)合(complex)。FFA還可以干擾表面活化劑如極性脂質(zhì)和乳化劑的作用(LipidinCerealTechnology，P.J.Bames，AcademicPress1983.)W003/100044公開了一類已知為PDAT(或ATWAX)的?；D(zhuǎn)移酶。這些酶利用甘油單酯或甘油二酯作為受體分子，以磷酸卵磷酯(PC)作為供體分子，產(chǎn)生如下產(chǎn)物可溶的磷酸卵磷酯、三酰甘油和/或二酰甘油。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明涉及將乳清蛋白摻入食品中的改進，提供了在不降低其質(zhì)量例如食品組合物和產(chǎn)品本身質(zhì)地的前提下提高產(chǎn)量的方法。干酪組合物通常由液體奶制品通過包括用凝結(jié)劑或凝固劑處理所述液體的過程制備的。該凝結(jié)劑可以是凝乳酶(curdingenzyme)，酸，或者合適的細菌培養(yǎng)物，或者它包括所述培養(yǎng)物。形成的乳凝塊一般包括經(jīng)轉(zhuǎn)化的酪蛋白、脂肪包括天然的牛油脂肪、和當使用細菌培養(yǎng)物尤其需要的調(diào)味劑。乳凝塊可以與液體狀乳清分離，乳清中含有不受凝結(jié)反應(yīng)影響的可溶性蛋白，因此沒有摻入乳凝塊中。乳清因此是生產(chǎn)食品-例如干酪的商業(yè)方法生產(chǎn)的副產(chǎn)品。傳統(tǒng)意義上，乳清被當作無用的廢物或者被用作肥料或飼料或被加工成食品成分。乳清蛋白不能充分的被保留在乳凝塊中是導(dǎo)致奶制品諸如干酪乳凝塊常規(guī)生產(chǎn)的效率低下以及與起始乳制液體中所有的蛋白質(zhì)固體摻入所得干酪凝塊中相關(guān)的總產(chǎn)量縮減的重要原因。進行許多努力用以將乳清蛋白包含到干酪中，例如通過加熱處理牛奶，加熱處理乳清，或通過過濾例如超濾。也有關(guān)于應(yīng)用具體可蛋白酶誘導(dǎo)乳清蛋白聚集的數(shù)篇記述。源于地衣芽孢桿菌(Bacilluslichenformis)的絲氨酸蛋白酶顯示出誘導(dǎo)乳清蛋白聚集的能力(US5,523,237)。然而，在生產(chǎn)過程諸如制造干酪中添加乳清蛋白還存在許多難點。例如，乳清蛋白摻入干酪中與產(chǎn)品口味和口感的下降有關(guān)，進一步還會干擾凝結(jié)和產(chǎn)品的后續(xù)加工。已有報道將蛋白酶加入干酪乳用于水解乳清蛋白導(dǎo)致酪蛋白的明顯水解，如Madsen，J.S.&Qvist，K.B.(1997)在“HydrolysisofmilkproteinbyaBacilluslicheniformisproteasespecificforacidicaminoacidresidues”(.JFoodSci.62，579-582)中所述。因此，在本領(lǐng)域需要這樣的方法和組合物，其在保留器官感覺和其它所需特性的同時改善了將乳清蛋白向食品中的摻入。這種優(yōu)化會導(dǎo)致效率的提高、食品產(chǎn)量的提高和總原料成本的降低。脂酶膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(cholesterolacyltransferase)已經(jīng)是已知的(參見例如Buckley-Biochemistry伯克利生物化學(xué)1983，22，5490-5493)。具體地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)甘油磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(GCAT)，它很象植物和/或哺乳動物卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)，可以催化脂肪酸在卵磷脂與膽固醇之間的轉(zhuǎn)移。厄普頓(Upton)和伯克利(Buckley)(TIBS20，May1995p178-179)及布魯米爾科(Brumlik)和伯克利(Buckley)(J.ofBacteriologyApr.1996p2060-2064)教導(dǎo)了源自嗜水氣單胞菌(Aeromonahydrophila)的脂酶/?；D(zhuǎn)移酶能夠?qū)Ⅴ；谒橘|(zhì)中轉(zhuǎn)移到乙醇受體上。發(fā)明概要本發(fā)明第一方面提供了一種在食品中原位產(chǎn)生乳化劑的方法，此方法包括將在這里定義的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶添加到食品中的步驟。在另一方面，本發(fā)明提供了一種在食品中原位產(chǎn)生乳化劑的方法，其中所述方法使得所述乳化劑在食品中的游離脂肪酸不增加或基本不增加的情況下生成，所述方法包括將一種脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶添加到食品中的步驟。另一方面，本發(fā)明提供了一種在食品中原位產(chǎn)生乳化劑以及甾醇酯和/或甾烷醇酯的方法，其中所述方法使得所述乳化劑在食品中的游離脂肪酸不增加或基本不增加的情況下生成，所述方法包括將一種脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶添加到食品中的步驟。另一方面，本發(fā)明提供了一種在食品中原位產(chǎn)生乳化劑以及甾醇酯和/或甾烷醇酯的方法，所述方法包括將一種脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶添加到食品中的步驟。本發(fā)明的另一方面，提供了一種在食品中原位產(chǎn)生至少兩種乳化劑的方法，所述方法包括將一種脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶添加到食品中的步驟。本發(fā)明的另一方面，提供了一種在食品中原位產(chǎn)生至少兩種乳化劑以及甾醇酯和/或甾烷醇酯的方法，其中所述方法使得所述乳化劑在食品中的游離脂肪酸不增加或基本不增加的情況下生成，所述方法包括將一種脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶添加到食品中的步驟。本發(fā)明的另一方面提供了一種在食品中原位產(chǎn)生至少兩種乳化劑以及甾醇酯和/或甾烷醇酯的方法，所述方法包括將一種脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶添加到食品中的步驟。本發(fā)明的另一方面提供了一種在食品中原位產(chǎn)生碳水化合物酯的方法，所述方法包括將一種脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶添加到食品中的步驟。本發(fā)明的另一方面提供了一種在食品中原位產(chǎn)生碳水化合物酯和乳化劑的方法，所述方法包括將一種脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶添加到食品中的步驟。本發(fā)明的另一方面提供了一種在食品中原位產(chǎn)生乳化劑，以及一種或多種碳水化合物酯、甾醇酯、甾烷醇酯、蛋白質(zhì)酯、甘油單酯或甘油二酯的方法，所述方法包括將一種脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶添加到食品中的步驟。本發(fā)明的另一方面提供了一種包含一種乳化劑的食品的產(chǎn)生方法，所述方法包括將這里定義的一種脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶添加到食品中的步驟。本發(fā)明的另一方面提供了一種包含一種乳化劑的食品的產(chǎn)生方法，其中所述方法使得所述乳化劑在食品中的游離脂肪酸不增加或基本不增加的情況下生成，所述方法包括將脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶添加到食品中的步驟。本發(fā)明的另一方面提供了一種包含乳化劑以及甾醇酯和/或甾烷醇酯的食品的產(chǎn)生方法，其中所述方法使得所述乳化劑在食品中的游離脂肪酸不增加或基本不增加的情況下生成，所述方法包括將一種脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶添加到食品中的步驟。本發(fā)明的另一方面提供了一種包含乳化劑以及甾醇酯和/或甾烷醇酯的食品的產(chǎn)生方法，所述方法包括將一種脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶添加到食品中的步驟。本發(fā)明的另一方面提供了一種包含至少兩種乳化劑的食品的產(chǎn)生方法，所述方法包括將一種脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶添加到食品中的步驟。本發(fā)明的另一方面提供了一種包含至少兩種乳化劑以及甾醇酯和/或甾烷醇酯的食品的產(chǎn)生方法，其中所述方法使得所述乳化劑在食品中的游離脂肪酸不增加或基本不增加的情況下生成，所述方法包括將一種脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶添加到食品中的步驟。本發(fā)明的另一方面提供了一種包含至少兩種乳化劑以及甾醇酯和/或甾烷醇酯的食品的產(chǎn)生方法，所述方法包括將一種脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶添加到食品中的步驟。本發(fā)明的另一方面提供了一種包含碳水化合物酯的食品的產(chǎn)生方法，所述方法包括將一種脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶添加到食品中的步驟。本發(fā)明的另一方面提供了一種包含碳水化合物酯和乳化劑的食品的產(chǎn)生方法，所述方法包括將一種脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶添加到食品中的步驟。本發(fā)明的另一方面提供了一種包含乳化劑以及一種或多種碳水化合物酯、甾醇酯、甾烷醇酯、蛋白質(zhì)酯、甘油單酯或甘油二酯的食品的產(chǎn)生方法，所述方法包括將一種脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶添加到食品中的步驟。本發(fā)明的另一方面提供了脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶用于從食品原料制備含乳化劑的食品的用途，其中所述乳化劑是通過脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶從食品原料組分中產(chǎn)生的。本發(fā)明的另一方面提供了脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶用于從食品原料制備含乳化劑的食品的用途，其中所述方法使得所述乳化劑在食品中的游離脂肪酸不增加或基本不增加的情況下生成，其中所述乳化劑是通過脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶從食品原料組分中產(chǎn)生的。在另一方面，本發(fā)明提供了脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶用于從食品原料制備含乳化劑以及甾醇酯和/或甾烷醇酯的食品的用途，其中所述方法使得所述乳化劑在食品中的游離脂肪酸不增加或基本不增加的情況下生成，其中所述乳化劑和/或甾醇酯和/或甾烷醇酯通過脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶從食品原料組分中產(chǎn)生。在另一方面，本發(fā)明提供了脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶用于從食品原料制備含乳化劑以及甾醇酯和/或甾烷醇酯的食品的用途，其中所述乳化劑和/或甾醇酯和/或甾烷醇酯是通過脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶從食品原料組分中產(chǎn)生的。在另一方面，本發(fā)明提供了脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶用于從食品原料制備含有至少兩種乳化劑的食品的用途，其中所述兩種乳化劑是通過脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶從食品原料組分中產(chǎn)生的。本發(fā)明另一方面提供了脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶用于從食品原料制備含有至少兩種乳化劑以及甾醇酯和/或甾烷醇酯的食品的用途，其中所述方法使得所述乳化劑在食品中的游離脂肪酸不增加或基本不增加的情況下生成，所述乳化劑的一種或兩種和/或甾醇酯和/或甾烷醇酯是通過脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶從食品原料組分中產(chǎn)生的。本發(fā)明另一方面提供了脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶用于從食品原料制備含有至少兩種乳化劑以及甾醇酯和/或甾烷醇酯的食品的用途，所述乳化劑的一種或兩種和/或甾醇酯和/或甾烷醇酯是通過脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶從食品原料組分中產(chǎn)生的。本發(fā)明另一方面提供了脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶用于從食品原料制備含有碳水化合物酯的食品的用途，其中所述碳水化合物酯是通過脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶從食品原料組分中產(chǎn)生的。在另一方面，本發(fā)明提供了脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶用于從食品原料制備含有至少一種碳水化合物酯和其它乳化劑的食品的用途，其中所述碳水化合物酯和乳化劑是通過脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶從食品原料組分中產(chǎn)生的。在另一方面，本發(fā)明提供了脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶用于從食品原料制備含有乳化劑和一種或多種碳水化合物酯、甾醇酯、甾烷醇酯、蛋白質(zhì)酯、甘油單酯或甘油二酯的食品的用途，其中所述乳化劑和/或碳水化合物酯和/或甾醇酯和/或甾烷醇酯和/或蛋白質(zhì)酯和/或甘油單酯和/或甘油二酯是通過脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶從食品原料組分中產(chǎn)生的。本發(fā)明另一方面提供了一種在基于蛋類的食品中原位產(chǎn)生乳化劑(優(yōu)選溶血卵磷脂)和甾醇酯的方法，其中所述方法使得所述乳化劑在食品中的游離脂肪酸不增加或基本不增加的情況下生成，所述方法包括將一種脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶添加到食品中的步驟。本發(fā)明另一方面提供了一種在基于蛋類的食品中原位產(chǎn)生乳化劑(優(yōu)選溶血卵磷脂)和甾醇酯的方法，其中所述方法包括將一種脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶添加到食品中的步驟。在另一方面，本發(fā)明提供了一種基于蛋類的食品的產(chǎn)生方法，所述基于蛋類的食品中含有一種乳化劑(優(yōu)選溶血卵磷脂)和甾醇酯，其中所述方法使得所述乳化劑在食品中的游離脂肪酸不增加或基本不增加的情況下生成，所述方法包括將一種脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶添加到食品中的步驟。在另一方面，本發(fā)明提供了一種基于蛋類的食品的產(chǎn)生方法，所述基于蛋類的食品中含有乳化劑(優(yōu)選溶血卵磷脂)和甾醇酯，所述方法包括將一種脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶添加到食品中的步驟。本發(fā)明另一方面還提供了按照本發(fā)明的方法可得到的、優(yōu)選得到的食品。在另一方面，本發(fā)明進一步涉及包含脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的食品酶組合物和/或飼料酶組合物及所述組合物在本方明的方法中的用途。本發(fā)明另一方面進一步提供了一種適合于本發(fā)明應(yīng)用的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的鑒別方法，該方法包括以下步驟應(yīng)用“低水分環(huán)境中的轉(zhuǎn)移酶測定法”(″TransferaseAssayinaLowWaterenvironment″)，“高水分蛋黃中的轉(zhuǎn)移酶測定法”(″TransferaseAssayinHighWaterEggYolk″)或“經(jīng)緩沖的底物中的轉(zhuǎn)移酶測定法”(″TransferaseAssayinBufferedSubstrate″)中的一種或多種測定目標酶，并選擇一種脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶，該酶具有以下一種或多種性質(zhì)(a)應(yīng)用“低水分環(huán)境中的轉(zhuǎn)移酶測定法”進行檢測時，在經(jīng)過選自30、20或120分鐘之一的時間后具有至少1％的相對轉(zhuǎn)移酶活性；(b)在含54％水分的蛋黃中應(yīng)用“高水分蛋黃中的轉(zhuǎn)移酶測定法”進行檢測時，具有高達100％的相對轉(zhuǎn)移酶活性；或者(c)應(yīng)用“經(jīng)緩沖的底物中的轉(zhuǎn)移酶測定法”進行檢測時，具有至少2％的?；D(zhuǎn)移酶活性。本發(fā)明還進一步提供了一種應(yīng)用本發(fā)明的方法鑒定的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶。在另一方面，本發(fā)明提供了一種這里定義的固定化脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶。本發(fā)明還涉及1)一種在食品中原位生產(chǎn)乳化劑的方法，該方法包括將脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶添加到食品中的步驟。2)項1所述的方法，其中有至少兩種乳化劑生成。3)項1或項2所述的方法，其中所述乳化劑在食品中的游離脂肪酸不增加或基本不增加的情況下生成。4)項1-3任意一項所述的方法，其中所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶是這樣一種酶，其能夠?qū)Ⅴ；鶑闹|(zhì)轉(zhuǎn)移到下述酰基受體中的一種或多種固醇、甾烷醇、碳水化合物、蛋白質(zhì)或其亞基、甘油。5)項2所述的方法，其中至少一種乳化劑是碳水化合物酯。6)項2所述的方法，其中至少一種乳化劑是蛋白質(zhì)酯。7)前述任意一項項所述的方法，其中甾醇酯或甾烷醇酯或蛋白質(zhì)酯或碳水化合物酯或甘油二酯或甘油單酯中的一種或多種在食品中原位生成。8)項7所述的方法，其中所述甾醇酯是一種或多種α-谷甾醇酯、β-谷甾醇酯、豆甾醇酯、麥角固醇酯、油菜甾醇酯或膽固醇酯。9)項6所述的方法，其中所述甾烷醇酯是一種或多種β-谷甾醇或ss-谷甾醇。10)前述項任意一項所述的方法，其中所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的特征在于其為這樣一種酶，它具有酰基轉(zhuǎn)移酶活性，并包含氨基酸基序GDSX，其中X是以下氨基酸殘基中的一種或多種殘基L，A，V，I，F(xiàn)，Y，H，Q，T，N，M或S。11)前述項任意一項所述的方法，其中所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶包含H-309，或包含組氨酸殘基，該組氨酸位于與SEQIDNo.2或SEQIDNo.32所示嗜水氣單胞菌脂解酶的氨基酸序列中的His-309相對應(yīng)的位置。12)前述項任意一項所述的方法，其中所述的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以從一或多種下列屬的生物體獲得氣單胞菌、鏈霉菌、酵母菌、乳球菌、分枝桿菌、鏈球菌、乳桿菌、脫亞硫酸菌、芽孢桿菌、彎曲桿菌、弧菌科、木桿菌、硫化葉菌、曲霉、裂殖酵母、李司忒氏菌、奈瑟氏球菌、中慢生根瘤菌屬(Mesorhizobium)、雷爾氏菌、黃單胞菌和念珠菌。13)前述項任意一項所述的方法，其中所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶包含一種或多種以下氨基酸序列(i)SEQIDNo.2所示氨基酸序列；(ii)SEQIDNo.3所示氨基酸序列；(iii)SEQIDNo.4所示氨基酸序列；(iv)SEQIDNo.5所示氨基酸序列；(v)SEQIDNo.6所示氨基酸序列；(vi)SEQIDNo.12所示氨基酸序列；(vii)SEQIDNo.20所示氨基酸序列；(viii)SEQIDNo.22所示氨基酸序列；(ix)SEQIDNo.24所示氨基酸序列；(x)SEQIDNo.26所示氨基酸序列；(xi)SEQIDNo.28所示氨基酸序列；(xii)SEQIDNo.30所示氨基酸序列；(xiii)SEQIDNo.32所示氨基酸序列；(xiv)SEQIDNo.34所示氨基酸序列，或者與SEQIDNo.2，SEQIDNo.3，SEQIDNo.4，SEQIDNo.5，SEQIDNo.6，SEQIDNo.12，SEQIDNo.20，SEQIDNo.22，SEQIDNo.24，SEQIDNo.26，SEQIDNo.28，SEQIDNo.30，SEQIDNo.32，或SEQIDNo.34所示的任意一種序列有75％或者75％以上同一性的氨基酸序列。14)前述項任意一項所述的方法，其中所述乳化劑是下列物質(zhì)中的一種或多種甘油單酯、溶血磷脂酰膽堿、DGMG。15)脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶在從食物原料制備包含乳化劑的食品中的用途，其中所述乳化劑在食品中的游離脂肪酸不增加或基本不增加的情況下生成，所述乳化劑是通過脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶從食物原料組分中產(chǎn)生的。16)項15所述的用途，其中有至少兩種乳化劑生成。17)項16所述的用途，其中至少一種乳化劑是碳水化合物酯。18)項16所述的用途，其中至少一種乳化劑是蛋白質(zhì)酯。19)項15-18中任意一項所述的用途，其中一種或多種甾醇酯或甾烷醇酯或蛋白質(zhì)酯或碳水化合物酯或甘油二酯或甘油單酯也在食品中原位產(chǎn)生。20)項19所述的用途，其中所述的甾醇酯是α-谷甾醇酯、β-谷甾醇酯、豆甾醇酯、麥角固醇酯、油菜甾醇酯或膽固醇酯中的一種或多種物質(zhì)。21)項20所述的用途，其中所述甾烷醇酯是一種或多種β-谷甾醇或ss-谷甾醇。22)項15-21中任意一項所述的用途，其中所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的特征在于其為這樣一種酶，它具有?；D(zhuǎn)移酶活性，并包含氨基酸基序GDSX，其中X是以下氨基酸殘基中的一或多種殘基L，A，V，I，F(xiàn)，Y，H，Q，T，N，M或S。23)項15-22中任意一項所述的用途，其中所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶包含H-309，或包含組氨酸殘基，該組氨酸位于與SEQIDNo.2或SEQIDNo.32所示嗜水氣單胞菌脂解酶的氨基酸序列中的His-309相對應(yīng)的位置。24)項15-23中任意一項所述的用途，其中所述的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶可以從一或多種下列屬的生物體獲得氣單胞菌、鏈霉菌、酵母菌、乳球菌、分枝桿菌、鏈球菌、乳桿菌、脫亞硫酸菌、芽孢桿菌、彎曲桿菌、弧菌科、木桿菌屬、硫化葉菌、曲霉、裂殖酵母、李司忒氏菌、奈瑟氏球菌、中慢生根瘤菌屬、雷爾氏菌、黃單胞菌和念珠菌。25)項15-24中任意一項所述的用途，其中所述脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶包含一種或多種以下氨基酸序列(i)SEQIDNo.2所示氨基酸序列；(ii)SEQIDNo.3所示氨基酸序列；(iii)SEQIDNo.4所示氨基酸序列；(iv)SEQIDNo.5所示氨基酸序列；(v)SEQIDNo.6所示氨基酸序列；(vi)SEQIDNo.12所示氨基酸序列；(vii)SEQIDNo.20所示氨基酸序列；(viii)SEQIDNo.22所示氨基酸序列；(ix)SEQIDNo.24所示氨基酸序列；(x)SEQIDNo.26所示氨基酸序列；(xi)SEQIDNo.28所示氨基酸序列；(xii)SEQIDNo.30所示氨基酸序列；(xiii)SEQIDNo.32所示氨基酸序列；(xiv)SEQIDNo.34所示氨基酸序列，或者與SEQIDNo.2，SEQIDNo.3，SEQIDNo.4，SEQIDNo.5，SEQIDNo.6，SEQIDNo.12，SEQIDNo.20，SEQIDNo.22，SEQIDNo.24，SEQIDNo.26，SEQIDNo.28，SEQIDNo.30，SEQIDNo.32，或SEQIDNo.34所示的任意一種序列有75％或者75％以上同一性的氨基酸序列。26)項15-25中任意一項所述的用途，其中所述乳化劑是下列物質(zhì)中的一種或多種甘油單酯、溶血磷脂酰膽堿、DGMG。27)一種食品酶組合物或飼料酶組合物，其含有脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶。28)項27所述的食品酶組合物或飼料酶組合物，其中所述脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的特征在于其為這樣一種酶，它具有?；D(zhuǎn)移酶活性，并包含氨基酸基序GDSX，其中X是以下氨基酸殘基中的一或多種殘基L，A，V，I，F(xiàn)，Y，H，Q，T，N，M或S。29)項27或28所述的食品酶組合物或飼料酶組合物，其中所述脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶包含H-309，或包含組氨酸殘基，該組氨酸位于與SEQIDNo.2或SEQIDNo.32所示嗜水氣單胞菌脂解酶的氨基酸序列中的His-309相對應(yīng)的位置。30)項27-29中任意一項所述的食品酶組合物或飼料酶組合物，其中所述的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶可以從一或多種下列屬的生物體獲得氣單胞菌、鏈霉菌、酵母菌、乳球菌、分枝桿菌、鏈球菌、乳桿菌、脫亞硫酸菌、芽孢桿菌、彎曲桿菌、弧菌科、木桿菌屬、硫化葉菌、曲霉、裂殖酵母、李司忒氏菌、奈瑟氏球菌、中慢生根瘤菌屬、雷爾氏菌、黃單胞菌和念珠菌。31)項27-30中任意一項所述的食品酶組合物或飼料酶組合物，其中所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶包含一種或多種以下氨基酸序列(i)SEQIDNo.2所示氨基酸序列；(ii)SEQIDNo.3所示氨基酸序列；(iii)SEQIDNo.4所示氨基酸序列；(iv)SEQIDNo.5所示氨基酸序列；(v)SEQIDNo.6所示氨基酸序列；(vi)SEQIDNo.12所示氨基酸序列；(vii)SEQIDNo.20所示氨基酸序列；(viii)SEQIDNo.22所示氨基酸序列；(ix)SEQIDNo.24所示氨基酸序列；(x)SEQIDNo.26所示氨基酸序列；(xi)SEQIDNo.28所示氨基酸序列；(xii)SEQIDNo.30所示氨基酸序列；(xiii)SEQIDNo.32所示氨基酸序列；(xiv)SEQIDNo.34所示氨基酸序列，或者與SEQIDNo.2，SEQIDNo.3，SEQIDNo.4，SEQIDNo.5，SEQIDNo.6，SEQIDNo.12，SEQIDNo.20，SEQIDNo.22，SEQIDNo.24，SEQIDNo.26，SEQIDNo.28，SEQIDNo.30，SEQIDNo.32，或SEQIDNo.34所示的任意一種序列有75％或者75％以上同一性的氨基酸序列。32)項27-31中任意一項所述的食品酶組合物或飼料酶組合物依照項15-26中任意一項的用途，或在項1-14中任意一項的方法中的用途。33)一種食品，其可用項1-14中任意一項所述的方法獲得。34)一種固定化的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶。35)項34所述固定化的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶，其中所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的特征在于其為這樣一種酶，它具有?；D(zhuǎn)移酶活性，并包含氨基酸基序GDSX，其中X是以下氨基酸殘基中的一或多種殘基L，A，V，I，F(xiàn)，Y，H，Q，T，N，M或S。36)項34或項35所述固定化的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶，其中所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶包含H-309，或包含組氨酸殘基，該組氨酸位于與SEQIDNo.2或SEQIDNo.32所示嗜水氣單胞菌脂解酶的氨基酸序列中的His-309相對應(yīng)的位置。37)項34-36中任意一項所述固定化的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶，其中所述的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以從一或多種下列屬的生物體獲得氣單胞菌、鏈霉菌、酵母菌、乳球菌、分枝桿菌、鏈球菌、乳桿菌、脫亞硫酸菌、芽孢桿菌、彎曲桿菌、弧菌科、木桿菌屬、硫化葉菌、曲霉、裂殖酵母、李司忒氏菌、奈瑟氏球菌、中慢生根瘤菌屬、雷爾氏菌、黃單胞菌和念珠菌。38)項34-37中任意一項所述固定化的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶，其中所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶包含一種或多種以下氨基酸序列(i)SEQIDNo.2所示氨基酸序列；(ii)SEQIDNo.3所示氨基酸序列；(iii)SEQIDNo.4所示氨基酸序列；(iv)SEQIDNo.5所示氨基酸序列；(v)SEQIDNo.6所示氨基酸序列；(vi)SEQIDNo.12所示氨基酸序列；(vii)SEQIDNo.20所示氨基酸序列；(viii)SEQIDNo.22所示氨基酸序列；(ix)SEQIDNo.24所示氨基酸序列；(x)SEQIDNo.26所示氨基酸序列；(xi)SEQIDNo.28所示氨基酸序列；(xii)SEQIDNo.30所示氨基酸序列；(xiii)SEQIDNo.32所示氨基酸序列；(xiv)SEQIDNo.34所示氨基酸序列，或者與SEQIDNo.2，SEQIDNo.3，SEQIDNo.4，SEQIDNo.5，SEQIDNo.6，SEQIDNo.12，SEQIDNo.20，SEQIDNo.22，SEQIDNo.24，SEQIDNo.26，SEQIDNo.28，SEQIDNo.30，SEQIDNo.32，或SEQIDNo.34所示的任意一種序列有75％或者75％以上同一性的氨基酸序列。39)一種鑒定適合用于本發(fā)明的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的方法，其中該方法包括下述步驟，即應(yīng)用“低水分環(huán)境中的轉(zhuǎn)移酶測定法”、“高水分蛋黃中的轉(zhuǎn)移酶測定法”或“經(jīng)緩沖的底物中的轉(zhuǎn)移酶測定法”中的一種或多種方法檢測目的酶，選擇具有下述一種或多種性質(zhì)的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶(a)當應(yīng)用“低水分環(huán)境中的轉(zhuǎn)移酶測定法”、在30、20、或120分鐘后進行檢測時具有至少1％的相對的轉(zhuǎn)移酶活性；(b)當應(yīng)用“高水分蛋黃中的轉(zhuǎn)移酶測定法”在含水54％的蛋黃中進行檢測時，具有至多100％的相對轉(zhuǎn)移酶活性；或者(c)當應(yīng)用“經(jīng)緩沖的底物中的轉(zhuǎn)移酶測定法”檢測時具有至少2％的?；D(zhuǎn)移酶活性。40)項39所述的方法，其中選擇這樣的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶，該酶具有以下性質(zhì)中兩種以上的性質(zhì)(a)當應(yīng)用“低水分環(huán)境中的轉(zhuǎn)移酶測定法”、在30、20、或120分鐘后進行檢測時具有至少1％的相對的轉(zhuǎn)移酶活性；(b)當應(yīng)用“高水分蛋黃中的轉(zhuǎn)移酶測定法”在含水54％的蛋黃中進行檢測時，具有至多100％的相對轉(zhuǎn)移酶活性；或者(c)當應(yīng)用“經(jīng)緩沖的底物中的轉(zhuǎn)移酶測定法”檢測時具有至少2％的?；D(zhuǎn)移酶活性。41)項39所述的方法，其中選擇這樣的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶，該酶具有以下性質(zhì)中三種以上的性質(zhì)(a)當應(yīng)用“低水分環(huán)境轉(zhuǎn)移酶測定法”時經(jīng)過選自30、20、或120分鐘的時間段后測量，得到至少1％的相對的轉(zhuǎn)移酶活性；(b)當檢測含水54％蛋黃時應(yīng)用“高水分蛋黃中轉(zhuǎn)移酶測定法”，得到至多100％的相對轉(zhuǎn)移酶活性；或者(c)當應(yīng)用“緩沖底物中轉(zhuǎn)移酶測定法”，得到至少2％轉(zhuǎn)移酶活性。42)項39所述的方法，其中選擇這樣的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶，該酶具有以下性質(zhì)中的所有性質(zhì)(a)當應(yīng)用“低水分環(huán)境轉(zhuǎn)移酶測定法”時經(jīng)過選自30、20、或120分鐘的時間段后測量，得到至少1％的相對的轉(zhuǎn)移酶活性；(b)當檢測含水54％蛋黃時應(yīng)用“高水分蛋黃中轉(zhuǎn)移酶測定法”，得到至多100％的相對轉(zhuǎn)移酶活性；或者(c)當應(yīng)用“緩沖底物中轉(zhuǎn)移酶測定法”，得到至少2％轉(zhuǎn)移酶活性。43)脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶，其利用根據(jù)項39-42中任意一項的方法而得以鑒定。本發(fā)明的詳細描述本文應(yīng)用的術(shù)語“脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶”是指一種也具有脂酶活性的酶(根據(jù)國際生物化學(xué)分子生物學(xué)聯(lián)合會命名委員會的酶命名法推薦(EnzymeNomenclatureRecommendations)(1992)通常分類為E.C.3.1.1.x)，該酶也具有?；D(zhuǎn)移酶活性(通常分類為E.C.2.3.1.x)，該酶能夠?qū)Ⅴ；鶑囊环N脂質(zhì)轉(zhuǎn)移到一種或多種受體底物，例如以下物質(zhì)的一種或多種固醇、甾烷醇、碳水化合物、蛋白質(zhì)或其亞單位或甘油。優(yōu)選的，在本發(fā)明的方法和/或本發(fā)明的用途中所用的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶能夠?qū)Ⅴ；鶑闹|(zhì)(如這里定義的)轉(zhuǎn)移到一種或多種下述?；荏w底物固醇、甾烷醇、碳水化合物、蛋白質(zhì)或其亞單位或甘油。在本發(fā)明的一些方面中的“?；荏w”可以是任何包含羥基的化合物，例如多價醇類包括甘油、固醇、甾烷醇、碳水化合物；羥基酸包括果酸、枸櫞酸、酒石酸、乳酸和抗壞血酸；蛋白質(zhì)或其亞單位如氨基酸、蛋白質(zhì)水解物和肽類(部分水解的蛋白質(zhì))，及其混合物和衍生物。對于本發(fā)明而言優(yōu)選的“?；荏w”不是水。在一實施方案中，所述?；荏w優(yōu)選不是甘油單酯和/或甘油二酯。在一方面中，所述酶能優(yōu)選將?；鶑闹|(zhì)轉(zhuǎn)移到固醇和/或甾烷醇。在一方面中，所述酶能優(yōu)選將酰基從脂質(zhì)轉(zhuǎn)移到碳水化合物。在一方面中，所述酶能優(yōu)選將?；鶑闹|(zhì)轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)或其亞單位。適宜的蛋白質(zhì)亞單位可能是下列一種或多種物質(zhì)氨基酸、蛋白質(zhì)水解物、縮氨酸，二肽，寡肽，多肽。適宜地，在蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)亞單位中，?；荏w可以是蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)亞單位的一或多種以下組分絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸或半胱氨酸。當?shù)鞍踪|(zhì)亞單位是氨基酸時，所述氨基酸宜為任何適合的氨基酸。適合的氨基酸宜為，舉例來說，絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸中的一種或多種。在一方面，所述酶能優(yōu)選將?；鶑闹|(zhì)轉(zhuǎn)移到甘油。在一方面，所述酶能優(yōu)選將酰基從脂質(zhì)轉(zhuǎn)移到羥基酸。在一方面，所述酶能優(yōu)選將?；鶑闹|(zhì)轉(zhuǎn)移到多價醇。在一方面，脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶還能將?；鶑闹|(zhì)轉(zhuǎn)移到固醇和/或甾烷醇，還能將?；鶑闹|(zhì)轉(zhuǎn)移到下列一種或多種物質(zhì)碳水化合物、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)水解物、甘油。優(yōu)選地，本發(fā)明的一些方面，脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶對其起作用的脂質(zhì)底物是下列一種或多種脂質(zhì)磷脂，諸如卵磷脂例如磷脂酰膽堿、三酰甘油、心磷脂、甘油二酯，或糖酯諸如雙半乳糖甘油二酯(DGDG)。此處所指的脂質(zhì)底物可稱為“脂質(zhì)?；w”，這里應(yīng)用的術(shù)語卵磷脂包括磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺，磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸和磷脂酰甘油。在一些方面，優(yōu)選地，脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶對其起作用的脂質(zhì)底物是磷脂，諸如卵磷脂，例如磷脂酰膽堿。在一些方面，優(yōu)選地，所述脂質(zhì)底物是糖脂，例如DGDG。脂質(zhì)底物優(yōu)選是食品脂質(zhì)，也就是說食品中的脂質(zhì)成分。在一些方面，優(yōu)選地，本發(fā)明的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶不能或基本不能作用于甘油三酯和/或1-甘油單酯和/或2-甘油單酯。脂質(zhì)底物或脂質(zhì)酰基供體宜為一種或多種脂質(zhì)，其存在于一種或多種下列底物中脂肪，包括豬油(lard)、牛羊油(tallow)、乳脂(butterfat)；油，包括從棕櫚油(palmoil)、葵花子油(sunfloweroil)、大豆油(soyabeanoil)、紅花油(saffloweroil)、棉籽油(cottonseedoil)、花生油(groundnutoil)、玉米油(cornoil)、橄欖油(oliveoil)、花生油(peanutoil)、椰子油(coconutoil)和油菜籽油(rapeseedoil)中提取或由它們衍生的油。來自大豆、油菜籽、或蛋黃的卵磷脂也是適宜的脂質(zhì)底物。脂質(zhì)底物也可以是燕麥脂質(zhì)或其它包含半乳糖脂的基于植物的物質(zhì)。在一方面，脂質(zhì)?；w優(yōu)選蛋黃中的卵磷脂(如磷脂酰膽堿)。在本發(fā)明的一些方面，脂質(zhì)可選自脂肪酸鏈長為8-22碳的脂質(zhì)。本發(fā)明的一些方面，脂質(zhì)可選自脂肪酸鏈長為16-22碳的脂質(zhì)，更優(yōu)選為16-20碳的脂質(zhì)。本發(fā)明的一些方面，脂質(zhì)可選自脂肪酸鏈長不多于14碳的脂質(zhì)，適宜地選自脂肪酸鏈長4-14碳的脂質(zhì)，適宜為4-10碳的脂質(zhì)，適宜為4-8碳的脂質(zhì)。適宜地，本發(fā)明中的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶可顯示出一種或多種下列脂酶的活性糖脂酶活性(E.C.3.1.1.26)，三酰甘油脂酶活性(E.C.3.1.1.3)，磷脂酶A2活性(E.C.3.1.1.4)，磷脂酶A1活性(E.C.3.1.1.32)。這里應(yīng)用的術(shù)語“糖脂酶活性”包括“半乳糖脂酶活性”。適宜地，本發(fā)明中的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶具有至少一種或多種下列活性糖脂酶活性(E.C.3.1.1.26)和/或磷脂酶A1活性(E.C.3.1.1.32)和/或磷脂酶A2活性(E.C.3.1.1.4)。對于本發(fā)明一些方面，脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶至少具有糖脂酶活性(E.C.3.1.1.26)。適宜地，對于一些方面，本發(fā)明的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可將?；鶑奶侵?或磷脂上轉(zhuǎn)移到以下一種或多種受體底物固醇，甾烷醇，碳水化合物，蛋白質(zhì)，甘油。一些方面，優(yōu)選本發(fā)明的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶可將?；鶑奶侵?或磷脂轉(zhuǎn)移到固醇和/或甾烷醇，形成至少甾醇酯和/或甾烷醇酯。一些方面，優(yōu)選本發(fā)明的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶可將?；鶑奶侵?或磷脂轉(zhuǎn)移到碳水化合物，形成至少碳水化合物酯。一些方面，優(yōu)選本發(fā)明的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可將?；鶑奶侵蛄字D(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)，形成至少蛋白酯(或蛋白脂肪酸縮合物(condensate))。一些方面，優(yōu)選本發(fā)明的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可將?；鶑奶侵?或磷脂轉(zhuǎn)移到甘油，至少形成甘油二酯和/或甘油單酯。一些方面，優(yōu)選本發(fā)明脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶不表現(xiàn)三酰甘油脂酶活性(E.C.3.1.1.3)。在一些方面，所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可將?；鶑闹|(zhì)轉(zhuǎn)移到固醇和/或甾烷醇。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明的“?；荏w”既可以是固醇又可以是甾烷醇，或二者的聯(lián)用物。在一個實施方案中，適宜的固醇和/或甾烷醇可以包括以下一種或多種結(jié)構(gòu)特征i)3-β羥基或3-α羥基；和/或ii)順式位置的A:B環(huán)或反式位置的A:B環(huán)或者C5-C6是不飽和的。適宜的固醇?；荏w包括膽固醇和植物甾醇(phytosterol)，例如α-谷甾醇(sitosterol)、β-谷甾醇、豆甾醇(stigmasterol)、麥角固醇(ergosterol)、油菜甾醇(campesterol)、5，6-二氫固醇、菜子固醇(brassicasterol)、α-菠菜甾醇(spinasterol)、β-菠菜甾醇、γ-菠菜甾醇、δ-菠菜甾醇、巖藻甾醇(fucosterol)、dimosterol、子囊甾醇(ascosterol)、serebisterol，、表甾醇(episterol)、anasterol、α-苯基丁酰胺(hyposterol)、chondrillasterol、鏈甾醇(desmosterol)、海綿甾醇(chalinosterol)、多孔甾醇(poriferasterol)、γ-谷甾醇(clionasterol)、固醇糖苷(sterolglycoside)和其它天然或合成的同分異構(gòu)體和衍生物。在本發(fā)明的一方面，適宜地，一種以上固醇和/或甾烷醇可以作為?；荏w，適宜地，兩種以上固醇和/或甾烷醇可以作為?；荏w。換言之，在本發(fā)明一個方面，適宜地，可以產(chǎn)生一種以上甾醇酯和/或甾烷醇脂。適宜地，當膽固醇是?；荏w時，一種或多種其他固醇和一種或多種甾烷醇也可作為酰基受體。因此，在一個方面，本發(fā)明提供了膽固醇酯與至少一種甾醇酯或甾烷醇酯的原位聯(lián)合產(chǎn)生方法。換言之，在本發(fā)明的一些方面，脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶可以將?；鶑闹|(zhì)上轉(zhuǎn)移到膽固醇與至少一種其它固醇和/或至少一種甾烷醇。在一方面，優(yōu)選的固醇酰基受體是下列一種或多種物質(zhì)α-谷甾醇、β-谷甾醇、豆甾醇、麥角固醇、油菜甾醇。在一方面，優(yōu)選的所述固醇酰基受體是膽固醇。當膽固醇作為脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的?；荏w的情況下，食品中游離膽固醇的量與用脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶處理前的食品中的游離膽固醇相比和/或與未經(jīng)脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶處理的等量食品中的游離膽固醇相比減少。適合的甾烷醇酰基受體包括植物甾醇，例如β-谷甾醇或ss-谷甾醇。在一方面，優(yōu)選地，所述固醇和/或甾烷醇酰基受體是除膽固醇之外的固醇和/或甾烷醇。在一些方面，按照本發(fā)明方法制備的食品可用于降低血清膽固醇和/或低密度脂蛋白。血清膽固醇和低密度脂蛋白與人類某些疾病有關(guān)，諸如動脈粥樣硬化和/或心臟病。因此，可以設(shè)想，按照本發(fā)明方法制備的食品可用于降低患這些疾病的風(fēng)險。因此，在本發(fā)明的一方面，提供了本發(fā)明中的食品用于治療和/或預(yù)防動脈粥樣硬化和/或心臟病的用途。在又一方面，本發(fā)明提供了一種含有本發(fā)明食品的藥劑。在又一方面，本發(fā)明提供了一種治療和/或預(yù)防人類和動物患者疾病的方法，所述方法包括給予患者有效量的本發(fā)明中的食品。適宜地，固醇和/或甾烷醇“?；荏w”可天然存在于所述食品中。所述固醇和/或甾烷醇可選擇地添加到食品中。在將固醇和/或甾烷醇添加到所述食品中的情況下，可在添加本發(fā)明的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶之前，同時，和/或之后在食品中添加固醇和/或甾烷醇。適當?shù)?，本發(fā)明的方法可包括在添加本發(fā)明的酶之前或者同時將外源性固醇/甾烷醇(具體為植物固醇/phytostanol)添加到食品中。在一些方面，在添加本發(fā)明的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶之前或同時，所述食品中的一種或多種的固醇可能被轉(zhuǎn)化成一種或多種甾烷醇。任何將固醇轉(zhuǎn)化成甾烷醇的適宜方法都可使用，例如，可以通過化學(xué)氫化作用實施所述轉(zhuǎn)化。這種轉(zhuǎn)化可在本發(fā)明的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶添加之前或本發(fā)明的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶添加的同時進行。將固醇轉(zhuǎn)化成甾烷醇的適宜的酶在WO00/061771中有教導(dǎo)。本發(fā)明可以適宜應(yīng)用于在食品中原位產(chǎn)生phytostanol酯。phytostanol酯具有增加的透類脂膜溶解性，生物利用度，且更加有益于健康(參見例如WO92/99640)。在本發(fā)明的一些具體實施方案中，甾烷醇酯和/或甾醇酯可以是一種調(diào)味劑和/或組織形成劑。在這些實施例中本發(fā)明包括了原位產(chǎn)生的調(diào)味劑和/或組織處理劑(texturiser)。在本發(fā)明的一些方面，本發(fā)明所述的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可利用碳水化合物作為酰基受體。碳水化合物?；荏w可以為以下物質(zhì)中的一種或多種單糖、二糖、寡糖或多糖。優(yōu)選的碳水化合物是以下物質(zhì)中的一種或多種葡萄糖、果糖、脫水果糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、半乳糖、木糖、木寡糖(xylooligosacharide)、阿拉伯糖、麥芽寡糖(maltooligosaccharide)、塔格糖(tagatose)、microthecin、ascopyroneP、ascopyroneT、cortalcerone。適宜地，碳水化合物“?；荏w”可以天然存在于食品中?？蛇x擇地，碳水化合物可以被添加到食品中。當向食品中添加碳水化合物時，可在添加本發(fā)明中的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶之前、同時、和/或之后添加碳水化合物。碳水化合物酯可以在食品中用作有價值的乳化劑。因此，當酶的作用為將?；D(zhuǎn)移到糖上時，本發(fā)明包括了在食品中產(chǎn)生第二原位乳化劑。在一些實施方案中，脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以利用固醇和/或甾烷醇以及碳水化合物作為酰基受體。對于包含蛋類的食品，利用可將酰基轉(zhuǎn)移到碳水化合物及固醇和/或甾烷醇上的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶特別有益。具體地，蛋類和蛋類食品中糖特別是葡萄糖的存在，常被認為是沒有益處的。蛋黃可以包含多至1％葡萄糖。通常，蛋類或基于蛋類的食品可以用葡萄糖氧化酶處理以去除部分或全部葡萄糖。然而，在本發(fā)明中，這種多余的糖可以很容易通過糖的酯化生成糖酯來去除。在本發(fā)明的一些方面，本發(fā)明所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以利用蛋白質(zhì)作為?；荏w。適宜的蛋白質(zhì)可以是食品中例如在乳制品和/或肉制品中的一種或多種蛋白質(zhì)。僅作為實例，適宜的蛋白質(zhì)可能是乳凝塊或乳清中的蛋白質(zhì)，如乳球蛋白。其它適宜的蛋白質(zhì)包括來自蛋類的卵清蛋白、麩蛋白(gliadin)、麥谷蛋白(glutenin)、puroindoline、谷物中的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白和肉類中的肌球蛋白。因此在本發(fā)明中，可以實現(xiàn)一種或多種如下的有益性質(zhì)原位產(chǎn)生乳化劑而不增加游離脂肪酸含量；食品中游離脂肪酸蓄積量下降；食品中的游離膽固醇水平下降；甾醇酯和/或甾烷醇酯增加；血清膽固醇和/或低密度脂蛋白下降；碳水化合物酯增加；多余的游離碳水化合物減少。本發(fā)明的優(yōu)勢在于，在食品中原位產(chǎn)生乳化劑而不增加或基本不增加食品中游離脂肪酸的含量。游離脂肪酸的產(chǎn)生對食品是有害的。具體地，游離脂肪酸與食品中氣味變壞(off-odour)和/或味道變壞(off-flavour)有關(guān)，另外還有其它有害影響，包括例如干酪中有肥皂味等等。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的方法使乳化劑在原位制備，減少和/或消除其中游離脂肪酸的蓄積。不局限于理論，根據(jù)本發(fā)明所述，用脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶將脂質(zhì)上的脂肪酸轉(zhuǎn)移到?；荏w，例如固醇和/或甾烷醇上。因此，食品中的游離脂肪酸總體水平不會增加或僅增加到不顯著的水平。這和利用脂酶(E.C.3.1.1.x)原位產(chǎn)生乳化劑的情況形成鮮明對比。具體地，脂酶的使用可使食品中游離脂肪酸大量增加，這一點是有害的。本發(fā)明中游離脂肪酸的蓄積量與使用脂酶(具體為磷脂酶A)代替本發(fā)明中的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶時游離脂肪酸的蓄積量相比，減少和/或消除。利用脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶將酰基轉(zhuǎn)移到固醇和/或甾烷醇，對含蛋類的食品特別有益。具體地，發(fā)現(xiàn)利用這里定義的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶處理的基于蛋類的食品與用常規(guī)的磷脂酶例如(NovozymesA/S，Denmark)，Lecitase(NovozymesA/S，Denmark)或來自Biocatalysts的Lipomod22L處理的基于蛋的食品相比，明顯具有更好的特性。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以用下列標準來表征(i)該酶具有轉(zhuǎn)移酰基的活性(可定義為酯轉(zhuǎn)移活性)，由此將脂質(zhì)?；w的原始酯鍵上的酰基部分轉(zhuǎn)移到酰基受體上形成新酯；和(ii)該酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是一種或多種下列氨基酸殘基L，A，V，I，F(xiàn)，Y，H，Q，T，N，M或S。優(yōu)選地，GDSX基序中的X是L，這樣，本發(fā)明所述的酶優(yōu)選包含氨基酸基序GSDL。GDSX基序是由四種保守氨基酸構(gòu)成。優(yōu)選地，所述基序中的絲氨酸是脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的催化性絲氨酸。適宜地，GDSX基序中的絲氨酸可以在與嗜水氣單胞菌脂解酶中與Ser-16相應(yīng)的位置，如Brumlik和Buckley(JournalofBacteriologyApr.1996，Vol.1，No.7，p2060-2064)的教導(dǎo)。為確定一種蛋白質(zhì)是否含有本發(fā)明所述GDSX基序，該序列優(yōu)選與Pfam數(shù)據(jù)庫中的隱藏markov模型圖譜(modelprofile)(HMM圖譜)進行比較。Pfam是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域家族的數(shù)據(jù)庫。Pfam包括為每個家族的輔助(curated)多重序列比對以及用于鑒定新序列中的這些結(jié)構(gòu)域的隱藏Markov模型圖譜(HMM圖譜)。對Pfam的介紹見于BatemanA等.(2002)NucleicAcidsRes.30；276-280。隱藏Markov模型被應(yīng)用于許多旨在對蛋白質(zhì)進行分類的數(shù)據(jù)庫中，綜述見BatemanA和HaftDH(2002)BriefBioinform3；236-245。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/querv.fcgi？cmd＝Retrieve&db＝PubMed&listuids＝12230032&dopt＝Abstracthttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？cmd＝Retrieve&db＝PubMed&listuids＝11752314&dopt＝Abstract對隱藏Markov模型的詳細解釋和這些模型如何在Pfam數(shù)據(jù)庫中應(yīng)用參見DurbinR，EddyS，和KroghA(1998)Biologicalsequenceanalysis；probabilisticmodelsofproteinsandnucleicacids.CambridgeUniversityPress，ISBN0-521-62041-4(DurbinR，EddyS，和KroghA(1998)生物序列分析，蛋白質(zhì)和核苷酸概率模型，劍橋大學(xué)出版，ISBN0-521-62041-4。Hammer程序包可以從華盛頓大學(xué)，StLouis，USA獲得?？蛇x擇地，GDSX基序可以通過應(yīng)用Hammer軟件包識別，說明由DurbinR，EddyS，和KroghA(1998)Biologicalsequenceanalysis；probabilisticmodelsofproteinsandnucleicacids.CambridgeUniversityPress，ISBN0-521-62041-4(DurbinR，EddyS，和KroghA(1998)生物序列分析，蛋白質(zhì)和核苷酸概率模型，劍橋大學(xué)出版，ISBN0-521-62041-4)及其中的參考文獻提供，以及本說明書中關(guān)于HMMER2的資料。PFAM數(shù)據(jù)庫可以通過，例如，目前位于如下網(wǎng)址的幾個服務(wù)器進行訪問http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtmlhttp://pfam.wustl.edu/http://pfam.jouy.inra.fr/http://pfam.cgb.ki.se/數(shù)據(jù)庫提供了檢索工具，在此可以輸入蛋白質(zhì)序列。應(yīng)用數(shù)據(jù)庫的默認參數(shù)，對蛋白質(zhì)序列中Pfam結(jié)構(gòu)域的存在進行分析。GDSX結(jié)構(gòu)域是在數(shù)據(jù)庫中已建立的區(qū)域，因此任何查詢序列中存在的該結(jié)構(gòu)域可以得到識別。數(shù)據(jù)庫將返回Pfam00657共有序列與查詢序列的比對。多重比對，包括殺鮭氣單胞菌或嗜水氣單胞菌可以通過下列方法獲得。a)手工方法通過上述程序，可獲得目的蛋白與Pfam00657共有序列的比對并獲得P10480序列與Pfam00657共有序列的比對；或b)通過數(shù)據(jù)庫在鑒定Pfam00657共有序列之后，數(shù)據(jù)庫提供選項顯示查詢序列與Pfam00657共有序列的種子比對(seedalignment)，P10480是該種子比對的一部分，且表示為GCAT_AERHY。查詢序列和P10480都將在同一窗口顯示。嗜水氣單胞菌參比序列嗜水氣單胞菌GDSX脂酶的殘基在NCBI文件P10480中進行編號，所述文本中的編號是指由該文件給出的編號，在本發(fā)明中它用來確定具體的氨基酸殘基，所述具體的氨基酸殘基在優(yōu)選具體實施方案中，存在于本發(fā)明的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶中。實施Pfam比對(圖33和34)下列保守的殘基可被識別，并且在優(yōu)選的實施方案中存在于本發(fā)明的組合物和方法所應(yīng)用的酶中。1區(qū)-GDSX區(qū)hidhidhidhidGlyAspSerhid28293031323334352區(qū)-GANDY區(qū)hidGlyhidAsnAsphid1301311321331341353區(qū)-HPT區(qū)His309其中′hid′是指選自Met，Ile，Leu，Val，Ala，Gly，Cys，His，Lys，Trp，Tyr或Phe的一個疏水殘基。優(yōu)選地，應(yīng)用于本發(fā)明的組合物/方法中的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶可用Pfam00657共有序列進行比對。優(yōu)選地，與pfam00657結(jié)構(gòu)域家族的隱藏markov模型圖譜(HMM圖譜)的陽性匹配表明本發(fā)明中的GDSL或GDSX結(jié)構(gòu)域的存在。優(yōu)選地，當與Pfam00657共有序列比對時，應(yīng)用于本發(fā)明的組合物/方法中的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶含有至少一個，優(yōu)選一個以上，優(yōu)選兩個以上下列區(qū)域，GDSx區(qū)、GANDY區(qū)、HPT區(qū)。適宜地，脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶含有GDSx區(qū)和GANDY區(qū)?？蛇x擇地，所述酶含有GDSx區(qū)和HPT區(qū)。優(yōu)選地，所述酶含有至少一個GDSx區(qū)。優(yōu)選地，當與Pfam00657共有序列比對時，應(yīng)用于本發(fā)明的組合物/方法中的酶與參比嗜水氣單胞菌多肽序列即SEQIDNo.32比較時含有至少一個，優(yōu)選一個以上，優(yōu)選兩個以上，優(yōu)選三個以上，優(yōu)選四個以上，優(yōu)選五個以上，優(yōu)選六個以上，優(yōu)選七個以上，優(yōu)選八個以上，優(yōu)選九個以上，優(yōu)選十個以上，優(yōu)選十一個以上，優(yōu)選十二以上，優(yōu)選十三以上，優(yōu)選十四個以上下列氨基酸殘基28hid，29hid，30hid，31hid，32gly，33Asp，34Ser，35hid，130hid，131Gly，132hid，133Asn，134Asp，135hid，309His。pfam00657GDSX結(jié)構(gòu)域是將具有該區(qū)域蛋白與其它酶區(qū)分的獨特標識。Pfam00657共有序列，表示為圖1的SEQIDNo.1。這是從第6版數(shù)據(jù)庫Pfam00657家族的鑒定衍生出來的，本文也稱其為pfam00657.6。共有序列可通過新版Pfam數(shù)據(jù)庫來更新。例如，圖33和34顯示第11版數(shù)據(jù)庫中00657家族的pfam比對，本文也稱其為pfam00657.11。發(fā)現(xiàn)兩個版本(release)的數(shù)據(jù)庫中Pfam00657家族中都存在GDSx區(qū)、GANDY區(qū)和HPT區(qū)。其它版本的pfam數(shù)據(jù)庫可用來鑒定pfam00657家族。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以用下列標準來表征(i)該酶具有轉(zhuǎn)移?；幕钚?可定義為酯基轉(zhuǎn)移活性)，由此將脂質(zhì)?；w的原始酯鍵上的?；糠洲D(zhuǎn)移到酰基受體上形成新酯；(ii)該酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是一種或多種下列氨基酸殘基L，A，V，I，F(xiàn)，Y，H，Q，T，N，M或S；(iii)該酶包含His-309或包含對應(yīng)于嗜水氣單胞菌脂解酶的His-309位的組氨酸殘基，所述嗜水氣單胞菌脂解酶如圖2所示(SEQIDNo.2或SEQIDNo.32)。優(yōu)選地，GDSX基序的氨基酸殘基是L。在SEQIDNo.2或SEQIDNo.32中，前18個氨基酸殘基形成信號序列。全長序列(包含信號序列的蛋白質(zhì))的His-309，等同于該蛋白質(zhì)成熟部分(即不含有信號序列的序列)中的His-291。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶包括下列催化三聯(lián)體Ser-34，Asp-134和His-309或者包含位置分別對應(yīng)于圖2(SEQIDNo.2)或圖28(SEQIDNo.32)所示的嗜水氣單胞菌脂解酶中Ser-34，Asp-134和His-309的絲氨酸殘基、天冬氨酸殘基和組氨酸殘基。如上所述，在SEQIDNo.2或SEQIDNo.32所示序列中，前18個氨基酸殘基形成信號序列。全長序列(包含信號序列的蛋白質(zhì))的Ser-34，Asp-134和His-309，等同于蛋白質(zhì)成熟部分(即不含有信號序列的序列)的Ser-16，Asp-116和His-291。在圖1(SEQIDNo.1)所示的Pfam00657共有序列中，活性位點殘基對應(yīng)于Ser-7，Asp-157和His-348。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以用下列標準來表征(i)該酶具有轉(zhuǎn)移?；幕钚?可定義為酯基轉(zhuǎn)移活性)，由此將第一脂質(zhì)酰基供體原始酯鍵上的?；糠洲D(zhuǎn)移到?；荏w形成新酯；并且(ii)該酶包含至少Gly-32，Asp-33，Ser-34，Asp-134和His-309或者包含位置分別對應(yīng)于圖2(SEQIDNo.2)或圖28(SEQIDNo.32)所示的嗜水氣單胞菌脂解酶中Gly-32，Asp-33，Ser-34，Asp-134和His-309的甘氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、天冬氨酸和組氨酸。適宜地，本發(fā)明所述的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以并優(yōu)選從下列來自一個或多個屬的生物體中獲得氣單胞菌屬(Aeromonas)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、酵母菌屬(Saccharomyces)、乳球菌屬(Lactococcus)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、鏈球菌屬屬(Streptococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、脫亞硫酸菌屬(Desulfitobacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、弧菌屬(Vibrionaceae)、木桿菌屬(Xylella)、硫葉菌屬(Sulfolobus)、曲霉屬(Aspergillus)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、李司忒氏菌屬(Listeria)、奈瑟氏球菌(Neisseria)、中慢生根瘤菌屬、雷爾氏菌屬(Ralstonia)、黃桿菌屬(Xanthomonas)和假絲酵母屬(Candida)。適宜地，本發(fā)明所述的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以并優(yōu)選從下列一種或多種生物體中獲得嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonicida)、天藍色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)、龜裂鏈霉菌(Streptomycesrimosus)、分枝桿菌(Mycobacterium)、化膿性鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)、瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)、脫鹵脫亞硫酸菌(Desulfitobacteriumdehalogenans)、芽孢桿菌(Bacillussp)、空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)、弧菌(Vibrionaceae)、苛養(yǎng)木桿菌(Xylellafastidiosa)、硫磺礦硫葉菌(Sulfolobussolfataricus)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、土曲霉(Aspergillusterreus)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、無害李司忒氏菌(Listeriainnocua)、單核細胞增多性李司忒氏菌(Listeriamonocytogenes)、腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)、Mesorhizobiumloti、青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)、野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris)、地毯草黃單胞菌(Xanthomonasaxonopodis)、近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis)。在一方面，優(yōu)選地，本發(fā)明中的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以并優(yōu)選從一種或多種嗜水氣單胞菌或殺鮭氣單胞菌中獲得。適宜地，本發(fā)明所述的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶包含一種或多種下列氨基酸序列。(i)SEQIDNo.2所示的氨基酸序列(見圖2)(ii)SEQIDNo.3所示的氨基酸序列(見圖3)(iii)SEQIDNo.4所示的氨基酸序列(見圖4)(iv)SEQIDNo.5所示的氨基酸序列(見圖5)(v)SEQIDNo.6所示的氨基酸序列(見圖6)(vi)SEQIDNo.12所示的氨基酸序列(見圖14)(vii)SEQIDNo.20所示的氨基酸序列(見圖16)(viii)SEQIDNo.22所示的氨基酸序列(見圖18)(ix)SEQIDNo.24所示的氨基酸序列(見圖20)(xi)SEQIDNo.26所示的氨基酸序列(見圖22)(xii)SEQIDNo.28所示的氨基酸序列(見圖24)(xiii)SEQIDNo.30所示的氨基酸序列(見圖26)(ixi)SEQIDNo.32所示的氨基酸序列(見圖28)(xiv)SEQIDNo.34所示的氨基酸序列(見圖30)或者與SEQIDNo.2，SEQIDNo.3，SEQIDNo.4，SEQIDNo.5，SEQIDNo.6，SEQIDNo.12，SEQIDNo.20，SEQIDNo.22，SEQIDNo.24，SEQIDNo.26，SEQIDNo.28，SEQIDNo.30，SEQIDNo.32，或SEQIDNo.34所示的任意一種序列有75％或者更高同一性的氨基酸序列。適宜地，本發(fā)明所述的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶或者包含SEQIDNo.2或SEQIDNo.3或SEQIDNo.32或SEQIDNo.34所示的氨基酸序列，或者包含與SEQIDNo.2或SEQIDNo.3或SEQIDNo.32或SEQIDNo.34所示的氨基酸序列有75％或75％以上，優(yōu)選80％或80％以上，優(yōu)選85％或85％以上，優(yōu)選90％或90％以上，優(yōu)選95％或95％以上同一性的氨基酸序列。為了達到本發(fā)明的目的，同一性的程度取決于相同序列元素的數(shù)目。依照本發(fā)明，同一性程度可通過本領(lǐng)域已知電腦程序適宜地測定，所述程序諸如GCG程序包提供的GAP(ProgramManualfortheWisconsinPackage，Version8，August1994，GeneticsComputerGroup，575ScienceDrive，Madison，Wisconsin，US53711)(Needleman&Wunsch(1970)，J.ofMolecularBiology48，443-45)，利用下列設(shè)置進行多肽序列比較GAP生成罰分3.0和GAP延伸罰分0.1。適宜地，本發(fā)明所述的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶包含一段氨基酸序列，該序列與SEQIDNo.2，SEQIDNo.3，SEQIDNo.4，SEQIDNo.5，SEQIDNo.6，SEQIDNo.12，SEQIDNo.20，SEQIDNo.22，SEQIDNo.24，SEQIDNo.26，SEQIDNo.28，SEQIDNo.30，SEQIDNo.32或SEQIDNo.34所示的任何一段序列具有80％或80％以上，優(yōu)選85％或85％以上，更優(yōu)選90％或90％以上，還更優(yōu)選95％或95％以上的同一性。適宜地，本發(fā)明所述的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶包含下列氨基酸序列中的一個或多個(a)如SEQIDNo.2或SEQIDNo.32的1-100氨基酸殘基所示的氨基酸序列；(b)如SEQIDNo.2或SEQIDNo.32的101-200氨基酸殘基所示的氨基酸序列；(c)如SEQIDNo.2或SEQIDNo.32的201-300氨基酸殘基所示的氨基酸序列；或(d)與上述(a)-(c)定義的任意氨基酸序列有75％或75％以上，優(yōu)選85％或85％以上，更優(yōu)選90％或90％以上，還更優(yōu)選95％或95％以上同一性的氨基酸序列。適宜地，本發(fā)明所述的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶包含下列氨基酸序列中的一個或多個(a)如SEQIDNo.2或SEQIDNo.32的氨基酸殘基28-39所示的氨基酸序列；(b)如SEQIDNo.2或SEQIDNo.32的氨基酸殘基77-88所示的氨基酸序列；(c)如SEQIDNo.2或SEQIDNo.32的氨基酸殘基126-136所示的氨基酸序列；(d)如SEQIDNo.2或SEQIDNo.32的氨基酸殘基163-175所示的氨基酸序列；(e)如SEQIDNo.2或SEQIDNo.32的氨基酸殘基304-311所示的氨基酸序列；或(f)與上述(a)-(e)定義的任意氨基酸序列有75％或75％以上，優(yōu)選85％或85％以上，更優(yōu)選90％或90％以上，還更優(yōu)選95％或95％以上同一性的氨基酸序列。適宜地，本發(fā)明所述的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶可以包含下列核苷酸序列中的一個或多個序列表達而產(chǎn)生的氨基酸序列。(a)如SEQIDNo.7所示的核苷酸序列(見圖9)；(b)如SEQIDNo.8所示的核苷酸序列(見圖10)；(c)如SEQIDNo.9所示的核苷酸序列(見圖11)；(d)如SEQIDNo.10所示的核苷酸序列(見圖12)；(e)如SEQIDNo.11所示的核苷酸序列(見圖13)；(f)如SEQIDNo.13所示的核苷酸序列(見圖15)；(g)如SEQIDNo.21所示的核苷酸序列(見圖17)；(h)如SEQIDNo.23所示的核苷酸序列(見圖19)；(i)如SEQIDNo.25所示的核苷酸序列(見圖21)；(j)如SEQIDNo.27所示的核苷酸序列(見圖23)；(k)如SEQIDNo.29所示的核苷酸序列(見圖25)；(l)如SEQIDNo.31所示的核苷酸序列(見圖27)；(m)如SEQIDNo.33所示的核苷酸序列(見圖29)；(n)如SEQIDNo.35所示的核苷酸序列(見圖31)；(o)或與SEQIDNo.7，SEQIDNo.8，SEQIDNo.9，SEQIDNo.10，SEQIDNo.11，SEQIDNo.13，SEQIDNo.21，SEQIDNo.23，SEQIDNo.25，SEQIDNo.27，SEQIDNo.29，SEQIDNo.31，SEQIDNo.33或SEQIDNo.35所示的任意一序列具有75％或75％以上同一性的核苷酸序列。適宜地，核苷酸序列可以與SEQIDNo.7，SEQIDNo.8，SEQIDNo.9，SEQIDNo.10，SEQIDNo.11，SEQIDNo.13，SEQIDNo.21，SEQIDNo.23，SEQIDNo.25，SEQIDNo.27，SEQIDNo.29，SEQIDNo.31，SEQIDNo.33或SEQIDNo.35所示的任意一序列具有80％或80％以上，優(yōu)選85％或85％以上，更優(yōu)選90％或90％以上，還更優(yōu)選95％或95％以上的同一性。一方面，本發(fā)明所述的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶可以為卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)或其變體(例如分子進化產(chǎn)生的變體)。本領(lǐng)域所知的適宜的LCAT可從下列一種或多種生物體中得到，例如哺乳動物、大鼠、小鼠、小雞、黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)、植物，包括擬南芥(Arabidopsis)和稻(Oryzasativa)、線蟲、真菌和酵母。在本發(fā)明所述的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的一個具體實施方案中，所述的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以并優(yōu)選從含有pPet12aAhydro和pPet12aASalmo的大腸桿菌菌株E.TOP10(E.colistrainsTOP10)中獲得，該菌株由丹麥哥本哈根K，DK-1001，Langebrogade1的丹尼斯科公司(DaniscoA/SofLangebrogade1，DK-1001CopenhagenK，Denmark)，根據(jù)布達佩斯條約關(guān)于用于專利程序的國際認可的微生物保藏(theBudapestTreatyontheInternationalRecognitionoftheDepositofMicroorganismsforthepurposeofPatentProcedure)在2003年12月22日保藏于英國蘇格蘭阿伯丁圣馬恰爾街23號國立工業(yè)和海洋微生物保藏有限公司(NCIMB)(theNationalCollectionofIndustrial，MarineandFoodBacteria(NCIMB)23St.MacharStreet，AberdeenScotland，GB)，保藏號分別為NCIMB41204和NCIMB41205。優(yōu)選地，當實施本發(fā)明的方法時，在不增加或基本不增加食品中的游離脂肪酸的情況下產(chǎn)生產(chǎn)品。這里使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)移酶”與術(shù)語“脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶”可以互換。適宜地，本發(fā)明定義的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶催化下列一種或多種反應(yīng)酯交換作用(interesterification)，酯基轉(zhuǎn)移作用(transesterification)，醇解作用，水解作用。術(shù)語“酯交換作用”指的是?；谥|(zhì)供體與脂質(zhì)受體之間的酶催化轉(zhuǎn)移，其中的脂質(zhì)供體不是游離的?；?。本文術(shù)語“酯基轉(zhuǎn)移作用”指的是?；鶑闹|(zhì)供體(除外游離脂肪酸)上經(jīng)酶催化轉(zhuǎn)移到酰基受體(除外水)。本發(fā)明使用的術(shù)語“醇解作用”指的是通過與醇ROH的反應(yīng)酸衍生物的共價鍵的酶裂解，使得一產(chǎn)物與醇的H結(jié)合而另一產(chǎn)物與醇的OR基團結(jié)合。本發(fā)明使用的術(shù)語“醇”指的是包含羥基的烷基化合物。本發(fā)明使用的術(shù)語“水解作用”指的是?；鶑闹|(zhì)到水分子OH基團的酶催化轉(zhuǎn)移作用。由水解作用引起的?；D(zhuǎn)移作用需要水分子的分離。這里使用的術(shù)語“不增加或基本不增加游離脂肪酸”指的是本發(fā)明的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶優(yōu)選具有100％轉(zhuǎn)移酶活性(即將100％的?；鶑孽；w轉(zhuǎn)移到酰基受體，無水解活性)；但是此酶可將不到100％的存在于脂質(zhì)?；w中的酰基轉(zhuǎn)移到?；荏w。在這種情況下，優(yōu)選的酰基轉(zhuǎn)移酶活性占總酶活性的至少5％，更優(yōu)選至少10％，更優(yōu)選至少20％，更優(yōu)選至少30％，更優(yōu)選至少40％，更優(yōu)選至少50％，更優(yōu)選至少60％，更優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％，并且更優(yōu)選至少98％。％轉(zhuǎn)移酶活性(即轉(zhuǎn)移酶活性占總酶活性的百分比)可通過下列方案測定測定轉(zhuǎn)移酶活性百分率的實驗設(shè)計酶促反應(yīng)后，可用CHCl3∶CH3OH2∶1提取已添加本發(fā)明的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的食品，分離包含脂質(zhì)物質(zhì)的有機相，并可根據(jù)在下文描述的詳細步驟通過GLC和HPLC分析。通過GLC和HPLC的分析，確定游離脂肪酸和一種或多種固醇/甾烷醇酯類；碳水化合物酯；蛋白質(zhì)酯；甘油二酯；或單甘油酯的量。不添加本發(fā)明的酶的對照食品用同種方法分析。計算從GLC和HPLC分析的結(jié)果可以計算出游離脂肪酸和/或固醇/甾烷醇酯類和/或碳水化合物酯和/或蛋白質(zhì)酯和/或甘油二酯和/或單甘油酯的增加量。Δ％脂肪酸＝％脂肪酸(酶)-％脂肪酸(對照)；Mv脂肪酸＝脂肪酸平均分子量A＝Δ％甾醇酯/Mv甾醇酯(其中Δ％甾醇酯＝％固醇/甾烷醇酯(酶)-％固醇/甾烷醇酯(對照)，Mv甾醇酯＝固醇/甾烷醇酯的平均分子量)，這適用于?；荏w是固醇和/或甾烷醇酯；B＝Δ％碳水化合物酯/Mv碳水化合物酯(其中Δ％碳水化合物酯＝％碳水化合物酯(酶)-％碳水化合物酯(對照)，Mv碳水化合物酯＝碳水化合物酯平均分子量)，這適用于酰基受體是碳水化合物。C＝Δ％蛋白質(zhì)酯/Mv蛋白質(zhì)酯(其中Δ％蛋白質(zhì)酯＝％蛋白質(zhì)酯(酶)-％蛋白質(zhì)酯(對照)，Mv蛋白質(zhì)酯＝蛋白質(zhì)酯平均分子量)，這適用于?；荏w是蛋白；和D＝甘油二酯和/或單甘油酯/Mv甘油二酯/單甘油酯的絕對值(其中Δ％甘油二酯和/或甘油單酯＝％甘油二酯和/或甘油單酯(酶)-％甘油二酯和/或甘油單酯(對照)，Mv甘油二酯/甘油單酯＝甘油二的酯和/或甘油單酯的平均分子量)，這適用于?；荏w是甘油。轉(zhuǎn)移酶活性以占總酶活性的百分率計算*指適當時刪除。如果食品中的游離脂肪酸增加，優(yōu)選它們基本不增加，即不達到顯著水平。我們的意思是游離脂肪酸的增加不會負面影響食品質(zhì)量。本發(fā)明的一些方面，使用的術(shù)語“基本不增加游離脂肪酸”意思是用本發(fā)明脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶處理過的食品或組合物中的游離脂肪酸量少于在已使用除本發(fā)明脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶以外的酶時食品或化合物中產(chǎn)生的游離脂肪酸量，例如與已使用常規(guī)的磷脂酶如(NovozymesA/S，丹麥)時產(chǎn)生的游離脂肪酸含量進行比較。本文術(shù)語“原位”意思是乳化劑和/或固醇/甾烷醇酯類和/或碳水化合物酯和/或蛋白質(zhì)酯和/或甘油單酯或甘油二酯在食品或食品級分中產(chǎn)生。這與以下情形相反乳化劑和/或固醇/甾烷醇酯類和/或碳水化合物酯和/或蛋白質(zhì)酯和/或甘油單酯或甘油二酯與食品分開制備，并作為形成的(formed)產(chǎn)物在等同制備過程中添加到食品中。換句話說，本發(fā)明使用的術(shù)語“原位”意思是通過將本發(fā)明的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶添加到食品中，或加到構(gòu)成所述食品的食物成分/材料中，乳化劑和/或固醇/甾烷醇酯類和/或碳水化合物酯和/或蛋白質(zhì)酯和/或甘油單酯或甘油二酯可從食品成分產(chǎn)生。食品中的成分可適宜為酶的底物。如有必要，食品中的成分可通過添加一種或多種與所述食品中的成分相同或與已存在于所述食品中的成分不同的成分而得到補充。為避免產(chǎn)生疑問，在一個實施方案中，本發(fā)明方法可以是一種在食品中原位產(chǎn)生乳化劑和/或甾醇酯和/或甾烷醇酯和/或碳水化合物酯和/或蛋白質(zhì)酯和/或甘油單酯或甘油二酯的方法，而不是制備用于隨后加到食品中的乳化劑和/或甾醇酯和/或甾烷醇酯(例如是分離和/或純化的形式)的方法。在另一具體實施方案中，脂酶酰基轉(zhuǎn)移酶可在食物加工中使用，但并不保留于食品中。例如，脂酶?；D(zhuǎn)移酶可以是固定化的，能夠被再使用。優(yōu)選地，本發(fā)明的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶能在極性環(huán)境，優(yōu)選水性環(huán)境，優(yōu)選含水食品中將?；鶑闹|(zhì)轉(zhuǎn)移到固醇和/或甾烷醇和/或碳水化合物和/或蛋白和/或甘油。適宜的水性環(huán)境可以是水的緩沖液或可以是食品的含水相。本文的術(shù)語“水性環(huán)境”優(yōu)選指這樣的環(huán)境，其不存在有機溶劑，優(yōu)選不存在極性有機溶劑，更為優(yōu)選為不存在不可食用有機溶劑。術(shù)語“水性環(huán)境”具體指不添加外源性有機溶劑，優(yōu)選不添加極性有機溶劑的環(huán)境。這里使用的術(shù)語有機溶劑不包括食物油，優(yōu)選不包括含大量非極性脂質(zhì)的食物油。在一個實施方案中術(shù)語有機溶劑應(yīng)除外可食用有機溶劑，如乙醇、丙二醇和/或甘油。本發(fā)明適宜的水性環(huán)境可包含體積百分比小于80％的有機溶劑，體積百分比小于70％的有機溶劑，體積百分比小于50％的有機溶劑，體積百分比小于30％的有機溶劑，優(yōu)選含體積百分比小于15％的有機溶劑，更優(yōu)選含體積百分比小于5％的有機溶劑。適宜的食品應(yīng)含1-5％的有機溶劑，如乙醇。但是，當食品中含有這樣的有機溶劑時，優(yōu)選在食品中內(nèi)源生成它。這就是說，當食品中含有這樣的有機溶劑時，優(yōu)選的有機溶劑并非外源性有機溶劑。此處應(yīng)用的術(shù)語“食品”是指適于人類和/或動物食用的物質(zhì)。適宜地，此處應(yīng)用的術(shù)語“食品”可以指某種形式便于食用的食品。然而，可選或者進一步，此處應(yīng)用的術(shù)語“食品”也可以指代一種或多種用于制備食品的食物材料。僅作為舉例，術(shù)語食品包括由面團制作的烘焙食品，也包括制備上述烘焙食品所用的面團。本發(fā)明優(yōu)選的方面提供了一種在前面定義過的食品，該食品選自以下的一種或多種食品蛋類、基于蛋的產(chǎn)品(包括但不僅限于蛋黃醬、色拉調(diào)料、沙司(sauce)、冰淇淋、蛋粉、改良蛋黃及由它們制備的產(chǎn)品)、烘焙食品(包括面包、蛋糕、甜面制品、層狀面點、液體面糊(batter)、松餅、油炸圈餅、餅干(biscuit)、發(fā)面餅干(cracker)和曲奇餅干)、糖食(confectionary)(包括巧克力、糖果(candy)、焦糖(caramel)、halawa、口香糖，包括無糖口香糖和含糖甜口香糖、泡泡糖、軟泡泡糖、口香糖和布丁)、冷凍食品(包括清涼果汁飲料(sorbet)、優(yōu)選的冰凍乳制品(dairy)(包括冰淇淋、冰牛奶))、乳制品(包括干酪、黃油、牛奶、咖啡稀奶油(coffeecream)、攪打起泡的稀奶油(whippedcream)、蛋奶羹(custardcream)、奶飲品和酸奶)、木斯(mousse)、經(jīng)攪打的蔬菜奶油泥(whippedvegetablecream)、肉制品(包括加工的肉制品(processedmeatproducts))、食用油和脂肪、充氣的和真空的經(jīng)攪打食品、水包油乳劑、油包水乳劑、人造黃油、起酥油(shortening)和涂抹物(spread)包括低脂和極低脂涂抹物；調(diào)料(dressings)、蛋黃醬、調(diào)味液(dip)、奶油質(zhì)醬(creambasedsauce)、奶油質(zhì)湯(creambasedsoup)、軟飲料、調(diào)味乳和調(diào)味醬。本發(fā)明合適的食品可以是一種“精制食品(finefoods)”，包括蛋糕、發(fā)面點心(pastry)、糖食、巧克力、法奇糖(fudge)等。本發(fā)明的食品的一方面可以是面團制品(doughproduct)或烘烤產(chǎn)品(bakedproduct)，例如面包，油炸制品(friedproduct)，小吃(snack)，蛋糕(cake)，餡餅(pie)，胡桃巧克力小方餅(brownie)，曲奇(cookie)，面條(noodle)，休閑零食品(snackitems)諸如發(fā)面餅干(cracker)，全麥餅干(grahamcracker)，椒鹽卷餅(pretzel)，薯片(potatochips)等，面食制品(pasta)。另一方面，本發(fā)明的食品可以是源自植物的食品制品，例如面粉、預(yù)混合物(pre-mix)、油、脂肪、可可脂、調(diào)咖啡用白油(coffeewhitener)、色拉調(diào)料、人造黃油、涂抹物、花生醬、起酥油、冰激淋、烹飪用油。另一方面，本發(fā)明所述食品可以是一種乳制品，包括黃油、奶、奶油、干酪-如天然的、經(jīng)加工的和人工仿制的干酪，它可以呈現(xiàn)多種形式(包括碎片狀(shredded)、塊狀(blocked)、薄片狀(sliced)、或搓碎狀(grated))、奶油干酪、冰激淋、冷凍的甜點、酸奶、酸奶飲品、乳脂肪(butterfat)、脫水奶脂肪、其它乳制品。本發(fā)明所述的酶能夠提高乳制品中脂肪的穩(wěn)定性。當干酪中的游離脂肪酸的生成與“肥皂”口味有關(guān)時，利用本發(fā)明制備干酪是特別有利的。因此，應(yīng)用本發(fā)明的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶有利于制備出沒有“肥皂”口味的干酪。另一方面，本發(fā)明所述食品可以是一種含有動物來源的成分的食品，例如加工過的肉制品、烹飪用油、起酥油。另一方面，本發(fā)明的食品可以是軟飲料、水果、水果混合物、蔬菜或葡萄酒。在一些情況下，所述軟飲料中可以含有最高達到20g/l的添加的植物甾醇。另一方面，本發(fā)明的食品可以是一種動物飼料。該動物飼料可以富含植物甾醇類和/或phytostanols，優(yōu)選β-谷甾醇/甾烷醇。適宜地，該動物飼料可以是一種家禽飼料。當所述食品是家禽飼料時，本發(fā)明就可以用于降低喂飼了本發(fā)明飼料的家禽所產(chǎn)的蛋中的膽固醇含量。優(yōu)選地，所述食品選自以下食品中的一種或多種蛋類、基于蛋的產(chǎn)品-包括蛋黃醬、色拉調(diào)料、沙司、冰激淋、蛋粉、改良蛋黃及其制品。優(yōu)選，本發(fā)明的食品是含水食品。適宜的該食品可以含水10-98％、適宜地14-98％、適宜地18-98％、適宜地20-98％、適宜地40-98％、適宜地50-98％、適宜地70-98％、適宜地75-98％。在一些方面，本發(fā)明優(yōu)選的食品不是一種純植物油，諸如橄欖油、葵花籽油、花生油、油菜籽油。為了避免產(chǎn)生疑問，在本發(fā)明一些方面中本發(fā)明食品可以含油，但是優(yōu)選地，食品不主要地由油或油的混合物構(gòu)成。對于本發(fā)明一些方面，優(yōu)選該食品包含低于95％，優(yōu)選低于90％、優(yōu)選低于85％、優(yōu)選低于80％的脂質(zhì)。因此，對于本發(fā)明一些方面，油可以是食品的組成成分，但優(yōu)選所述食品本身不是油。本發(fā)明的權(quán)利要求應(yīng)包括上面列出的每一類食品。當根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生碳水化合物酯時，優(yōu)選所述碳水化合物酯是寡糖酯、單糖酯或二糖酯。適宜地，當根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生碳水化合物酯時，碳水化合物酯可以是以下的一種或多種葡萄糖酯、果糖酯、脫水果糖酯、麥芽糖酯、乳糖酯、半乳糖酯、木糖酯、木寡糖酯(xylooligosaccharideester)、阿拉伯糖酯(arabinoseester)、麥寡糖酯(maltooligosaccharideester)、塔格糖酯(tagatoseester)、蔗糖酯、microthecin酯、ascopyroneP酯、ascopyroneT酯、或cortalcerone酯。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選產(chǎn)生的碳水化合物酯是以下一種或者多種碳水化合物單酯(carbohydratemono-ester)、糖單酯(sugarmono-ester)、寡糖單酯、三糖單酯、二糖單酯、單糖單酯、葡萄糖單酯、果糖單酯、脫水果糖單酯、麥芽糖單酯、乳糖單酯、半乳糖單酯、木糖單酯、木寡糖單酯、阿拉伯糖單酯、麥寡糖單酯、塔格糖單酯、蔗糖單酯、microthecin酯、ascopyroneP酯、ascopyroneT酯、或cortalcerone酯。在一個具體實施方案中，microthecin酯、ascopyroneP酯、ascopyroneT酯、和/或cortalcerone酯可以作為抗微生物劑起作用?？蛇x地或者進一步地，microthecin酯、ascopyroneP酯、ascopyroneT酯、和/或cortalcerone酯可以作為抗氧化劑和/或乳化劑的一個或兩個來起作用。優(yōu)選地，本發(fā)明碳水化合物酯的形成(如果有的話)不依賴于UDP-葡萄糖。優(yōu)選地，本發(fā)明的食品不包含UDP-葡萄糖或僅僅包含不顯著量的UDP-葡萄糖。適宜地，本發(fā)明乳化劑可以例如是以下一種或多種甘油二酯、甘油單酯諸如1-甘油單酯或溶血卵磷脂如溶血磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholine)，如二半乳糖基甘油單酯(DGMG)。所述乳化劑優(yōu)選在從脂質(zhì)?；w去除(remove)一或多個?；髲乃鲋|(zhì)?；w產(chǎn)生。本文應(yīng)用的術(shù)語溶血卵磷脂包含溶血磷脂酰膽堿，溶血磷脂酰乙醇胺(lysophosphatidylethanolamine)、溶血磷脂酰肌醇(lysophosphatidylinositol)、溶血磷脂酰絲氨酸(lysophosphatidylserine)和溶血磷脂酰甘油(lysophosphatidylglycerol)。當乳化劑的一種是碳水化合物酯，那第二種乳化劑可以是以下舉例的乳化劑中的一種或多種甘油二酯、甘油單酯諸如1-甘油單酯、溶血磷脂酰膽堿、或二半乳糖基甘油單酯(DGMG)。第二乳化劑優(yōu)選在從脂質(zhì)?；w去除一或多個?；髲乃鲋|(zhì)?；w產(chǎn)生。本文應(yīng)用的術(shù)語溶血磷脂酰膽堿與術(shù)語溶血卵磷脂同義，而且在本申請中二者可以互相替代。優(yōu)選的第二乳化劑是DGMG。適宜地，DGMG是通過從DGDG去除?；簧傻?，且該去除的酰基轉(zhuǎn)移至碳水化合物上形成碳水化合物酯。當乳化劑的一種是蛋白質(zhì)酯和/或甘油二酯和/或甘油單酯，那第二種乳化劑可以是例如以下乳化劑中的一種或多種甘油二酯、甘油單酯諸如1-甘油單酯、溶血磷脂酰膽堿或二半乳糖基甘油單酯(DGMG)。第二乳化劑優(yōu)選在從脂質(zhì)?；w去除一或多個酰基后從所述脂質(zhì)?；w產(chǎn)生。本文應(yīng)用的術(shù)語溶血磷脂酰膽堿與溶血卵磷脂同義，而且在本申請中二者可以互相替代。在一個具體實施方案中，本發(fā)明所述的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶可以應(yīng)用于食品諸如烹飪用油、人造黃油或涂抹物的制備方法中，所述食品天然包含或已經(jīng)添加了甘油、至少一種磷脂(例如卵磷脂)和/或糖脂(例如雙半乳糖甘油二酯)，以及可選的植物甾醇或phytostanol。當用作烹飪用油或人造黃油時，該食品可以有增強的抗粘鍋(antiplattering)性質(zhì)。進一步或者可選擇的，該食品可以有一種或多種有益的技術(shù)性質(zhì)，例如增強的氧化安定性(oxidativestability)，改善的乳化性能，或健康益處。在一個具體實施方案中，本發(fā)明的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以用于制備低脂食品，例如低脂涂抹物、低脂色拉調(diào)料、低脂蛋黃醬、低脂人造黃油等。與脂肪較高的等價物相比，通過添加乳化劑和額外的水通常降低了這些低脂食品中的脂肪含量。已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明組合物和方法中應(yīng)用的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶與脂解酶相比具有獨特的性質(zhì)，它們明顯優(yōu)先地將?；鶑闹|(zhì)轉(zhuǎn)移到水以外的受體上，即使在有大量水存在的條件下也是如此。與現(xiàn)有技術(shù)中的酶相比發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明中應(yīng)用的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶在存在6％、54％、73％、89％和大約95％的水的條件下具有高的相對轉(zhuǎn)移酶活性(relativetransferaseactivity)。被試脂解酶在這些水濃度條件下事實上不具有明顯的相對轉(zhuǎn)移酶活性。酶的脂酶活性和?；D(zhuǎn)移酶活性可以使用以下測定方法來評估。通過此方法可以獲得/鑒定具有本文定義的酶特性的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶。經(jīng)緩沖的底物中的轉(zhuǎn)移酶測定法(參見實施例12)起脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶作用以用于本發(fā)明組合物和方法中的酶可以用實施例12中教導(dǎo)的測定法常規(guī)鑒定出來。此測定方法將在下文稱為“經(jīng)緩沖的底物中的轉(zhuǎn)移酶測定法”。在實施例12中對本發(fā)明源于殺鮭氣單胞菌的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶進行分析并與本發(fā)明未涉及的一定范圍的脂解酶進行比較?？梢钥闯鲋饷钢兄挥蠪(Novozymes，丹麥)具有轉(zhuǎn)移酶活性，因此僅具有較低的水平(1.3％)。適于本發(fā)明的組合物和方法中應(yīng)用的酶可以利用在經(jīng)緩沖的底物中的轉(zhuǎn)移酶測定法來常規(guī)確定。應(yīng)用這種測定方法(其中含水量非常高-大約95％)，本發(fā)明應(yīng)用的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶是至少有2％?；D(zhuǎn)移酶活性(相對轉(zhuǎn)移酶活性)，優(yōu)選至少5％相對轉(zhuǎn)移酶活性，優(yōu)選至少10％相對轉(zhuǎn)移酶活性，優(yōu)選至少15％、20％、25％、26％、28％、30％、40％、50％、60％或75％相對轉(zhuǎn)移酶活性的酶。本發(fā)明適宜的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以具有小于28％、小于30％、優(yōu)選小于40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的?；D(zhuǎn)移酶活性。高水分蛋黃中的轉(zhuǎn)移酶測定法(參見實施例11)作為“經(jīng)緩沖底物中的轉(zhuǎn)移酶測定法”(參見上面所述)的替換(或附加)，本發(fā)明所用脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以用實施例11教導(dǎo)的“高水分蛋黃中的轉(zhuǎn)移酶測定法”來鑒定。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明方法和/或組合物適用的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶是這樣的一種酶，當使用高水分蛋黃中的轉(zhuǎn)移酶測定法在含水量54％的蛋黃中進行檢測時，所述酶具有最高100％的相對轉(zhuǎn)移酶活性。事實上，在高水分蛋黃中進行的實驗顯示，在實驗的開始，初始的轉(zhuǎn)移酶速率經(jīng)計算為100％轉(zhuǎn)移酶活性，即沒有觀察到水解活性。相反的，作為對照的脂解酶即F和磷脂酶A2在含水54％的蛋黃或富含水分的蛋黃(即含水73％或89％的蛋黃)中沒有顯示出可檢測的轉(zhuǎn)移酶活性。優(yōu)選地，含水量的增加并沒有顯著降低本發(fā)明方法或組合物中所用脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的百分比?；D(zhuǎn)移酶活性。在一個優(yōu)選的具體實施方案中，使用高水分蛋黃中的轉(zhuǎn)移酶測定法在含水量54％的蛋黃中進行檢測時，在供體分子(即磷脂)消耗10％后，本發(fā)明所用脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶具有的初始百分比轉(zhuǎn)移酶活性(初始相對轉(zhuǎn)移酶活性)為至少0.1％相對轉(zhuǎn)移酶活性，優(yōu)選至少1％相對轉(zhuǎn)移酶活性，優(yōu)選至少5％相對轉(zhuǎn)移酶活性，優(yōu)選至少10％相對轉(zhuǎn)移酶活性，優(yōu)選至少20％相對轉(zhuǎn)移酶活性，優(yōu)選至少30％相對轉(zhuǎn)移酶活性，優(yōu)選至少40％相對轉(zhuǎn)移酶活性，優(yōu)選至少50％相對轉(zhuǎn)移酶活性，優(yōu)選至少60％，優(yōu)選至少70％，優(yōu)選至少80％，優(yōu)選至少90％，優(yōu)選至少95％，優(yōu)選至少99％，優(yōu)選大約100％?；D(zhuǎn)移酶活性。在一個優(yōu)選的實施方案中，使用高水分蛋黃中的轉(zhuǎn)移酶測定法在含水量54％的蛋黃中進行檢測時，在供體分子(即磷脂)消耗10％后，本發(fā)明組合物和方法中所用的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶具有可測的轉(zhuǎn)移酶活性，即0.1到100％之間的相對轉(zhuǎn)移酶活性，優(yōu)選至少1％的相對轉(zhuǎn)移酶活性，優(yōu)選至少5％的相對轉(zhuǎn)移酶活性，優(yōu)選至少10％的相對轉(zhuǎn)移酶活性，優(yōu)選至少20％的相對轉(zhuǎn)移酶活性，優(yōu)選至少30％的相對轉(zhuǎn)移酶活性，優(yōu)選至少40％的相對轉(zhuǎn)移酶活性，優(yōu)選至少45％、50％、60％、70％、80％或90％的相對轉(zhuǎn)移酶活性。適宜地，在使用高水分蛋黃中的轉(zhuǎn)移酶測定法在含水量54％的蛋黃中進行檢測時，在供體分子(即磷脂)消耗10％后，本發(fā)明脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以具有少于45％、47％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的百分比?；D(zhuǎn)移酶活性(相對轉(zhuǎn)移酶活性)。在一個優(yōu)選的實施方案中，使用高水分蛋黃中的轉(zhuǎn)移酶測定法在含水量73％的蛋黃中進行檢測時，在供體分子(即磷脂)消耗10％后，本發(fā)明組合物和方法中所用的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶具有可測的轉(zhuǎn)移酶活性，即0.1到100％之間的相對轉(zhuǎn)移酶活性，優(yōu)選至少1％的相對轉(zhuǎn)移酶活性，優(yōu)選至少5％的相對轉(zhuǎn)移酶活性，優(yōu)選至少10％的相對轉(zhuǎn)移酶活性，優(yōu)選至少20％的相對轉(zhuǎn)移酶活性，優(yōu)選至少30％的相對轉(zhuǎn)移酶活性，優(yōu)選至少40％的相對轉(zhuǎn)移酶活性，優(yōu)選至少45％、50％、58％、60％、70％、80％或90％的相對轉(zhuǎn)移酶活性。適宜地，在使用高水分蛋黃中的轉(zhuǎn)移酶測定法在含水量73％的蛋黃中進行檢測時，在供體分子(即磷脂)消耗10％后，本發(fā)明脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以具有少于45％、47％、50％、58％、60％、70％、80％、90％或100％的百分比酰基轉(zhuǎn)移酶活性(相對轉(zhuǎn)移酶活性)。在優(yōu)選的具體實施方案中，使用高水分蛋黃中的轉(zhuǎn)移酶測定法在含水量89％的蛋黃中進行檢測時，在供體分子(即磷脂)消耗10％后，本發(fā)明組合物和方法中所用的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶具有可測的轉(zhuǎn)移酶活性，即在0.1與100％之間的相對轉(zhuǎn)移酶活性，優(yōu)選至少1％的相對轉(zhuǎn)移酶活性，優(yōu)選至少5％的相對轉(zhuǎn)移酶活性，優(yōu)選至少10％的相對轉(zhuǎn)移酶活性，優(yōu)選至少20％的相對轉(zhuǎn)移酶活性，優(yōu)選至少30％的相對轉(zhuǎn)移酶活性，優(yōu)選至少40％的相對轉(zhuǎn)移酶活性，優(yōu)選至少45％、50％、60％、70％、80％或90％的相對轉(zhuǎn)移酶活性。適宜地，在使用高水分蛋黃中的轉(zhuǎn)移酶測定法在含水量73％的蛋黃中進行檢測時，在供體分子(即磷脂)消耗10％后，本發(fā)明脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以具有少于45％、47％、50％、60％、70％、80％、90％或100％百分比?；D(zhuǎn)移酶活性(相對轉(zhuǎn)移酶活性)。在優(yōu)選的具體實施方案中，根據(jù)高水分蛋黃中的轉(zhuǎn)移酶測定法，本發(fā)明組合物中和方法中應(yīng)用的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶具有顯著的相對轉(zhuǎn)移酶活性(即在兩種水含量都至少0.1％)，在含水量54％和含水量73％的蛋黃中具有相當?shù)南鄬D(zhuǎn)移酶活性，測定是供體分子(即磷脂)消耗10％后進行。在優(yōu)選的具體實施方案中，根據(jù)高水分蛋黃中的轉(zhuǎn)移酶測定法，本發(fā)明組合物中和方法中應(yīng)用的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶具有顯著的相對轉(zhuǎn)移酶活性(即在兩種水含量都至少0.1％)，在含水量54％和含水量89％的蛋黃中具有相當?shù)南鄬D(zhuǎn)移酶活性，測定是供體分子(即磷脂)消耗10％后進行。在優(yōu)選的具體實施方案中，根據(jù)高水分蛋黃中的轉(zhuǎn)移酶測定法，本發(fā)明組合物中和方法中應(yīng)用的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶具有顯著的相對轉(zhuǎn)移酶活性(即在兩種水含量都至少0.1％)，在含水量73％和含水量89％的蛋黃中具有相當?shù)南鄬D(zhuǎn)移酶活性，測定是供體分子(即磷脂)消耗10％后進行。本文應(yīng)用的術(shù)語“相當?shù)南鄬D(zhuǎn)移酶活性”表示酶具有的相對轉(zhuǎn)移酶活性(％?；D(zhuǎn)移酶活性)在水含量較高的蛋黃中比在水含量較低的蛋黃中，至少低2％，優(yōu)選地至少低5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。低水分環(huán)境中的轉(zhuǎn)移酶測定法作為“高水分蛋黃中的轉(zhuǎn)移酶測定法”和/或“經(jīng)緩沖的底物中的轉(zhuǎn)移酶測定法”的替代或附加，本發(fā)明中使用的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以通過“低水分環(huán)境中的轉(zhuǎn)移酶測定法”來鑒定。為了判定一種酶是否是屬于根據(jù)本發(fā)明的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶，可進行“低水分環(huán)境中的轉(zhuǎn)移酶測定法”，即如實施例22教導(dǎo)在含水6％的油性環(huán)境中。這個例子說明在水含量6％的油性環(huán)境中本發(fā)明的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶具有高的相對轉(zhuǎn)移酶活性，而現(xiàn)有技術(shù)的脂解酶具有水解活性。在一具體實施方案中，本發(fā)明組合物和/或方法中應(yīng)用的適宜脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶是用“低水分環(huán)境中的轉(zhuǎn)移酶測定法”試驗的酶，在30、20或120分鐘后進行測定時，其相對轉(zhuǎn)移酶活性至少1％，優(yōu)選至少2％，優(yōu)選至少5％，優(yōu)選至少10％，優(yōu)選至少20％，優(yōu)選至少30％，優(yōu)選至少40％，優(yōu)選至少50％，優(yōu)選至少60％，優(yōu)選至少70％，優(yōu)選至少75％。適宜地，用“低水分環(huán)境中的轉(zhuǎn)移酶測定法”在10、20、30或120分鐘后進行測定時，本發(fā)明脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶，可有少于30％、40％、50％、60％、70％或80％的活性。如上所述，本發(fā)明中的脂酶?；D(zhuǎn)移酶可以用“經(jīng)緩沖的底物中的轉(zhuǎn)移酶測定法”或“低水分環(huán)境中的轉(zhuǎn)移酶測定法”以膽固醇為?；荏w進行鑒定。當然，本領(lǐng)域技術(shù)人員會容易意識到，通過對分析性方法進行顯著修改，“經(jīng)緩沖的底物中的轉(zhuǎn)移酶測定法”或“低水分環(huán)境中的轉(zhuǎn)移酶測定法”可用于確定脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶對任何脂質(zhì)?；w或任何?；荏w組合的活性。如有必要，技術(shù)人員可簡單地用可選?；w底物(如糖脂，甘油三酯)替換?；w底物(如磷脂)和/或用可選?；荏w底物(如碳水化合物，蛋白質(zhì)，其它固醇，甾烷醇或甘油)替換?；荏w底物(如膽固醇)。本文使用的術(shù)語“高水分”意味著任何底物或食品，其水含量大于2％，優(yōu)選大于3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。本文使用的術(shù)語“低水分”意味著任何底物或食品，其水含量小于6％，優(yōu)選小于5％、4％、3％、2％、1％或0.5％。優(yōu)選地，可以在以下溫度在食品中實施本發(fā)明的方法和/或用途，例如，15-60℃，優(yōu)選20-60℃，優(yōu)選20-50℃，優(yōu)選20-45℃，優(yōu)選20-40℃。在一些方面，例如在面團中，優(yōu)選發(fā)生?；D(zhuǎn)移酶反應(yīng)時食物的溫度在20至40℃之間。對于其它方面，例如對于乳制品諸如干酪，食物的適宜溫度可以為在30至60℃之間。在其它方面，例如對于蛋黃醬，食物的適宜溫度可以為在20至40℃之間。更為優(yōu)選的應(yīng)在25至30℃之間。優(yōu)選地，依照本發(fā)明產(chǎn)生的乳化劑占食品重量的5wt％或5wt％以下。優(yōu)選地，依照本發(fā)明產(chǎn)生的乳化劑占食品重量的0.01到4wt％。優(yōu)選地，依照本發(fā)明產(chǎn)生的乳化劑占食品重量的0.01到2wt％。優(yōu)選地，依照本發(fā)明產(chǎn)生的乳化劑占食品重量的0.01到1wt％。優(yōu)選地，依照本發(fā)明產(chǎn)生的乳化劑占食品重量的0.01到0.5wt％。優(yōu)選地，依照本發(fā)明產(chǎn)生的乳化劑占食品重量的0.01到0.3wt％。依照本發(fā)明適宜的方法包括使酶失活或變性，使得食品中包含失活或變性形式的酶。適宜地，所述酶可以用烘烤或用巴氏滅菌法而得以變性。本發(fā)明可進一步包括本文定義的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶在食品和/或飼料酶組合物中的用途，而且可包括其中含有本文定義的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的食品和/或飼料酶組合物。這樣的組合物可以包含一種或多種另外的酶，例如本發(fā)明所列舉的?；蛘?，本發(fā)明的酶組合物可與本文所述其它食品成分/食品添加劑(包括其它酶組合物)聯(lián)用。通過將本發(fā)明的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶配制在食品和/或飼料組合物中，所述酶可在用于食品和/或飼料生產(chǎn)之前得以穩(wěn)定化，以便長期保存(在適宜條件下)。另外，本發(fā)明的酶組合物提供了適宜形式的酶，其可安全地在食品和/或飼料或者用于食品和/或飼料制品的組分的制備過程“原位”應(yīng)用。這些組合物可以以流體，半流體或固體/顆粒形式存在。在一具體實施方案中，適宜的食品酶組合物可為面團改良組合物(doughimprovingcomposition)。面團改良組合物可包括其它有益成分如乳化劑和/或本發(fā)明列舉的其它酶。食品酶以穩(wěn)定液態(tài)濃縮劑或固體顆粒形式出售。制成食品酶組合物使得在運輸、儲藏、使用過程中的酶活性損失量降到最低。在食品和飲料生產(chǎn)過程中酶常常處于濕、熱或氧化環(huán)境中。制劑通過對抗主要滅活作用力變性、催化部位失活和蛋白質(zhì)水解，來增強穩(wěn)定性。當一種酶的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)在熱或化學(xué)應(yīng)力作用下物理性去折疊，酶就發(fā)生了變性。酶一旦開始去折疊就極易失活并發(fā)生蛋白質(zhì)水解。為了最小化去折疊，配制者可以改變蛋白的環(huán)境來誘導(dǎo)緊密的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；最有效的方法是通過添加締合水的化合物如糖、多羥基醇和易溶性鹽從蛋白表面“優(yōu)先除去”水。防止活性位點失活的最佳方法是確保任何必需輔助因子的水平充足，添加可逆抑制劑，并且從制劑中除去氧化性或具有反應(yīng)活性種類。除了酶穩(wěn)定性之外，制劑還要求滿足幾個關(guān)鍵的次要需求，包括防止微生物污染的保藏，避免物理性沉淀或云霧狀混濁(haze)形成，使致敏塵?；驓馊苣z的形成降到最低，和達到最佳的美感性標準如色澤和氣味。這些問題許多通過盡可能關(guān)注“上游”而得以很好地解決，包括在發(fā)酵或酶回收過程中原材料的選擇。下游操作如滲濾、吸附、層析、結(jié)晶和提取可以用來除去與色澤、氣味和沉淀有關(guān)的雜質(zhì)。物理沉淀的風(fēng)險可通過在接近酶等電點利用親水的溶劑諸如甘油或丙二醇進行配制而降到最低。技術(shù)人員也可有效添加水平適中的助溶鹽，來避免鹽析或避免“反向鹽助溶(reversesalting-in)”。為防止微生物污染，可聯(lián)合使用過濾、酸化，以及使游離水減到最小限度；殺生物劑可有效，但用于控制或殺滅微生物的可接受化學(xué)物質(zhì)的范圍越來越受到健康與安全規(guī)范的限制。迄今為止，兩種產(chǎn)生耐磨性最強的顆粒的方法是高剪切力制粒法和流床噴霧包衣法，例如見T.Becker″SeparationandPurificationProcessesforRecoveryofIndustrialEnzymes″(“工業(yè)酶回收的分離純化過程”)inR.K.Singh，S.S.H.Rizvi(eds.)BioseparationProcessesinFoods(食品的生物分離過程)，MarcelDekker，NewYork，pp.427-445。這些方法使用各種粘合劑，包衣劑，顆粒形態(tài)學(xué)來產(chǎn)生不易碎的顆粒，這種顆粒還在儲藏過程中對酶起到保護作用，但允許它們在使用過程中容易地釋放到溶液中?？梢杂脴藴驶呐渲萍夹g(shù)如噴霧干燥或液體配制來制備包含本發(fā)明所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的食物酶組合物。本發(fā)明所述脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶可在任何適宜的表達宿主表達。例如本發(fā)明所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可在枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)表達，并且可以通過超濾法和/或乙醇沉淀法和/或離心法純化，接著可以使用淀粉(麥芽糊精)作為酶的載體進行噴霧干燥。經(jīng)噴霧干燥后的酶通過添加另外的粉末形式載體而標準化為規(guī)定的PLU活性。有關(guān)技術(shù)在本領(lǐng)域中是很明確且常規(guī)的?；蛘?，本發(fā)明使用的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶，例如，本發(fā)明外源性產(chǎn)生的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶，一旦經(jīng)純化，可穩(wěn)定于適宜的液體制劑中，如基于甘油的那些。其它制備穩(wěn)定化酶制劑的方法在EP0770037和EP0702712中有所描述。粉末狀的?；D(zhuǎn)移酶也可以與本文列出的其它酶聯(lián)用，來制備具有產(chǎn)品說明書所限定的活性的酶組合物。通常食物酶制劑的劑量是每1000千克食品10克到1000克，優(yōu)選每1000千克食品50克到200克，優(yōu)選每1000千克食品75克到125克。本發(fā)明優(yōu)選的酶以失活或變性的形式存在于食品中。在一具體實施方案中，本發(fā)明的酶優(yōu)選非固定化的，具體為不固定于固體載體上。在一可選擇的具體實施方案中，所述酶可以是固定化的。固定化的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以使用本領(lǐng)域熟知的固定化技術(shù)制備。本領(lǐng)域有大量的對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言清楚明白的制備固定化的酶的方法(例如以下文獻中所述的技術(shù)EP0746608；或BalcaoVM，PaivaAL，MalcataFX.，EnzymeMicrobTechnol.1996May1；18(6)392-416；或ReetzMT，JaegerKE.ChemPhysLipids.1998Jun；93(1-2)3-14；或BornscheuerUT，BesslerC，SrinivasR，KrishnaSH.TrendsBiotechnol.2002Oct；20(10)433-7(將每篇都包含在本文中作為參照)。在一具體實施方案中，本發(fā)明的食品可以包含使用固定化脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶制備的食品成分，但不包含食品成分或食品中的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶。例如所述食品可包含一種或多種下列物質(zhì)乳化劑、一種以上的乳化劑、一種或多種調(diào)味劑、一種或多種結(jié)構(gòu)強化劑和/或一種或多種甾醇酯，如植物甾醇酯或phytostanol酯。本發(fā)明的酶可以與一種或多種常規(guī)乳化劑共同使用，所述乳化劑包括例如甘油單酯、二醋酸基酒石酸的脂肪酸單甘油酯和二甘油酯，和卵磷脂，例如其得自大豆。本發(fā)明的酶可以和一種或多種其它適宜的食品級酶共同使用。這樣，在本發(fā)明涉及范圍內(nèi)，除本發(fā)明的酶外，至少還有一種其它酶添加到食品中。這些其它酶包括淀粉降解酶如內(nèi)淀粉酶(endoamylase)或外淀粉酶(exoamylase)、支鏈淀粉酶(pullulanase)、脫支酶(debranchingenzyme)、半纖維素酶(hemicellulase)-包括木聚糖酶(xylanase)，纖維素酶(cellulose)，脂酶，磷脂酶和蛋白酶。本發(fā)明的酶可以和一種或多種其它適宜的食品級酶共同使用。這樣，在本發(fā)明涉及范圍內(nèi)，除本發(fā)明的酶外，至少還有一種其它酶添加到食品中。這些其它酶包括淀粉降解酶如內(nèi)淀粉酶或外淀粉酶、支鏈淀粉酶、脫支酶、半纖維素酶-包括木聚糖酶、纖維素酶、氧化還原酶-如葡萄糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、巰基氧化酶(sulfyhydryloxidase)或碳水化合物氧化酶-如氧化麥芽糖的氧化酶例如己糖氧化酶(HOX)、脂酶、磷脂酶和己糖氧化酶和蛋白酶。在一優(yōu)選的具體實施方案中，脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶與具有下列一種或多種脂酶活性的脂酶聯(lián)合使用糖脂酶活性(E.C.3.1.1.26)、三酰甘油脂酶活性(E.C.3.1.1.3)、磷脂酶A2活性(E.C.3.1.1.4)或磷脂酶A1活性(E.C.3.1.1.32)。適宜地，脂酶在本領(lǐng)域是公知的，并包括下列用舉例方式說明的脂酶F和/或ULTRA(NovozymesA/S，丹麥)、磷脂酶A2(例如磷酯酶A2來自Biocatalysts的LIPOMODTM22L，來自Genecor的LIPOMAXTM)、(NovozymesA/S，丹麥)，在W003/97835、EP0977869或EP1193314中教導(dǎo)的脂酶。本發(fā)明脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶和脂酶的聯(lián)用在面團制品或烘焙食品或在精細食品例如蛋糕和糖食的生產(chǎn)中是特別優(yōu)選的。脂酶與本發(fā)明的酶的聯(lián)合使用在可能需要游離脂肪酸的一些蓄積的情況下尤其有優(yōu)勢，例如在游離脂肪酸可以產(chǎn)生所需香氣的干酪中，或在精細食品的制備中。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以聯(lián)用成比例的脂解酶，例如F和/或ULTRA(NovozymesA/S，丹麥)、磷脂酶A2(例如磷酯酶A2來自Biocatalysts的LIPOMODTM22L，來自Genecor的LIPOMAXTM)，(NovozymesA/S，丹麥)，在W003/97835，EP0977869或EP1193,314中教導(dǎo)的脂酶，以提供理想的水解與轉(zhuǎn)移酶活性比例，這能夠帶來食品中優(yōu)選的技術(shù)效果或技術(shù)效果的組合(例如那些在本文中在“技術(shù)效果”中所列的內(nèi)容)。傳統(tǒng)的蛋糕工業(yè)使用蛋糕改良劑以改善蛋糕產(chǎn)量并保證在口味、結(jié)構(gòu)、食用質(zhì)量和外觀方面具有高質(zhì)量的蛋糕。這些蛋糕改良劑一般是基于在如淀粉和麥芽糊精等的載體上經(jīng)噴霧干燥的乳化劑。一些蛋糕改良劑還為基于乳化劑、糖和水的凝膠形式。這些蛋糕改良劑對于蛋糕生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)出高質(zhì)量蛋糕至關(guān)重要。但是蛋糕改良劑含有乳化劑和其它具有E編號的“非天然”成分。由于消費者要求減少E編號的數(shù)量，蛋糕生產(chǎn)企業(yè)就需要不使用乳化劑而采取其它替代的方法生產(chǎn)出高質(zhì)量蛋糕。一種替代方法是生產(chǎn)蛋糕時使用一種酶，即本文限定的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶或本發(fā)明的酶組合物。本文限定的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶和/或本發(fā)明的食品酶組合物可在生產(chǎn)精細食品如蛋糕時使用。在這樣的例子中，下列成分可在精細食品中形成。i)食糖酯和溶血卵磷脂(源于蛋糕配方中的碳水化合物和形成蛋糕配方組成部分的蛋中的卵磷脂)；和/或ii)?；碾暮腿苎蚜字?在蛋白脂肪酸縮聚物形成過程中，將脂肪酸從卵磷脂轉(zhuǎn)移到蛋白或肽，這種蛋白脂肪酸縮聚物被認為是十分有效的乳化劑(HerstellungundAnvendungmoglichkeitenvonEiweiss-Fettsaurekondensaten.AndreasSander，EberhardEilers，AndreaHeilemann，EdithvonKreis.Fett/lipid99(1997)Nr.4，115-120))。一般認為在制備一些精細食品時，具體是高脂肪精細食品，如蛋糕，需要一些脂肪酸蓄積。因此，聯(lián)合應(yīng)用脂解酶和本文所述的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶對于生產(chǎn)高脂肪精細食品尤其有益?；蛘?，可選擇另外的游離脂肪酸或脂肪酸皂化物(E470a)，并與所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶聯(lián)合應(yīng)用。本發(fā)明的食品適宜地包含一種或多種下列添加劑大豆蛋白材料；類胡蘿卜素、黃酮素(flavenoid)、抗氧化劑和植物化學(xué)成分(具體是anthocyanonide、類胡蘿卜素、生物黃酮素(bioflavinoid)、谷胱甘肽、兒茶素、異黃酮、番茄紅素(lycopene)、人參皂苷(ginsenoside)、柏松素(pycnogenol)、生物堿(alkaloid)、臀果木(pygeum)植物甾醇、蘿卜硫素(sulphoraphone)、芪三酚(resveretol)、葡萄籽提取物或含有甾烷醇酯類的食品)，維生素(具體是維生素C、維生素A、維生素B3、維生素D、維生素E、硫胺(thiamine)、核黃素、煙酸、吡哆醇(pyridoxine)、氰鈷胺素(cyanocobalamin)、葉酸、生物素、泛酸或維生素K)，礦物質(zhì)(具體是鈣、碘、鎂、鋅、鐵、硒、錳、鉻、銅、鈷、鉬或磷)，脂肪酸(具體是γ-亞油酸(linoleicacid)、ucospentaenoicacid或二十二碳六烯酸)，油(特別是琉璃苣油(borageoil)、高類胡蘿卜素canola油(highcarotenoidcanolaoil)或亞麻仁油(flaxseedoil))，氨基酸(具體是色氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、精氨酸、門冬氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸、絲氨酸、牛磺酸或酪氨酸)，酶((具體是菠蘿蛋白酶(bromelain)，木瓜蛋白酶，淀粉酶，纖維素酶或輔酶Q)、木質(zhì)素、甾烷醇酯或無害細菌(具體是嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillusbulgaricus)、雙歧乳桿菌(Lactobacillusbifidus)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)或屎腸球菌(Streptococcusfaecium))，葉酸和可溶性纖維。技術(shù)效果出乎意料地，脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶在食品中具有顯著的?；D(zhuǎn)移酶活性。這種活性在食品的制備方法中具有意想不到的有益應(yīng)用。本發(fā)明基于意想不到的發(fā)現(xiàn)，即本發(fā)明的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可在含水量較高的食品中通過醇解作用(alcoholosis)進行碳水化合物酯化作用，即從脂質(zhì)轉(zhuǎn)移?；，F(xiàn)有技術(shù)提示這種酶如果完全以這種方式發(fā)揮功能，那么只能在溶劑環(huán)境中發(fā)揮作用(即在含水量低或無水的環(huán)境中)。本發(fā)明提供了一或多種以下在蛋制品具體是蛋黃醬中的意外的技術(shù)效果在巴氏滅菌過程中改善的熱穩(wěn)定性；改善的感覺器官特性，改善的粘稠度(consistency)。本發(fā)明提供了一或多種在面團和/或烘焙產(chǎn)品中的下列意外的技術(shù)效果改善的面團或烘焙產(chǎn)品(例如面包和/或蛋糕)的體積度(specificvolume)；改善的面團穩(wěn)定性；改善的外皮評分(例如更薄和/或更脆的面包外皮)；改善的面團瓤評分(例如更為均勻的面團瓤分布和/或更精細的面團瓤結(jié)構(gòu)和/或更為柔軟的面團瓤)；改善的外觀(例如表面光滑沒有泡或者洞，或者基本上沒有泡或者洞)；變味減少；改善的柔軟度；改善的氣味；改善的口味。本發(fā)明可提供有益的效果，所述效果源于食品中高表面活性物質(zhì)的形成而基本上不形成大量的游離脂肪酸，這樣可降低食品在儲藏時的氧化能力，這是因為游離脂肪酸比相應(yīng)的脂肪酸酯更易于被氧化。適宜地，本發(fā)明可提供在食品中的一種或多種以下意外的技術(shù)效果改善的外觀、改善的口感、提高的穩(wěn)定性，具體是提高的熱穩(wěn)定性、改善的口味、提高的柔軟度、改善的彈性、改善的乳化作用。適宜地，本發(fā)明提供在乳制品例如冰激淋中的一種或多種以下意外的技術(shù)效果改善的口感(更好的奶油性口感)、改善的口味、改善的熔化特性。適宜地，本發(fā)明提供了在蛋或蛋類產(chǎn)品中的一種或多種以下意外的技術(shù)效果乳化穩(wěn)定性的提高，熱穩(wěn)定性的提高，改善的風(fēng)味，降低的惡臭，改善的增稠特性，改善的粘稠度。與本文定義的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶在食品制備中的應(yīng)用相關(guān)的具體技術(shù)效果可列舉在以下表格中適宜地，本發(fā)明可在干酪中提供以下一種或多種意外的技術(shù)效果干酪中走油(oiling-off)效果的下降、干酪產(chǎn)率的增加、口味的改進、臭味減少、“肥皂”味減少。在食品生產(chǎn)中，具體是干酪的生產(chǎn)中，應(yīng)用本發(fā)明的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶在從乳制品回收可溶蛋白的能力方面具有顯著的優(yōu)點。例如，在干酪生產(chǎn)中接近全部牛奶蛋白的20％從乳清(即在乳凝塊形成以后殘留的牛奶的水樣部分)去除。乳清中包含可溶性乳蛋白，疏水蛋白保留在乳凝塊中。通過使用本發(fā)明的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶，可將酰基從脂質(zhì)(優(yōu)選從糖脂或磷脂)轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)(具體是乳清蛋白，例如乳球蛋白(lactoglobulin))形成蛋白脂肪酸縮聚物。因此，產(chǎn)生一種產(chǎn)品，它更加疏水而且能夠保留在乳凝塊中而非在乳清中洗脫。用這種方式，更多乳蛋白被保留在最終的產(chǎn)品中，即最終的乳制品如干酪。一方面，本發(fā)明部分基于可通過使用脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶改善食品諸如干酪產(chǎn)量。另外地或可以替代地，食品風(fēng)味、質(zhì)地、抗氧化穩(wěn)定性(oxidativestability)和/或食品保質(zhì)期都可以改善。另外地或可以替代地，食品可以具有降低的膽固醇水平或提高的植物甾醇酯/甾烷醇酯含量。不期望局限于某種具體的理論，認為食品產(chǎn)量的增加是由乳清蛋白和肽的?；D(zhuǎn)移作用導(dǎo)致的，并且導(dǎo)致干酪凝乳中乳清蛋白疏水性以及?；娜榍宓鞍椎某恋砹匡@著提高。在生物系統(tǒng)中，例如，膜結(jié)合蛋白和酶的沉積可以通過兩種不同機制獲得。膜結(jié)合蛋白或具有一定數(shù)量的跨膜或疏水域，或可選具有與多肽鏈連接的脂肪酸。脂肪酸通常具有14或16碳原子的碳鏈。脂肪酸與多肽鏈在三處不同位置共價連接，氨基酸氨基末端作為酰胺鍵，半胱氨酸殘基作為硫酯(thioester)連接，或絲氨酸或蘇氨酸作為酯連接。每一多肽分子僅一個脂肪酸對于將蛋白質(zhì)摻入細胞膜中是必需的。當脂肪酸通過共價鍵結(jié)合到非膜蛋白時，其物理的和功能的特性將明顯改變。WO97/14713描述了將大豆蛋白和谷蛋白通過用源自米黑毛霉(Mucormiehei)的脂酶(LipozymeTM，Novozymes)處理轉(zhuǎn)化成酰基衍生物，和有機溶劑中的脂肪酸。本發(fā)明的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可用于在低水分或高水分環(huán)境中產(chǎn)生酰化蛋白。我們注意到?；牡鞍仔纬蓛捎H性復(fù)合物，可以用于多種化妝品。酰化的蛋白能形成凝膠(可結(jié)合水以保持濕度)具有乳化性質(zhì)，在水和脂質(zhì)之間的中間相中具有非常好的活性。因此，本發(fā)明一方面可以提供包含本文定義的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的化妝品組合物。此外，本發(fā)明還提供了本文定義的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶在生產(chǎn)化妝品組合物中的用途。另一方面，本發(fā)明還提供了在化妝品組合物中原位產(chǎn)生蛋白質(zhì)酯的方法，該方法包括將本文定義的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶添加到化妝品組合物(或它的組分)中的步驟。多種食物蛋白能溶于水，因此適于通過脂酶?；D(zhuǎn)移酶(lipaseacyltransferase)進行原位修飾。在干酪生產(chǎn)中，β-乳球蛋白進入乳清級分而被丟失。在應(yīng)用脂酶?；D(zhuǎn)移酶或其變體進行酰化之后，初始的結(jié)果表明在粗質(zhì)凝乳酶(rennet)凝固過程中，β-乳球蛋白被沉淀于酪蛋白微團表面中。β-乳球蛋白在三個表面環(huán)上有三個潛在的?；饔梦稽c(絲氨酸殘基)。牛乳包含足量的卵磷脂，卵磷脂是脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶對β-乳球蛋白進行?；倪m宜底物。形成的溶血卵磷脂可以具有附加的乳化作用。與應(yīng)用不具有?；D(zhuǎn)移酶活性的脂解酶例如三酰甘油脂酶和磷脂酶相比，可以看到應(yīng)用本發(fā)明的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶具有明顯的改進。優(yōu)點從至少一種食品原料成分原位產(chǎn)生的乳化劑和甾醇/甾烷醇酯的生成表示食品原料將至少包含一種更少量的附加原料。由于在生產(chǎn)的方便性方面的改進，這是有益的。例如，無需進行進一步的加工過程或額外添加附加的成分，或附加的乳化劑。進一步，食品中可以包含更少量的“添加劑”。添加劑的減少或者去除是消費者想要的，而且，添加劑的添加經(jīng)常要求必須在產(chǎn)品成分表單中注明以便讓消費者清楚知道。因此，本發(fā)明是更具優(yōu)勢的。本發(fā)明的益處可以是食品中原位產(chǎn)生的乳化劑產(chǎn)品沒有帶來食品中自由脂肪酸含量的有害的增加。從至少一種食品原料成分中原位產(chǎn)生的兩種乳化劑和/或一種碳水化合物脂表明食品原料至少含有一種更少量的附加原料。另外，當脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶作用于糖脂時，能夠有益地原位產(chǎn)生乳化劑DGMG而不帶來食品中游離脂肪酸含量的有害的增加。因此，減少由于游離脂肪酸的增加而產(chǎn)生的有害效應(yīng)，包括但不限于降低奶酪中的“肥皂”味道，防止在面團中和烘烤面食中的超量使用。在一些方面，本發(fā)明的優(yōu)點在于降低了食品中游離膽固醇的水平。另一方面，本發(fā)明的優(yōu)點在于增加了食品中甾烷醇酯/甾醇酯的含量。一些甾烷醇酯和/或甾醇酯可以是有效的調(diào)味劑和/或質(zhì)地改良劑。本發(fā)明不但能夠原位生成乳化劑，而且能夠在食品中原位生成調(diào)味劑和/或質(zhì)地改良劑。已知一些甾烷醇酯/甾醇酯若添加到食品中能夠降低血清膽固醇和/或低密度脂蛋白。因此，本發(fā)明可以用于生產(chǎn)含有高水平甾醇酯和/或甾烷醇酯的食品。在一些方面，具體地，優(yōu)點在于本發(fā)明的酶應(yīng)用于基于蛋類的產(chǎn)品時去除了多余的游離碳水化合物。有益地，食品乳化劑性質(zhì)也得到增強，帶來了外觀的改善和/或可控性的增強和/或結(jié)構(gòu)的改善和/或一致性的增強和/或熱穩(wěn)定性的加強，而對口味沒有負面影響。另外，一些實施方案中，有利地，當自身應(yīng)用脂酶時，通過添加本發(fā)明的酶可有效地克服觀察到的“超劑量”效應(yīng)。這至少部分歸功于當應(yīng)用本發(fā)明所述的酶時沒有產(chǎn)生游離脂肪酸或僅有極低量的游離脂肪酸產(chǎn)生。分離在一方面，優(yōu)選地，本發(fā)明應(yīng)用的多肽或蛋白質(zhì)是分離形式的。術(shù)語“分離的”意思是序列至少基本上不含有至少一種其它成分，該成分于此序列天然相結(jié)合，并在自然界發(fā)現(xiàn)。純化在一方面，優(yōu)選地，本發(fā)明應(yīng)用的多肽或蛋白質(zhì)是純化型的。術(shù)語“純化的”意思是序列處于相對純化的狀態(tài)-如至少大約51％純度、或至少大約75％純度、至少大約80％純度、至少大約90％純度、至少大約95％純度、至少大約98％純度?？寺【幋a本發(fā)明所述多肽的核苷酸序列編碼具有本文定義的具體性質(zhì)的多肽或適合被修飾的多肽的核苷酸序列，可以從產(chǎn)生上述多肽的細胞或生物體中分離。本領(lǐng)域有多種不同的已知的方法分離核苷酸序列。例如，基因組DNA(genomicDNA)和/或cDNA庫可以應(yīng)用由源自產(chǎn)生多肽的生物體的染色體DNA或信使RNA構(gòu)建。如果多肽氨基酸序列是已知的，可以合成標記的寡核苷酸探針，并用于識別從生物體制備的基因組文庫的多肽編碼型克隆?？商娲?，包含與另一個已知的多肽基因同源的氨基酸序列的標記的寡核苷酸探針可以用于識別多肽編碼克隆。在后面的例子中，應(yīng)用低嚴謹性的雜交和洗滌條件?？商娲模嚯木幋a克隆能夠通過將基因組DNA片段插入表達載體如質(zhì)粒中進行鑒別，使用得到的基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)轉(zhuǎn)化不含酶的細菌，然后將轉(zhuǎn)化后的細菌涂布于含有一種被多肽抑制的酶瓊脂平皿，從而使表達多肽的克隆被鑒定。作為另外的選擇，編碼多肽的核苷酸序列可以用確定的標準方法合成制備，該標準方法例如BeucageS.L.等(1981)TetrahedronLetters22，p1859-1869描述的亞膦酰胺(phosphoroamidite)方法，或Matthes等(1984)EMBOJ.3，p801-805描述的方法。在亞膦酰胺方法中，寡核苷酸被合成(例如在自動DNA合成器中)、純化、退火、連接并克隆到適宜的載體中。核苷酸序列可以是混合的基因組和合成來源，混合的合成與cDNA來源，或混合的基因組與cDNA來源，其可通過使用標準技術(shù)連接合成DNA、基因組DNA(genomicDNA)或cDNA來源(適當?shù)?的片段來制備。每一個連接片段對應(yīng)于整個核苷酸序列中不同的位置。DNA序列也可通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)使用特異性的引物制備，例如US4,683,202中所描述的或在SaikiRK等(Science(1988)239，pp487-491)中所描述的。核苷酸序列本發(fā)明也包括具有本文定義的具體性質(zhì)的核苷酸序列編碼多肽。這里使用的術(shù)語“核苷酸序列”指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，它的變體、同族體、片段和它的衍生物(例如它的部分)。該核苷酸序列可以是基因組的、合成的、或重組的來源，不論是代表同義鏈或反義鏈，它可以是雙鏈的或是單鏈的。本發(fā)明術(shù)語“核苷酸序列”包含基因組DNA、互補DNA(cDNA)、合成DNA，和RNA。本發(fā)明優(yōu)選的是DNA，更優(yōu)選為編碼序列的cDNA。一個優(yōu)選的實施方案中，當結(jié)合到也存在它的自然環(huán)境中的、與其相結(jié)合的序列時，編碼具有本文定義具體特性的多肽的核苷酸序列本身不涵蓋自然條件下存在的天然核苷酸序列。為了便于參考，我們稱這種優(yōu)選的實施方案為“非自然核苷酸序列”。在這種條件下，術(shù)語“自然核苷酸序列”是指在其自身天然環(huán)境中的完整核苷酸序列，并且條件是與其天然所結(jié)合的完整啟動子可操作地連接，所述啟動子也存在于其自身天然環(huán)境中。因此，本發(fā)明的多肽可以通過存在于自然生物體中的核苷酸序列表達，但是其中的核苷酸序列不受該生物體中與其天然結(jié)合的啟動子的控制。優(yōu)選的多肽不是一種天然多肽。這種條件下，術(shù)語“天然多肽”是指一種處于其自身的天然環(huán)境中的完整多肽，且條件是它被其天然核苷酸序列表達。一般地，編碼具有本發(fā)明定義的具體性質(zhì)的多肽的核苷酸序列可以通過重組DNA技術(shù)(即重組DNA)制備。然而，在本發(fā)明一個可選擇的實施方案中，所述核苷酸序列的全部或部分可以應(yīng)用本領(lǐng)域已知的化學(xué)方法合成(參考CaruthersMH等(1980)NucAcidsResSympSer215-23andHornTetal(1980)NucAcidsResSympSer225-232)。分子進化一旦編碼酶的核苷酸序列被分離，或者推定的編碼酶的核苷酸序列被鑒定，修改選定的核苷酸序列是合乎需要的，例如為了制備本發(fā)明所述的酶而使核苷酸序列突變是合乎需要的。突變可以由合成的寡核苷酸引入。這些寡核苷酸包含位于所需的突變位點側(cè)翼的氨基酸序列。適宜的方法被Morinaga等在(Biotechnology(1984)2，p646-649)中公開。另一種將突變引入編碼酶的核苷酸序列的方法記述在Nelson和Long的(AnalyticalBiochemistry(1989)，180，p147-151)。作為定點突變的替代，例如上面所述，可以隨機引入突變，例如使用商業(yè)試劑盒諸如Stratagene生產(chǎn)的GeneMorphPCR突變試劑盒，或Clontech生產(chǎn)的多樣化(Diversify)PCR隨機突變試劑盒。EP0583265涉及對基于PCRd誘變的優(yōu)化，它能與突變DNA類似物(例如EP0866796中描述的那些物質(zhì))的應(yīng)用相結(jié)合。易錯聚合酶鏈式反應(yīng)(ErrorpronePCR)技術(shù)適宜于生產(chǎn)具有優(yōu)選特征的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶變體。WO0206457涉及脂酶分子進化。獲得新序列的第三種方法是非同一的氨基酸序列的片段化，或應(yīng)用任何數(shù)量的限制性內(nèi)切酶，或應(yīng)用諸如DNaseI的酶，并重新組裝編碼功能蛋白的全部氨基酸序列?；蛘?，可以引入一種或多種不可識別的氨基酸序列，并在重新組裝編碼功能蛋白的全部氨基酸序列的過程中引入突變。DNA改組和DNA家族改組(DNAshufflingandfamilyshuffling)技術(shù)適宜于生產(chǎn)具有優(yōu)選特性的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的突變體。適宜的實現(xiàn)“改組”的方法被EPO752008、EP1138763、EP1103606公開。如US6,180,406和WO01/34835所描述的，改組也可以與DNA突變的其它形式相結(jié)合。因此，能在體內(nèi)或在體外在核苷酸序列中產(chǎn)生大量的定點突變或隨機突變，隨后用不同的方法篩選功能改善的編碼多肽。應(yīng)用silico和exo介導(dǎo)的重組方法(見WO00/58517，US6,344,328，US6,361,974)，例如，分子進化能夠在產(chǎn)生的突變體保持與已知的酶或蛋白十分低的同源性的情況下完成。這些獲得的突變體與已知的轉(zhuǎn)移酶具有顯著的結(jié)構(gòu)近似性，但是具有十分低的氨基酸序列同源性。作為一個非限制的例子，另外地，多肽序列的突變或天然突變體能夠被整合到或野生型或其它突變或天然突變體中用于生產(chǎn)新的突變體。這種新的突變體也被篩選出來以改善編碼多肽的功能。通過上述提到的應(yīng)用和類似的分子進化方法，可在沒有任何關(guān)于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能的已知知識的情況下，鑒別和選擇具有優(yōu)選的性質(zhì)本發(fā)明所述酶的突變體，同時可產(chǎn)生不可預(yù)測的但有益的突變或突變體。本領(lǐng)域有關(guān)分子進化的應(yīng)用中有很多有關(guān)酶活力優(yōu)化或改變的例子。這些例子包括，但不限于以下一種或多種，優(yōu)化在宿主細胞內(nèi)或體外優(yōu)化的表達或活性，增加酶活性，改變酶作用底物和/或產(chǎn)品特異性，提高或降低酶或結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，在優(yōu)選的環(huán)境條件下(例如溫度、pH、酶作用底物)酶活性/特異性的改變。應(yīng)用分子進化工具可使酶發(fā)生改變以改善酶的功能，這對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯然的。適宜地，本發(fā)明中使用的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以是一種突變體，即與其親代酶比較，可以包含至少一個氨基酸置換、缺失或添加。突變酶保持與其親代酶至少1％、2％、3％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％的同源性。適宜的親代酶可包括任何具有酯酶或脂酶活性的酶。優(yōu)選地，親代酶與Pfam00657共有序列一致。在一個優(yōu)選的實施方案中，脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶突變體在GDSx、GANDY和HPT區(qū)保留或摻入至少一個或多個Pfam00657保守序列氨基酸殘基。酶，例如在水環(huán)境中無或低脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶活性的脂酶可應(yīng)用分子進化工具進行突變，引入或增強轉(zhuǎn)移酶活性，因此產(chǎn)生適用于本發(fā)明的組合物和方法的具有顯著轉(zhuǎn)移酶活性的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶。適宜地，用于本發(fā)明的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以是一種突變體，這種突變體與其親代酶相比，對于極性脂質(zhì)，優(yōu)選磷脂和/或糖脂具有增強的酶活性。優(yōu)選地，這種突變體優(yōu)選對于溶解性(lyso)極性脂質(zhì)表現(xiàn)出低或無活性。對于極性脂質(zhì)，磷脂和/或糖脂的增強的活性可能是水解作用和/或轉(zhuǎn)移酶活性的結(jié)果。與其親代酶相比，用于本發(fā)明的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶突變體可能減弱了對甘油三酯和/或甘油單酯和/或甘油二酯的活性。適宜地，酶突變體對甘油三酯和/或甘油單酯和/或甘油二酯無活性?；蛘撸景l(fā)明應(yīng)用的酶突變體可具有增強的對甘油三酯的活性，和/或也增強對下列一種或多種物質(zhì)的活性，極性脂質(zhì)、磷脂、卵磷脂、磷脂酰膽堿、糖脂、二半乳糖基甘油單酯、單半乳糖基甘油單酯。已知的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶突變體，和一種或多種突變體可適用于本發(fā)明的方法和用途和/或用于本發(fā)明的酶組合物中。僅僅作為舉例，在下列參考文獻中描述的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶突變體可以適用于本發(fā)明Hilton&BuckleyJBiol.Chem.1991Jan15266(2)997-1000；Robertson等J.Biol.Chem.1994Jan21；269(3)2146-50；Brumlik等J.Bacteriol1996Apr；178(7)2060-4；Peelman等ProteinSci.1998Mar；7(3)587-99。氨基酸序列本發(fā)明還包括具有本文定義的具體特性的多肽的氨基酸序列。這里使用的術(shù)語“氨基酸序列”與術(shù)語“多肽”和/或術(shù)語“蛋白質(zhì)”同義。在某些情況下，術(shù)語“氨基酸序列”與術(shù)語“肽”同義。氨基酸序列可從適宜的來源制備/分離，或者可以通過合成制備或可通過應(yīng)用DNA重組技術(shù)制備。適宜地，在此處提到的氨基酸序列可通過標準技術(shù)從分離出的本文教導(dǎo)的多肽中獲得。以下是測定分離的多肽中確定氨基酸序列的一種適宜方法純化的多肽可為冰凍干燥的，100μg冰凍干燥的原材料溶于50μl由8M尿素和0.4M碳酸氫銨組成的混合溶液中，pH8.4。溶解的蛋白質(zhì)50℃變性還原15分鐘，然后以氮氣覆蓋，添加5μl45mM的二硫蘇糖醇。經(jīng)冷卻至室溫后，在室溫，黑暗，氮氣環(huán)境中加入5μl100mM的碘乙酰胺，使半胱氨酸殘基衍生15分鐘。將135μl的水與溶于5μl水的5μg賴氨酸-C內(nèi)蛋白酶加入上述反應(yīng)混合物，在氮氣環(huán)境中37℃消化24小時。得到的多肽通過反相HPLC在VYDAC碳-18柱(0.46×15cm；10μm；TheSeparationGroup，California，USA)分離，使用水中的溶劑A0.1％TFA和乙腈中的溶劑B0.1％TFA。在氨基末端測序之前，可對選出的多肽利用相同溶液體系通過Develosil碳-18柱再進行色譜分析?？梢愿鶕?jù)生產(chǎn)廠家的技術(shù)說明書(AppliedBiosystems，California，USA)利用脈沖液態(tài)快速循環(huán)，使用AppliedBiosystems476A序列分析儀進行測序。序列同一性或序列同源性本發(fā)明還涉及與具有本文定義的具體性質(zhì)多肽的氨基酸序列或任何編碼這種多肽的核苷酸序列的氨基酸序列(后面稱為“同源序列”)具有一定程度的序列同一性或序列同源性的序列的用途。這里，術(shù)語“同源體”指的是與受試氨基酸序列和受試核苷酸序列具有一定同源性的實體。這里，術(shù)語“同源性”可與“同一性”等同。同源氨基酸序列和/或核苷酸序列應(yīng)提供和/或編碼保持功能活性和/或增強酶活性的多肽。在本文中，指定同源序列包含與受試序列具有至少75、85或90％一致性，優(yōu)選95或98％一致性的氨基酸序列。一般地，同源序列包括與受試氨基酸序列相同的活性位點等。雖然同源性也可被認為是相似性(即具有相似的化學(xué)性質(zhì)/功能的氨基酸殘基)，在本發(fā)明的上下文中，優(yōu)選以序列的同一性表述同源性。在本發(fā)明的上下文中，指定同源序列包括與編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列(主體序列)具有至少75，85或90％的同一性，優(yōu)選95或98％的同一性的核苷酸序列。一般地，同源序列包括與受試序列相同的編碼活性位點及其它的序列。雖然同源性也可被認為是相似性(即具有相似的化學(xué)性質(zhì)/功能的氨基酸殘基)，在本發(fā)明的上下文中，優(yōu)選以序列的同一性表述同源性。同源性比較可用肉眼進行，或更普遍的是，借助與容易獲得的序列比對軟件進行比較。這種市場上可買到的電腦軟件可計算出兩個或更多個序列之間的％同源性。％同源性可在相鄰的序列中計算，即一條序列與另一條對齊，一條序列的每一個氨基酸直接與另一條的氨基酸比較，每次一個殘基。這被稱為“無間隙”排列。一般地，這種無間隙排列只對相對較少數(shù)目的殘基進行。雖然這是一種非常簡單和穩(wěn)定的方法，但不能考慮到例如在否則同一的序列對中，插入和缺失將導(dǎo)致后面的氨基酸殘基不能對齊，因此當總體比對已經(jīng)完成時，很可能地導(dǎo)致同源性百分比大幅度下降。因此，為產(chǎn)生最佳排列而設(shè)計的許多序列比較方法考慮到可能存在的插入和缺失，而不會過分降低整體同源性得分。這是通過在序列中插入“缺口”，最大化局部同源性來實現(xiàn)的。但是，這些更為復(fù)雜的方法將“缺口罰分”(″gappenalties″)賦予每一個在排列上出現(xiàn)的缺口，使得對于相同數(shù)目的同一性氨基酸，具有盡可能少的缺口數(shù)的比對(反映兩條被比較序列之間更高的相關(guān)性)比缺口數(shù)多的比對可得到更高的分數(shù)。一般應(yīng)用的“親和缺口成本”(″Affinegapcosts″)缺口的存在的罰分較高，而對缺口后的每個后續(xù)的殘基罰分較少。這是最通常應(yīng)用的缺口評分系統(tǒng)。高缺口罰分當然產(chǎn)生具有較少缺口的優(yōu)化排列。大多數(shù)排列程序允許對缺口罰分進行更改。然而，使用這些軟件進行序列比較時優(yōu)選使用缺省值。例如，當使用GCGWisconsin最佳擬合(Bestfit)程序包時，缺省的氨基酸序列缺口罰分為每個缺口-12和每個延伸-4。計算最大同源性百分比首先需要考慮到缺口罰分，產(chǎn)生最佳排列，實現(xiàn)這樣排列的適宜的計算機程序是GCGWisconsin最佳擬合程序包(Devereux等1984Nuc.AcidsResearch12p387)。其它可進行序列對比的軟件實例，包括但不僅限于，BLAST程序包(參見Ausubeletal1999ShortProtocolsinMolecularBiology，4thEd-Chapter18)，F(xiàn)ASTA(Altschuletal1990J.Mol.Biol.403-410)和GENEWORKS比較工具組。BLAST和FASTA都可以脫機和在線檢索(參考Ausubel等1999，pages7-58to7-60)。然而，在一些應(yīng)用中優(yōu)選使用GCG最佳擬合程序。一個名為BLAST2Sequence的新工具也可以用于比較蛋白質(zhì)和核苷酸序列(參見FEMSMicrobiolLett1999174(2)247-50；FEMSMicrobiolLett1999177(1)187-8和tatiana&commat；ncbi.nlm.nih.gov)盡管最終同源性百分比能夠以同一性的方式測定，排列程序普遍不是基于全有或全無(all-or-nothing)的成對比較。作為替代，成比例的相似性分數(shù)矩陣是普遍應(yīng)用的，該矩陣為基于化學(xué)相似性和進化距離對每個配對比較賦值。平常應(yīng)用的這樣一種矩陣的一個實例就是BLOSUM62矩陣-BLAST程序組件的缺省矩陣。如果能提供的話(想得到進一步的詳細信息，參見用戶手冊)，GCGWisconsin程序通常應(yīng)用或公開的缺省值或應(yīng)用定制的標記比較表。在一些應(yīng)用中，優(yōu)選使用GCG程序包公開的缺省值，或者在應(yīng)用其它軟件的情況下，使用缺省的矩陣，如BLOSUM62?？蛇x擇地，同源性百分比可以在DNASISTM(HitachiSoftware)通過利用多重對比特征來計算，這基于一種類似于CLUSTAL(HigginsDG&SharpPM(1988)，Gene73(1)，237-244)的算法。一旦軟件產(chǎn)生了最佳的比對，就能夠計算序列同源性百分比，優(yōu)選序列同一性百分比。通常軟件進行部分序列的比較，產(chǎn)生數(shù)值型結(jié)果。序列也可以具有氨基酸殘基的刪除、插入或取代，這會產(chǎn)生一個沉默變化并導(dǎo)致生成一個功能上等同的物質(zhì)。只要物質(zhì)保持第二結(jié)合活性，目的氨基酸取代可以基于殘基在極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性、和/或兩親性方面的性質(zhì)的近似性進行。例如，帶負電荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；具有相似親水性并具有不帶電荷的極性頭基團的氨基酸，包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、和酪氨酸?？梢赃M行保守取代，例如下面表中所述。第二欄中同一區(qū)，優(yōu)選第三欄中同一行中的氨基酸可以互相取代。本發(fā)明也包含同源取代的產(chǎn)生，(取代和置換都為此處應(yīng)用的，即用另外的殘基取代現(xiàn)有的氨基酸殘基)即相似取代，例如堿性氨基酸取代堿性氨基酸，酸性氨基酸取代酸性氨基酸，極性氨基酸取代極性氨基酸等。也可以發(fā)生非同源取代，即從一類殘基到另一類或可選擇地涉及非天然氨基酸例如鳥氨酸(下文中記為Z)、二氨基丁酸鳥氨酸(下文中記為B)、原亮氨酸鳥氨酸(下文中記為O)、pyriylalanine、噻吩基丙氨酸(thienylalanine)、萘基丙氨酸(naphthylalanine)和苯基甘氨酸。取代也可以通過非天然氨基酸產(chǎn)生。氨基酸序列的突變體可以包含適宜的可插入任意兩個氨基酸殘基序列間的間隔基團包括烷基基團諸如甲基、乙基、丙基，以及氨基酸間隔物，例如甘氨酸或丙氨酸殘基。進一步的突變形式是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解的，該突變形式包含類肽(peptoid)形式的一種或多種氨基酸殘基。為了避免產(chǎn)生疑問，“類肽形式”用于指代變體氨基酸殘基，其中α-碳取代基團在該殘基的氮原子上而非α-碳上。制備類肽形式的肽是本領(lǐng)域已知的，例如SimonRJ等.，PNAS(1992)89(20)，9367-9371和HorwellDC，TrendsBiotechnol.(1995)13(4)，132-134。本發(fā)明中應(yīng)用的核苷酸序列或編碼具有本文定義的具體性質(zhì)的多肽的核苷酸序列可以包括合成的或修飾的核苷酸。寡核苷酸的許多不同種類的修飾是本領(lǐng)域已知的。這些包括甲基膦酸酯和磷硫酰骨架和/或在分子的3′和/或5′端附加的吖啶或聚賴氨酸鏈。為了本發(fā)明所述的目的，本領(lǐng)域任何可得的方法均可以用于修飾本文描述的氨基酸序列，這是可以理解的。這些修飾可以用于提高核苷酸序列在體內(nèi)的活性或延長氨基酸序列的壽命。本發(fā)明也涉及氨基酸序列作為本文討論的序列，或任何衍生物、片段及其衍生物的互補序列的用途。如果序列為它的片段的互補序列，那么該序列可以用作探針鑒定其它生物體中相似編碼序列的存在等。與本發(fā)明非100％同源但落入發(fā)明保護范圍的多核苷酸序列，是可以通過多種途徑獲得的。此處描述的序列的其它突變體也可以獲得，例如通過檢測來自不同范圍個體例如來自不同種群的個體的DNA文庫。而且，其它病毒的/細菌的，或細胞的同源體特別是哺乳動物細胞(例如大鼠、小鼠、?；蜢`長類動物細胞)的細胞同源物可以獲得，此同源體和它的片段一般而言能夠選擇性地與本文序列表所列的序列雜交。此序列可以通過檢測其它動物物種的cDNA文庫或基因組DNA文庫來獲得，并在中到高嚴謹條件下用探針探測這樣的文庫，所述探針包含序列表中所示任何序列的全部或部分。相似的考慮適用于獲得本發(fā)明的多肽和核苷酸序列的種屬同源物和等位基因突變體。變體和菌株/種屬同源體也可以應(yīng)用簡并PCR獲得，其使用設(shè)計用來靶向變體和同源體中編碼本發(fā)明序列中保守氨基酸序列的序列的引物。保守序列可以例如通過比對來自數(shù)種變體/同源體的氨基酸序列來預(yù)知。序列比對可以通過本領(lǐng)域公知的計算機軟件進行。例如廣泛應(yīng)用的GCGWisconsinPileUp程序。用于簡并PCR的引物可以包含一或多個簡并位置，其可用于嚴格條件，該嚴格條件低于用針對已知序列的單個序列引物來克隆序列的那些嚴格條件。或者，此多核苷酸能夠通過特征序列的定點誘變獲得。在需要例如沉默密碼子序列變化來最優(yōu)化密碼子對其中表達多核苷酸的具體宿主細胞的偏好時，這是有用的。其它序列的變化是為了引入限制多肽識別位點，或改變多核苷酸編碼的多肽的性質(zhì)或功能。本發(fā)明的多核苷酸(核苷酸序列)可以的探針用于制備引物例如PCR引物、用于替換擴增反應(yīng)的引物，探針例如通過常規(guī)方法用放射性或非放射性標記從而由暴露(revealing)標記物來標記，或者多核苷酸可以克隆到載體中。所述引物、探針和其它片段可以為至少15，優(yōu)選至少20，例如至少25、30或40個核苷酸的長度，也包含在本發(fā)明所用的術(shù)語多核苷酸中。本發(fā)明所述的多核苷酸例如DNA多核苷酸和探針可以重組地制備、合成地制備或用本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠獲得的任意有效的方法制備。它們也可以通過標準技術(shù)克隆。一般而言，引物是用合成方法生產(chǎn)的，包括以一次一種核苷酸的方式所需核酸序列的分步制備方法。使用自動技術(shù)完成上述任務(wù)的技術(shù)是本領(lǐng)域容易獲得的技術(shù)。較長的多核苷酸通常可以用基因重組技術(shù)制備，例如應(yīng)用PCR(多聚酶鏈式反應(yīng))克隆技術(shù)。這包含制備位于需要克隆的脂質(zhì)靶向序列區(qū)域側(cè)翼的引物對(例如大約15到30個氨基酸)，使該引物與從動物或人細胞獲得的mRNA或cDNA接觸，在使所需區(qū)域擴增的條件下進行多聚酶鏈式反應(yīng)，分離被擴增的片段(例如通過在瓊脂糖凝膠中純化反應(yīng)混合物)并回收被擴增的DNA。引物可以被設(shè)計為包含適宜的酶識別位點限制性內(nèi)切酶，以至于被擴增的DNA能夠被克隆到適宜的克隆載體。雜交本發(fā)明也包含本發(fā)明序列的互補序列，或能夠或雜交到本發(fā)明序列中或其互補序列中的序列。本發(fā)明應(yīng)用的術(shù)語“雜交”包括“通過堿基配對將核酸鏈連接到互補鏈的過程”，也就是使用多聚酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)的擴增過程。本發(fā)明也涉及能夠與本文討論的受試序列的互補序列或它的任何衍生物、它的片段或其衍生物雜交的核苷酸序列的用途。本發(fā)明也涉及與能夠與本文討論的核苷酸序列雜交的序列的互補序列。雜交條件基于核苷酸結(jié)合復(fù)合物的解鏈溫度(Tm)，如Berger和Kimmel(1987，GuidetoMolecularCloningTechniques，MethodsinEnzymology，Vol.152，AcademicPress，SanDiegoCA)中的教導(dǎo)，并顯示如下定義的“嚴格性”。最大嚴格性有代表性的發(fā)生在Tm-5℃(比探針的Tm低5℃)條件下；高嚴格性發(fā)生在大約Tm下5℃-10℃；中等嚴格性發(fā)生在大約Tm下10℃-20℃；低嚴格性發(fā)生在大約Tm下20℃-25℃。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的，最大嚴格性雜交能夠用于鑒定或檢測相同的核苷酸序列，而中等(或低)嚴格性雜交能夠用于鑒定或檢測類似或相關(guān)的多聚核苷酸序列。優(yōu)選地，本發(fā)明包含在高嚴格性或中等嚴格性條件下能夠與編碼具有本發(fā)明定義具體性質(zhì)的多肽的核苷酸序列雜交的序列之互補序列。更加優(yōu)選地，本發(fā)明涉及能夠在高嚴格條件(例如65℃和O.IxSSC{1xSSC＝0.15MNaCl，0.015M檸檬酸鈉pH7.0))下與編碼具有本文定義的具體性質(zhì)的多肽的核苷酸序列雜交的序列之互補序列。本發(fā)明也涉及能夠與本文討論的核苷酸序列(包括那些本文討論的序列的互補序列)雜交的序列。本發(fā)明也涉及能夠與本文討論的核苷酸序列(包括那些本文討論的序列的互補序列)雜交的序列的互補序列。本發(fā)明也包括在中等到最大嚴格性條件下，能夠與本文討論的核苷酸序列雜交的多聚核苷酸序列。在優(yōu)選的方面中，本發(fā)明覆蓋了能夠在嚴格條件下(例如50℃和0.2×SSC)與本文討論的核苷酸序列，或它的互補序列雜交的核苷酸序列。在更加優(yōu)選的方面中，本發(fā)明覆蓋了能夠在高嚴格條件下(例如65℃和0.1×SSC)與本文討論的核苷酸序列，或它的互補序列雜交的核苷酸序列。多肽的表達本發(fā)明使用的或編碼具有本發(fā)明所限定具體性質(zhì)的多肽的核苷酸序列能夠被摻入到重組的可復(fù)制載體中。該載體可以在和/或從相容的宿主細胞中復(fù)制并表達核苷酸序列為多肽的形式。表達可以用控制序列，包括啟動子/增強子和其它表達調(diào)節(jié)信號來控制?？墒褂迷松锏膯幼雍驮谡婧思毎芯哂泄δ艿膯幼?。可使用組織特異性啟動子或刺激特異性啟動子。也可使用嵌合的啟動子，它包含的序列元件來自兩種或多種上述不同啟動子。由宿主重組細胞產(chǎn)生的核苷酸序列表達的多肽可以依賴于使用的序列和/或載體被分泌或被包含在細胞內(nèi)。編碼序列可以設(shè)計成與信號序列一起，該信號序列可以引導(dǎo)所述物質(zhì)的編碼序列穿過具體的原核生物或真核生物細胞膜。表達載體術(shù)語“表達載體”意思是一種能夠在體內(nèi)或體外表達的構(gòu)建體。優(yōu)選地，表達載體是摻入到生物體基因組中的。術(shù)語“摻入”優(yōu)選包括穩(wěn)定地摻入到基因中。本發(fā)明的核苷酸序列或編碼具有本發(fā)明所限定具體性質(zhì)的多肽的核苷酸序列可以存在于載體中，其中所述核苷酸序列可操作地連接到調(diào)節(jié)序列，以至于該調(diào)節(jié)序列能夠通過適宜的宿主生物體表達核苷酸序列，即該載體是表達載體。本發(fā)明的載體可以被轉(zhuǎn)化到合適的下面描述的宿主細胞來表達具有本發(fā)明所限定的具體性質(zhì)的多肽。載體的選擇，例如質(zhì)粒、粘端質(zhì)粒、病毒或噬菌體載體，常常依賴于它被引入的宿主細胞。載體可以包含一種或多種可選標記基因-諸如提供抗生素抗性的基因，如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性?；蛘?，該選擇可以通過共轉(zhuǎn)化完成(如WO91/17243中描述的)。載體可被用于體外，例如產(chǎn)生RNA或用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細胞。因此，在一個進一步的具體實施方案中，本發(fā)明提供了一種制備本發(fā)明的核苷酸序列或編碼具有本發(fā)明所限定具體性質(zhì)的多肽的核苷酸序列的方法，所述方法是通過引入核苷酸序列到可復(fù)制載體中，引入該載體到適合的宿主細胞中，并在能夠引起所述載體復(fù)制的條件下使所述宿主細胞生長。載體可以進一步包含在正討論的宿主細胞中促進載體復(fù)制的核苷酸序列。這些序列的例子是質(zhì)粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的復(fù)制起點。調(diào)節(jié)序列在一些應(yīng)用中，本發(fā)明使用的核苷酸序列或編碼具有本發(fā)明所限定具體性質(zhì)的多肽的核苷酸序列可以可操作地連接到能(如通過被選宿主細胞)表達所述核苷酸序列的調(diào)節(jié)序列上。例如，本發(fā)明包括這樣的載體，其包含可操作連接到這樣的調(diào)節(jié)序列上的本發(fā)明核苷酸序列，即該載體是表達載體。術(shù)語“可操作連接”(″operablylinked″)指并列(juxtaposition)，其中描述的組分為使它們以意圖方式作用的關(guān)系?！翱刹僮鬟B接”到編碼序列的調(diào)節(jié)序列以通過在與控制序列相容的條件下完成表達編碼序列的方式來連接。術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”包括啟動子和增強子和其它表達調(diào)節(jié)信號。這里使用的術(shù)語“啟動子”是本領(lǐng)域內(nèi)可常規(guī)使用的，例如RNA聚合酶結(jié)合位點。編碼具有本發(fā)明限定的具體性質(zhì)的酶的核苷酸序列的增強表達也可以通過選擇異源的調(diào)節(jié)序列來完成，例如啟動子、分泌前導(dǎo)序列(secretionleader)和終止區(qū)。優(yōu)選地，本發(fā)明的核苷酸序列可以與至少一個啟動子可操作連接。指導(dǎo)細菌、真菌或酵母宿主內(nèi)核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的適宜啟動子的例子是本領(lǐng)域公知的。構(gòu)建體術(shù)語“構(gòu)建體”與術(shù)語如“偶聯(lián)物(conjugate)”、“盒(cassette)”和“雜合體(hybrid)”同義，它包括編碼具有本發(fā)明所限定具體性質(zhì)的多肽的核苷酸序列，其用于根據(jù)本發(fā)明直接或間接與啟動子連接。間接連接的例子是在啟動子和本發(fā)明核苷酸序列中間提供適宜的間隔組(spacergroup)，例如內(nèi)含子序列，如Sh1內(nèi)含子或ADH內(nèi)含子。同樣，本發(fā)明的術(shù)語“融合”包括直接或間接連接。在一些方面，這些術(shù)語不包括編碼通常與野生型基因啟動子連接的蛋白質(zhì)的核苷酸序列的天然組合并且條件是所述它們都處于它們的自然環(huán)境中。所述構(gòu)建體甚至可以包含或表達允許選擇遺傳構(gòu)建體的標記物。對于一些應(yīng)用中，優(yōu)選所述構(gòu)建體包含至少本發(fā)明的核苷酸序列或編碼具有本發(fā)明限定的具體性質(zhì)的多肽的核苷酸，其可操作連到啟動子。宿主細胞本發(fā)明的術(shù)語“宿主細胞”包括任何具有以下性質(zhì)的細胞其包含編碼具有本發(fā)明所限定具體性質(zhì)的多肽的核苷酸序列，或者上面描述的用于重組制備具有本發(fā)明所限定具體性質(zhì)的多肽的表達載體。因此，本發(fā)明進一步的具體實施方案提供了用本發(fā)明核苷酸序列或編碼具有本發(fā)明所限定具體性質(zhì)的多肽的核苷酸序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細胞?？蛇x擇與上述載體相容的所述細胞，可以例如是原核生物(如細菌)、真菌、酵母或植物的細胞。優(yōu)選的宿主細胞不是人的細胞。適合的細菌宿主生物體的例子是革蘭陰性菌或革蘭氏陽性菌。依賴于編碼具有本發(fā)明所限定具體性質(zhì)的多肽的核苷酸序列的性質(zhì)，和/或進一步加工所表達蛋白質(zhì)的需求，真核生物的宿主例如酵母或其它真菌是優(yōu)選的。一般而言，酵母細胞是相對真菌細胞優(yōu)選的，因為酵母細胞較容易操縱。然而，一些蛋白質(zhì)或者從酵母細胞中分泌很少，或者有時沒有被恰當加工(例如酵母中的高糖基化)。在這些例子中，應(yīng)選擇不同的真菌宿主生物體。適宜宿主細胞，如酵母、真菌和植物宿主細胞的用途，可以提供翻譯后修飾(例如豆蔻?；?、糖基化、截短、投石(lapidation)和酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸磷酸化)，因為可能需要使本發(fā)明的重組表達產(chǎn)物具有最佳生物活性。所述宿主細胞可以是蛋白酶缺陷的或蛋白酶陰性的(minus)菌株。生物體本發(fā)明的術(shù)語“生物體”包括任何包含本發(fā)明所述的核苷酸序列，或包含用于編碼具有本發(fā)明所限定具體性質(zhì)的多肽的核苷酸序列和/或由此獲得的產(chǎn)物的生物體。適宜的生物體可包括原核生物、真菌，酵母或植物。本發(fā)明的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因生物體”包括任何生物體，所述生物體包含用于編碼具有本發(fā)明所限定具體性質(zhì)的多肽的核苷酸序列和/或由此獲得的產(chǎn)品的，和/或其中的啟動子能夠允許在生物體中表達用于編碼具有本發(fā)明所限定具體性質(zhì)的多肽的核苷酸序列。優(yōu)選的核苷酸序列被摻入在生物體基因組中。術(shù)語“轉(zhuǎn)基因生物體”不包括在天然環(huán)境中的天然核苷酸編碼序列，此時所述序列受同樣處于天然環(huán)境中的它們的天然啟動子控制。因此，本發(fā)明轉(zhuǎn)基因生物體包括含有選自如下物質(zhì)之一，或其組合的生物體用于編碼具有本發(fā)明所限定的具體性質(zhì)的多肽的核苷酸序列，本文定義的構(gòu)建體，本文限定的載體，本文限定的質(zhì)粒，本文限定的細胞，或它的產(chǎn)物。例如，轉(zhuǎn)基因生物體也包含在異源的啟動子控制下用于編碼具有本發(fā)明所限定的具體性質(zhì)的多肽的核苷酸序列。宿主細胞/宿主生物體轉(zhuǎn)化正如先前指出的，宿主生物體可以是原核生物體或真核生物體。適合的原核生物宿主的例子包括大腸桿菌和枯草桿菌。原核生物宿主轉(zhuǎn)化是本領(lǐng)域公知的，例如參見Sambrook等(MolecularCloningALaboratoryManual，2ndedition，1989，ColdSpringHarborLaboratoryPress)。如果應(yīng)用原核生物宿主，那么核苷酸序列在轉(zhuǎn)化之前需要被適當修飾-例如去除內(nèi)含子。另一個具體實施方案中，轉(zhuǎn)基因生物體可以是酵母。絲狀真菌細胞可以使用本領(lǐng)域公知的各種方法轉(zhuǎn)化，例如涉及原生質(zhì)體形成和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，之后用公知的方式再生細胞壁的方法。曲霉(Aspergillus)作為宿主微生物的用途已經(jīng)被EP0238023公開。另一種宿主生物體可以是植物。用于轉(zhuǎn)化植物的一般技術(shù)的綜述公開在Potrykus的文章中(AnnuRevPlantPhysiolPlantMolBiol[1991]42205-225)和Christou的文章中(Agro-Food-IndustryHi-TechMarch/April199417-27)。進一步有關(guān)于植物轉(zhuǎn)化方面的教導(dǎo)見于EP-A-0449375。對于真菌、酵母和植物轉(zhuǎn)化的廣泛教導(dǎo)見下述部分。轉(zhuǎn)化的真菌宿主生物體可以是真菌-例如絲狀真菌。此類適合的宿主的例子包括屬于嗜熱酶屬、枝頂孢霉屬(Acrenomium)、曲霉屬、青霉屬、毛霉屬(Mucor)、脈孢菌屬(Neurospora)、木霉屬(Trichoderma)等菌屬中的任意一種。轉(zhuǎn)化絲狀真菌的教導(dǎo)可以參見US-A-5741665，它綜述了轉(zhuǎn)化絲狀真菌和培養(yǎng)真菌本領(lǐng)域公知的標準技術(shù)。一個適用于粗糙脈孢菌(N.crassa)的范圍更廣的綜述，例如見于Davis和deSerres的MethodsEnzymes(1971)17A79-143中。進一步轉(zhuǎn)化絲狀真菌的教導(dǎo)被公開在US-A-5674707中。一方面，宿主生物體可以是曲霉屬，例如黑曲霉。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因曲霉也可用以下方法制得，例如TurnerG.1994(Vectorsforgeneticmanipulation.InMartinelliS.D.，KinghomJ.R.(編者)Aspergillus50yearson.Progressinindustrialmicrobiologyvol29.ElsevierAmsterdam1994.pp.641-666)教導(dǎo)的方法。絲狀真菌中的基因表達已經(jīng)被公開在Punt等(2002)TrendsBiotechnol2002May；20(5)200-6，Archer&PeberdyCritRevBiotechnol(1997)17(4)273-306中。轉(zhuǎn)化的酵母在另一個具體實施方案中，轉(zhuǎn)基因生物體可以是酵母。有關(guān)酵母中異源基因表達的原理的綜述見于，例如MethodsMolBiol(1995)，49341-54，和CurrOpinBiotechnol(1997)Oct；8(5)554-60。從這個角度，酵母-例如釀酒酵母(Saccharomycescerevisi)或巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)(參見FEMSMicrobiolRev(200024(1)45-66)可以被用作異源基因表達的載體。有關(guān)釀酒酵母異源基因表達和基因產(chǎn)物的分泌原理的綜述見EHinchcliffeEKenny(1993，″Yeastasavehiclefortheexpressionofheterologousgenes″，Yeasts，Vol5，AnthonyHRoseandJStuartHarrison，eds，2ndedition，AcademicPressLtd.)。對于酵母的轉(zhuǎn)化，已開發(fā)了數(shù)個試驗方案。例如，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因酵母可以通過以下Hinnen等(1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUSA75，1929)；Beggs，JD(1978，Nature，London，275，104)；andIto，Hetal(1983，JBacteriology153，163-168)教導(dǎo)的方法制備。轉(zhuǎn)化的酵母細胞可以通過使用不同的選擇性標記例如營養(yǎng)缺陷型標記顯性的抗菌素抗性標記來選擇。適宜的酵母宿主生物體可以選自生物工程相關(guān)酵母種類，例如，但不限于，選自畢赤酵母屬、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬、Yarrowiniaspp.、酵母屬(Saccharomycesspp.)包括釀酒酵母、或裂殖酵母(Schizosaccharomycespp.)包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycepombe)。甲基營氧(methylotrophic)酵母種的菌株巴氏畢赤酵母(Pichiapastoris)可以用作宿主生物體。在一具體實施方案中，宿主生物體可以是漢遜酵母屬，例如多形漢遜酵母(H.polymorpha)(如在WO01/39544中公開的)。轉(zhuǎn)化的植物/植物細胞本發(fā)明適宜的宿主生物體可以是植物。有關(guān)一般技術(shù)的綜述見于Potrykus的文章(AnnuRevPlantPhysiolPlantMolBiol[1991]42205-225)和Christou的文章(Agro-Food-IndustryHi-TechMarch/April199417-27)，或在WO01/16308中。例如，轉(zhuǎn)基因植物可產(chǎn)生升高水平的植物甾醇酯以及phytostanol酯。因此，本發(fā)明也涉及生產(chǎn)具有提高的植物甾醇酯和phytostanol酯水平的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包含用本發(fā)明定義的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化植物細胞(具體是用包含本文定義的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的表達載體或結(jié)構(gòu)體)和從轉(zhuǎn)化的細胞培育植物的步驟。分泌通常，使多肽從表型宿主分泌到培養(yǎng)基中是希望得到的，而酶能夠很容易從所述培養(yǎng)基中回收。分泌前導(dǎo)序列可基于所需的表達宿主進行選擇。雜交信號序列也在本發(fā)明中得到應(yīng)用。異源分泌前導(dǎo)序列的常見例子是那些源于真菌淀粉葡苷酶(AG)基因(glaA-具有18和24氨基酸，例如來自曲霉)，a-因子基因(酵母例如酵母屬、克魯維酵母屬和漢遜酵母屬)或α-淀粉酶基因(芽孢桿菌屬)的序列。檢測本領(lǐng)域有多種檢測和測定氨基酸序列表達的公知方案。例如包括酶聯(lián)免疫吸附劑測定(ELISA)、放射免疫測定法(RIA)和熒光活化的細胞分選法(FACS)。本領(lǐng)域技術(shù)人員掌握已知多種標記和連接技術(shù)，并可以被應(yīng)用在核酸和氨基酸測定方面中。許多公司，例如PharmaciaBiotech(Piscataway，NJ)、Promega(Madison，WI)、和USBiochemicalCorp(Cleveland，OH)為這些方法提供商業(yè)試劑盒和實驗方案。適宜的報道分子或標記包括那些放射性核素、酶、熒光素、化學(xué)發(fā)光物(chemiluminescent)、顯色劑，也包括底物、輔助因子、抑制因子、磁顆粒等等類似的物質(zhì)。專利包括US-A-3,817,837、US-A-3,850,752、US-A-3,939,350、US-A-3,996,345、US-A-4,277,437、US-A-4,275,149和US-A-4,366,241已經(jīng)教導(dǎo)了這些標記的用途。重組免疫球蛋白也可以如US-A-4,816,567中所述生產(chǎn)。融合蛋白具有本發(fā)明所述具體性質(zhì)的多肽可以被當作融合蛋白生產(chǎn)，例如有助于它的提取和純化。融合蛋白配偶體(partner)的例子包括谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA結(jié)合區(qū)域和/或轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域)和β-半乳糖苷酶。在融合蛋白配偶體和目的蛋白序列之間包含蛋白水解切割位點以便允許去除融合蛋白序列的蛋白質(zhì)序列也是方便的。優(yōu)選的融合蛋白不妨礙所述蛋白質(zhì)序列的活性。大腸桿菌中的基因融合表達系統(tǒng)已經(jīng)公開在Curr.Opin.Biotechnol.(1995)6(5)501-6中。本發(fā)明的另一個具體實施方案中，具有本發(fā)明所述具體性質(zhì)的多肽的氨基酸序列可以連接到異源序列以便編碼融合蛋白。例如，為了篩選多肽文庫尋找能夠影響物質(zhì)活性的因子，編碼表達可識別可購得的抗體的異源表位的嵌合物質(zhì)是有用的。本發(fā)明下面的部分將僅通過實施例并參照下圖與實施例進行詳細描述。圖1顯示來自第6版數(shù)據(jù)庫的pfam00657共有序列(SEQIDNo.1)；圖2顯示從生物體嗜水氣單胞菌中得到的氨基酸序列(SEQIDNo.2)(P10480；GI121051)；圖3顯示從生物體殺鮭氣單胞菌中得到的氨基酸序列(SEQIDNo.3)(AAG098404；GI9964017)；圖4顯示從生物體天藍色鏈霉菌A3(2)中得到的氨基酸序列(SEQIDNo.4)(Genebank登錄號NP631558)；圖5顯示從生物體天藍色鏈霉菌A3(2)中得到的氨基酸序列(SEQIDNo.5)(Genebank登錄號CAC42140)；圖6顯示從生物體釀酒酵母中得到的氨基酸序列(SEQIDNo.6)(Genebank登錄號P41734)；圖7顯示所選序列與pfam00657共有序列的比對。圖8顯示SEQIDNo.3與SEQIDNo.2的配對比對，其顯示93％的氨基酸序列同一性。信號序列加下劃線。+表示有差別。GDSX基序包括活性位點絲氨酸16，并且活性位點天冬氨酸116和組氨酸291突出顯示(見于陰影區(qū)域)。氨基酸后的數(shù)字是負信號序列(minusthesignalsequence)；圖9顯示編碼從生物體嗜水氣單胞菌獲得的、本發(fā)明脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的核苷酸序列(SEQIDNo.7)；圖10顯示編碼從生物體殺鮭氣單胞菌獲得的、本發(fā)明脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的核苷酸序列(SEQIDNo.8)；圖11顯示編碼從生物體天藍色鏈霉菌A3(2)獲得的、本發(fā)明脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的核苷酸序列(SEQIDNo.9)(Genebank登錄號Nec003888.18327480..8328367)；圖12顯示編碼從生物體天藍色鏈霉菌A3(2)獲得的、本發(fā)明脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列(SEQIDNo.10)(Genebank登錄號AL939131.1265480..266367)；圖13顯示編碼從生物體釀酒酵母獲得的、本發(fā)明脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的核苷酸序列(SEQIDNo.11)(Genebank登錄號Z75034)；圖14顯示從生物體雷爾氏菌(Ralstonia)獲得的氨基酸序列(SEQIDNo.12)(Genebank登錄號AL646052)。圖15顯示編碼從生物體雷爾氏菌獲得的本發(fā)明脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的核苷酸序列(SEQIDNo.13)；圖16顯示SEQIDNo.20。所述序列編碼Scoe1，其為NCBI蛋白質(zhì)登錄號CAB39707.1GI4539178保守的公知(hypothetical)蛋白質(zhì)[天藍色鏈霉菌A3(2)]；圖17顯示如SEQIDNo.21所示的核苷酸序列，其編碼NCBI蛋白質(zhì)登錄號CAB39707.1GI4539178保守的公知蛋白質(zhì)[天藍色鏈霉菌A3(2)]；圖18顯示SEQIDNo.22所示氨基酸序列。所述序列編碼Scoe2，其為NCBI蛋白質(zhì)登錄號CAC01477.1GI9716139的保守公知蛋白質(zhì)[天藍色鏈霉菌A3(2)]；圖19顯示如SEQIDNo.23所示核苷酸序列，該核苷酸序列編碼Scoe2，其為NCBI蛋白質(zhì)登錄號CAC01477.1GI9716139的保守公知蛋白質(zhì)[天藍色鏈霉菌A3(2)]；圖20顯示Scoe3的氨基酸序列(SEQIDNo.24)，所述Scoe3為NCBI蛋白質(zhì)登錄號CAB88833.1GI7635996的公知分泌性蛋白[天藍色鏈霉菌A3(2)]；圖21顯示如SEQIDNo.25所示核苷酸序列，該核苷酸序列編碼Scoe3，其為NCBI蛋白登錄號為CAB88833.1GI7635996的公知分泌性蛋白[天藍色鏈霉菌A3(2)]；圖22顯示Scoe4的氨基酸序列(SEQIDNo.26)，所述Scoe4是NCBI蛋白登錄號為CAB89450.1GI7672261的公知分泌性蛋白[天藍色鏈霉菌A3(2)]；圖23顯示如SEQIDNo.27所示核苷酸序列，該核苷酸序列編碼Scoe4，其為NCBI蛋白質(zhì)登錄號CAB89450.1GI7672261的公知分泌性蛋白[天藍色鏈霉菌A3(2)]；圖24顯示Scoe5的氨基酸序列(SEQIDNo.28)，Scoe5為NCBI蛋白質(zhì)登錄號CAB62724.1GI6562793的公知脂蛋白[天藍色鏈霉菌A3(2)]；圖25顯示如SEQIDNo.29所示的核苷酸序列，其編碼Scoe5，Scoe5為NCBI蛋白質(zhì)登錄號CAB62724.1GI6562793的公知脂蛋白[天藍色鏈霉菌A3(2)]；圖26顯示Srim1的氨基酸序列(SEQIDNo.30)，Srim1為NCBI蛋白質(zhì)登錄號為AAK84028.1GI15082088的GDSL-脂酶[龜裂鏈霉菌(streptomycesrimosus)]；圖27顯示SEQIDNo.31所示的核苷酸序列，其編碼Srim1，Srim1為NCBI蛋白登錄號為AAK84028.1GI15082088的GDSL-脂肪酶[龜裂鏈霉菌]；圖28顯示從嗜水氣單胞菌(ATCC#7965)獲得的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列(SEQIDNo.32)；圖29顯示編碼從嗜水氣單胞菌(ATCC#7965)獲得的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列(SEQIDNo.33)；圖30顯示從殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種(Aeronionassalmonicidasubsp.Salmonicida)(ATCC#14174)獲得的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的氨基酸序列(SEQIDNo.34)；圖31顯示編碼從殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種(ATCC#14174)獲得的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列(SEQIDNo.35)；圖32顯示氣單胞菌屬基因的同源物可使用國家生物技術(shù)信息中心(theNationalCenterforBiotechnologyInformation)，NIH，MD，USA的基礎(chǔ)局部序列比對檢索工具服務(wù)(basiclocalalignmentsearchtoolservice)和完整基因組數(shù)據(jù)庫得以鑒定。用GDSX基序作數(shù)據(jù)庫搜索，而且鑒定了潛在編碼具有脂解活性的酶的許多序列/基因。已從鏈霉菌屬，黃單胞菌屬和雷爾氏菌屬(Ralstonia)中鑒定了基因。如下面的例子，青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)與殺鮭氣單胞菌(satA)基因作比對。成對比對表現(xiàn)出23％的同一性?；钚晕稽c絲氨酸出現(xiàn)在氨基端，且可以鑒定催化性殘基組氨酸和天冬氨酸。圖33顯示Pfam00657.11[家族00657，數(shù)據(jù)庫版本11]共有序列(此后稱作Pfam共有序列)以及不同序列與Pfam共有序列的比對。箭頭表示活性位點殘基，加下劃線的框(boxes)表示三種已由[UptonCandBuckleyJT(1995)TrendsBiochemSci20；179-179]標明的同源框。Pfam共有序列中的大寫字母表示在許多家族成員中保守的殘基。“-”標記表示預(yù)期在Pfam共有序列的隱藏Markov模型中發(fā)現(xiàn)殘基而沒有發(fā)現(xiàn)殘基，因而有缺口被插入的位點?！?”標記表示在Pfam共有序列中沒有對應(yīng)殘基的殘基。這些序列是在圖16、18、20、22、24、26、28和30中列出的氨基酸序列。圖34顯示Pfam00657.11[家族00657，數(shù)據(jù)庫版本11]共有序列(此后稱作Pfam序列)，以及不同序列與Pfam共有序列的比對。箭頭表示活性位點殘基，加下劃線的框表示三種已由[UptonCandBuckleyJT(1995)TrendsBiochemSci20；179-179]標明的同源框。Pfam共有序列中的大寫字母表示在許多家族成員中保守的殘基?！?”標記表示預(yù)期在Pfam共有序列的隱藏Markov模型中發(fā)現(xiàn)殘基而沒有發(fā)現(xiàn)殘基，因而有缺口被插入的位點。“.”標記表示在Pfam共有序列中沒有對應(yīng)殘基的殘基。這些序列是在圖2、16、18、20、26、28和30中列出的氨基酸序列。這些蛋白質(zhì)都對脂質(zhì)底物具有活性。圖35顯示包含羧基末端組氨酸標記的殺鮭氣單胞菌脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶基因的表達載體pet12-AsalGCAT-pSM；圖36顯示用NEFA試劑盒測定法檢測細胞提取物的結(jié)果，結(jié)果描述了重組殺鮭氣單胞菌脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶對卵磷脂的活性。從左至右的孔表示的是陽性對照，陰性對照(即空質(zhì)粒提取物)和IPTG誘導(dǎo)后保溫0、1、2和3小時收集的樣本。圖37顯示含表達載體pet12-AsalGCAT＝pSM的BL21(DE3)pLysS的生長優(yōu)化，其顯示在30℃培養(yǎng)生成了對卵磷脂有高活性的酶。用NEFA試劑盒測定法來檢測細胞提取物的磷脂酶活性。從左至右的孔表示的是陽性對照；陰性對照；20℃；30℃；圖38顯示與底物卵磷脂一同保溫的、表達活性脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的BL21(DE3)pLysS的細胞粗提取物，反應(yīng)混合物通過薄層色譜法分析，顯示降解產(chǎn)物的存在。泳道1.無酶；2.+A.sal-10μl37℃；3.+A.sal-20μl37℃；4.+A.sal-10μl24℃；5.+A.sal-20μl24℃；圖39所示為殺鮭氣單胞菌?；D(zhuǎn)移酶的部分純化，其顯示了與純化的組氨酸標記蛋白相關(guān)的磷脂酶活性。SE＝超聲提取物，His＝用Qiagen的Ni-NTA離心-試劑盒(spin-kit)純化；圖40顯示包含C-末端組氨酸標記的嗜水氣單胞菌甘油脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶(GlycerolipidAcylTransferase)(GCAT)基因的表達載體pet12-A.h.GCAT＝pSMa，被用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS；圖41顯示使用Non-EsterifiedFattyAcid(NEFA)試劑盒(Roche，瑞士)，測定含有重組嗜水氣單胞菌GCAT酶的粗提物(5&10μl)對卵磷脂的活性，顯示存在對磷脂，卵磷脂有活性的酶；圖42顯示含有表達載體pet12-AsalGCAT＝pSM的BL21(DE3)pLysS的生長優(yōu)化，顯示在30℃培養(yǎng)生成了對卵磷脂有高活性的酶。用NEFA試劑盒測定法來檢測細胞提取物的磷脂酶活性。圖43顯示嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌的?；D(zhuǎn)移酶的部分純化，其顯示了與純化的組氨酸標記蛋白相關(guān)的磷脂酶活性。SE＝超聲提取物，His＝用Qiagen的Ni-NTA自旋-試劑盒純化；圖44顯示了氣單胞菌屬基因在枯草芽孢桿菌163中的表達，其顯示產(chǎn)生了對卵磷脂和DGDG均具有活性的分泌的酶。pUB-AH為包含嗜水氣單胞菌基因的構(gòu)建體，pUB-AS為帶有殺鮭氣單胞菌基因的構(gòu)建體，培養(yǎng)物濾出液與底物保溫60分鐘。圖45與圖46顯示在展開劑IV中的薄層色譜板(氯仿∶甲醇∶水(65∶25∶4))；泳道140mg谷甾醇30分鐘；泳道2轉(zhuǎn)移酶+40mg谷甾醇30分鐘；泳道3轉(zhuǎn)移酶+80mg谷甾醇30分鐘；泳道4轉(zhuǎn)移酶+40mg谷甾醇120分鐘；泳道5轉(zhuǎn)移酶+80mg谷甾醇120分鐘；泳道6轉(zhuǎn)移酶+40mg谷甾醇300分鐘；泳道740mg谷甾醇300分鐘；泳道8膽固醇；泳道9谷甾醇；圖47描述了通過脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的催化作用，磷脂酰膽堿與膽固醇之間的反應(yīng)；圖48顯示對從酶處理或不經(jīng)酶處理的蛋黃中提取的脂質(zhì)進行薄層色譜分析，6)0.31PLU/g轉(zhuǎn)移酶#179，7)1.25PLU/g轉(zhuǎn)移酶#178-9，8)23.25PLU/g轉(zhuǎn)移酶#3108，9)對照；圖49顯示用酶處理或不經(jīng)酶處理的蛋黃生產(chǎn)的蛋黃醬檢測樣本5)轉(zhuǎn)移酶#179，0.31PLU/g，6)轉(zhuǎn)移酶#178-9，1.25PLU/g，7)磷脂酶#3108，23.3PLU/g，8)對照，水；圖50顯示用從嗜水氣單胞菌提取的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶處理的蛋黃脂質(zhì)的薄層色譜(在溶劑I中)。圖51顯示用從嗜水氣單胞菌提取的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶處理的蛋黃脂質(zhì)的薄層色譜(在溶劑IV中)。圖52顯示在一時程的轉(zhuǎn)移酶處理的蛋黃脂質(zhì)的薄層色譜分析。圖53顯示應(yīng)用脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶(Tranf#178-9)時脂肪酸和甾醇酯的產(chǎn)生量作為時間的函數(shù)，并與應(yīng)用對照的脂解酶、細毛嗜熱霉(Thermomyceslanuginosus)作比較。圖54顯示了在高含水量的蛋黃中的酶促反應(yīng)中表示為％轉(zhuǎn)移酶活性和水解活性的相對轉(zhuǎn)移酶活性，#1991(磷脂酶A2)和#2427(磷脂酶A1)是對照磷脂酶，#178是脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶；圖55顯示含水量對在高含水量的蛋黃中的轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)中測定的轉(zhuǎn)移酶#178的轉(zhuǎn)移酶活性的影響。圖56顯示在含水量高的蛋黃中的轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)中脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶(#178)的轉(zhuǎn)移酶活性作為反應(yīng)時間的函數(shù)。圖57和圖58所示的圖描述了脂肪酸和膽固醇酯作為時間的函數(shù)。這些圖描述了測定中通過氣液色譜分析法獲得的結(jié)果，該測定用緩沖液中的卵磷脂和膽固醇作為底物測定了脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶活性；圖59顯示溶劑I中的薄層色譜。經(jīng)來自于殺鮭氣單胞菌的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶#138處理的蛋黃(泳道1和2)，或用磷脂酶#2938(F)處理的蛋黃(泳道3)，或未經(jīng)過處理的蛋黃(泳道4)。圖60顯示溶劑IV中的薄層色譜。經(jīng)脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶#138處理的蛋黃(泳道1和2)，或用磷脂酶#2938處理的蛋黃(泳道3)，或未經(jīng)過處理的蛋黃(泳道4)。圖61顯示經(jīng)脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶#138處理的蛋黃(樣本1和2)，或用磷脂酶#2938處理的蛋黃(樣本3)，或未經(jīng)過處理的蛋黃(樣本4)。圖62顯示在100℃處理2小時后的食物乳劑。0)未處理的蛋黃，1)經(jīng)脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶#138處理210分鐘的蛋黃，3)經(jīng)對照磷脂酶#2938處理210分鐘的蛋黃；圖63顯示了薄層色譜板，它篩選了對植物甾醇和甘油的轉(zhuǎn)移酶活性。PC＝磷脂酰膽堿，LPC＝溶血磷脂酰膽堿，PE＝磷脂酰乙醇胺；monogl＝甘油單酯；圖64所示溶劑I中的薄層色譜板，樣本1到6是反應(yīng)24小時后，樣本1到4是反應(yīng)4小時后。薄層色譜分析證實在樣本1、2、5和6中形成了甾醇酯。圖65所示溶劑I中的薄層色譜板，來源于殺鮭氣單胞菌的固定化的?；D(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)移酶活性在與0.5、1、3、6和24小時取出的樣本的油性混合物中檢測到。圖66與圖67所示溶劑I和IV中的薄層色譜板泳道1＝卵磷脂；泳道2＝對照，10分鐘；泳道3＝0.75PLU，10分鐘；泳道4＝0.75PLU，60分鐘；泳道5＝0.75PLU，220分鐘；泳道6＝對照，20小時；泳道7＝0.75PLU，20小時；泳道8＝膽固醇酯；圖68與圖69所示在溶液IV中的薄層色譜板泳道1＝卵磷脂；泳道2＝對照，10分鐘；泳道3＝1PLU，10分鐘；泳道4＝1PLU，60分鐘；泳道5＝1PLU，180分鐘；泳道6＝1PLU，220分鐘；泳道7＝1PLU，1200分鐘；泳道8＝對照，1200分鐘；泳道9＝葡萄糖酯；泳道10＝膽固醇；泳道11＝葡萄糖；圖70顯示在脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶催化下DGDG與葡萄糖的反應(yīng)。圖71顯示在例17中用于誘變嗜水氣單胞菌脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶基因的融合構(gòu)建體的氨基酸序列(SEQIDNo.36)，加下劃線的氨基酸是木聚糖酶信號肽；圖72顯示編碼來源于嗜水氣單胞菌的含木聚糖酶信號肽的酶的核苷酸序列(SEQIDNo.45)；并且圖73所示薄層色譜板清晰地顯示植物甾醇酯和甘油單酯的生成。泳道1是反應(yīng)1小時后，泳道2是反應(yīng)4小時后，泳道3是反應(yīng)24小時后，并且泳道4是植物固醇。實施例除了所指出的，按照實施例6中的描述實施TLC分析，并在實施例11中的描述實施GLC分析。實施例1來源于殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種(Aeromonassalmonicidasubsp.Salmonicida)的轉(zhuǎn)移酶的克隆，序列測定和異源性表達。所用的菌株殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種(ATCC14174)獲自ATCC，在30℃、Luria-Bertani培養(yǎng)基(LB)中生長過夜。對所述細胞進行離心并用QiagenLtd.的基因組DNA分離方法分離基因組DNA?；蚪MDNA緩沖液組(cat.19060)，蛋白激酶K(cat.19131)和RNAseA(cat.19101)均獲自于Qiagen.Ltd(BoundarycourtGatwickCourt，WestSussex，RH102AX)。宿主菌株BL21(DE3)pLysS(Novagen)用于產(chǎn)生重組氣單胞菌屬酶。BL21(DE3)pLysS的感受態(tài)細胞作為用表達載體pet12-AsalGCAT＝pSM轉(zhuǎn)化的宿主。包含適宜質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體在37℃、含有100-μg氨芐西林每毫升的LB瓊脂培養(yǎng)基中生長。表達載體pet12-AsalGCAT-pSM的構(gòu)建對于來自氣單胞菌屬的轉(zhuǎn)移酶基因的所有DNA擴增，以基因組DNA(0.2-1μl)作為模板，pfuDNA聚合酶(2.5單位)與10μl10xpfu緩沖液，均為1μl的每一種引物(50pmol/μl)，200μMdNTP在100μl的總反應(yīng)容積中一起使用。PCR反應(yīng)在可程控的熱循環(huán)儀中利用如下條件進行95℃維持30秒，以95℃30秒、60℃1分鐘、68℃2分鐘循環(huán)30次。72℃再延伸5分鐘。來自殺鮭氣單胞菌的轉(zhuǎn)移酶基因的PCR擴增通過兩個分離的PCR反應(yīng)進行。PCR反應(yīng)1使用以下引物對實施as1USNEW(5′AGCATATGAAAAAATGGTTTGTTTGTTTATTGGGG3′[SEQIDNo.36])和asls950new(5′GTGATGGTGGGCGAGGAACTCGTACTG3′[SEQIDNo.37])。實施第二次PCR反應(yīng)以摻入C-末端組氨酸標記，所述反應(yīng)使用第一次反應(yīng)的PCR產(chǎn)物以及以下引物進行as1USNEW(5′AGCATATGAAAAAATGGTTTGTTTGTTTATTGGGG3′[SEQIDNo.38])和AHLS1001(5′TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATGGTGATGGTGGGC3′[SEQIDNo.39])。純化第二次反應(yīng)的PCR產(chǎn)物并利用限制性內(nèi)切酶Ndel和BamHI消化。2μgpET12a載體DNA同樣經(jīng)限制性內(nèi)切酶Ndel和BamHI消化并用磷酸酶處理。限制性內(nèi)切酶處理的pET12a與反應(yīng)2的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化，用快速連接試劑盒(RapidLigationKit)(Roche，Switzerland)連接。連接混合物用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10細胞。轉(zhuǎn)化體鋪在含有100μg/ml氨芐西林的LB瓊脂培養(yǎng)基上。T7啟動子引物(5′TAATACGACTCACTATAG3′[SEQIDNo.40])和T7終止子引物(5′CTAGTTATTGCTCAGCGG3′[SEQIDNo.41])用于驗證pET12a載體中所克隆的轉(zhuǎn)移酶基因的序列和方向。用ABIBigDyeTM終止子循環(huán)測序試劑盒(TerminatorsCyclesequencingkit)，以500ng質(zhì)粒DNA作為模板，以及3.2pmolT7啟動子和終止子引物實施DNA序列測定。圖35所示構(gòu)建體用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌宿主菌株BL21(DE3)pLysS(Novagen)并且可選出氨芐西林抗性轉(zhuǎn)化體用于表達分析。重組殺鮭氣單胞菌脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的表達用非酯化的脂肪酸(Non-EsterifiedFattyAcid)(NEFA)試劑盒(Roche，Switzerland)在細胞提取物中定量對于卵磷脂的酶活性。在圖36中，包含表達載體pet12-AsalGCAT-pSM的BL21(DE3)pLysS在LB培養(yǎng)基+100μg/ml氨芐西林中生長，37℃振蕩保溫，直到OD600＝0.6到1.0。用IPTG(0.4mM)誘導(dǎo)所述培養(yǎng)物，再保溫3小時。IPTG誘導(dǎo)0、1、2和3小時后取樣品。以卵磷脂作為底物用NEFA試劑盒檢測酶活性。用于制備活性更強的酶的生長優(yōu)化包含表達載體pet12-AsalGCAT-pSM的BL21(DE3)pLysS在LB培養(yǎng)基+100μg/ml氨芐西林中生長，在不同生長溫度(37℃、30℃、20℃)、振蕩條件下保溫。產(chǎn)生活性脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的最適條件是當如圖37所示培養(yǎng)物在30℃生長時。重組殺鮭氣單胞菌轉(zhuǎn)移酶的部分純化包含表達載體pet12-AsalGCAT-pSM的菌株BL21(DE3)pLysS在37℃生長，通過超聲處理(sonification)制備細胞粗提物。重組體酶用Qiagen的Ni-NTA自旋(spin)試劑盒從經(jīng)超聲處理的細胞粗提物進一步純化。使用NEFA試劑盒且以卵磷脂作為底物測定磷脂酶活性。來自表達活性轉(zhuǎn)移酶的BL21(DE3)pLysS的細胞粗提物與底物卵磷脂一同保溫，用薄層色譜法分析反應(yīng)混合物，顯示降解產(chǎn)物的存在(參見圖38)。重組殺鮭氣單胞菌轉(zhuǎn)移酶的部分純化包含表達載體pet12-AsalGCAT-pSM的菌株BL21(DE3)pLysS在37℃生長，通過超聲處理制備細胞粗提物。重組酶用Qiagen的Ni-NTA自旋試劑盒從經(jīng)超聲處理后的細胞粗提物進一步純化。使用NEFA試劑盒且以卵磷脂作為底物測定磷脂酶活性(參見圖39).實施例2嗜水氣單胞菌轉(zhuǎn)移酶在大腸桿菌中的克隆與表達從ATCC獲得的嗜水氣單胞菌(ATCC#7965)，30℃、Luria-Bertani培養(yǎng)基(LB)中保溫過夜。離心細胞并用QiagenLtd.的基因組DNA分離方法分離基因組DNA(genomicDNA)?；蚪MDNA緩沖液組(cat.19060)，蛋白激酶K(cat.19131)和RNAseA(cat.19101)均來自于QiagenLtd.(BoundarycourtGatwickCourt，WestSussex，RH102AX)。宿主細菌菌株BL21(DE3)pLysS(Novagen)用于制備重組氣單胞菌屬酶。BL21(DE3)pLysS的感受態(tài)細胞作為用表達載體pet12a-A.h.GCAT-pSMa轉(zhuǎn)化的宿主。包含適宜質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體在含有100-μg氨芐西林每毫升的LB瓊脂培養(yǎng)基中、于37℃生長。表達載體pet12a-A.h.GCAT-pSMa的構(gòu)建對于來自氣單胞菌屬的轉(zhuǎn)移酶基因的所有DNA擴增，以基因組DNA(0.2-1μl)作為模板，pfuDNA聚合酶(2.5單位)與10μl10xpfu緩沖液，均為1μl的每一種引物(50pmol/μl)，200μMdNTP在100μl的總反應(yīng)容積中一起使用。PCR反應(yīng)在可程控的熱循環(huán)儀中利用如下條件進行95℃維持30秒，以95℃30秒、60℃1分鐘、68℃2分鐘循環(huán)30次。72℃再延伸5分鐘。來自嗜水氣單胞菌(ATCC#7965)的轉(zhuǎn)移酶基因的PCR擴增通過兩個分離的PCR反應(yīng)進行。PCR反應(yīng)1使用以下引物對進行AHUS1(5′GTCATATGAAAAAATGGTTTGTGTGTTTATTGGGATTGGTC3′，SEQIDNo.42)和ahls950(5′ATGGTGATGGTGGGCGAGGAACTCGTACTG3′，SEQIDNo.43)。實施第二次PCR反應(yīng)以摻入C-末端組氨酸標記，所述反應(yīng)使用第一次反應(yīng)的PCR產(chǎn)物以及以下引物進行AHUS1(5′GTCATATGAAAAAATGGTTTGTGTGTTTATTGGGATTGGTC3′SEQIDNo.44，)和AHLS1001(5′TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATGGTGATGGTGGGC3′SEQIDNo.45)。純化第二次反應(yīng)的PCR產(chǎn)物并利用限制性內(nèi)切酶Ndel和BamHI消化。2μgpET12a載體DNA同樣經(jīng)限制性內(nèi)切酶Ndel和BamHI消化并用磷酸酶處理。限制性內(nèi)切酶處理的pET12a與反應(yīng)2的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化，用快速連接試劑盒(RapidLigationKit)(Roche，Switzerland)連接。連接混合物用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10細胞。將轉(zhuǎn)化體鋪在含有100μg/ml氨芐西林的LB瓊脂培養(yǎng)基上。T7啟動子引物(5′TAATACGACTCACTATAG3′)和T7終止子引物(5′CTAGTTATTGCTCAGCGG3′)用于驗證pET12a載體中所克隆GCAT的序列和方向。用ABIBigDyeTM終止子循環(huán)測序試劑盒(TerminatorsCyclesequencingkit)，以500ng質(zhì)粒DNA作為模板，以及3.2pmolT7啟動子和終止子引物實施DNA序列測定。圖40所示構(gòu)建體用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌宿主菌株BL21(DE3)pLysS(Novagen)，并且可選出氨芐西林抗性轉(zhuǎn)化體用于表達分析。嗜水氣單胞菌轉(zhuǎn)移酶在BL21(DE3)pLysS中的表達包含表達載體pet12a-A.h.GCAT＝pSMa的大腸桿菌菌株BL21(DE3)plysS在LB培養(yǎng)基+100μg/ml氨芐西林中生長，37℃振蕩保溫，直到OD600＝0.6到1.0。用IPTG(0.4mM)誘導(dǎo)所述培養(yǎng)物，再保溫3小時。IPTG誘導(dǎo)0、1、2和3小時后取樣品。以卵磷脂作為底物用NEFA試劑盒檢測酶活性(圖41)。用于制備活性更強的酶的生長優(yōu)化包含表達載體pet12a-A.h.GCAT-pSMa的BL21(DE3)pLysS在LB培養(yǎng)基+100μg/ml氨芐西林中生長，在不同生長溫度(37℃、30℃、20℃)、振蕩條件下保溫。產(chǎn)生活性脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的最適條件是當如圖42所示培養(yǎng)物在30℃生長時。重組嗜水氣單胞菌轉(zhuǎn)移酶(GCAT)的部分純化包含表達載體pet12a-A.h.GCAT-pSMa的菌株BL21(DE3)pLysS在37℃生長，通過超聲處理制備細胞粗提物。重組體酶用Qiagen的Ni-NTA自旋(spin)試劑盒從經(jīng)超聲處理的細胞粗提物進一步純化。使用NEFA試劑盒且以卵磷脂作為底物測定磷脂酶活性(圖43)。實施例3氣單胞菌屬轉(zhuǎn)移酶在枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)163中的表達質(zhì)粒構(gòu)建兩種不同的枯草芽孢桿菌表達載體(pUB110&pBE5)用于氣單胞菌屬基因在枯草芽孢桿菌的異源表達。pUB110載體包含α淀粉酶啟動子而pBE載體含有作為融合的氣單胞菌屬基因的表達調(diào)節(jié)區(qū)的P32啟動子。在pUB110中，氣單胞菌屬成熟GCAT基因的第一個氨基酸與枯草芽孢桿菌的木聚糖酶信號肽的最后一個氨基酸通過在限制酶切位點Nhe1在框內(nèi)融合，在成熟蛋白之前產(chǎn)生兩個額外的氨基酸。pBE5含有在Nco1位點融合的cgtase信號序列，使重組蛋白質(zhì)分泌入培養(yǎng)過濾物。實施PCR反應(yīng)獲得與pUB110和pBE5載體的信號序列框內(nèi)融合的氣單胞菌屬基因。用下列的配對引物對嗜水氣單胞菌基因進行PCR。PCR反應(yīng)1usAHncol(5′ATGCCATGGCCGACAGCCGTCCCGCC3′，SEQIDNo.46)和lsAH(5′TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3′，SEQIDNo.47)PCR反應(yīng)2US-AhnheI(5′TTGCTAGCGCCGACAGCCGTCCCGCC3′，SEQIDNo.48.)和lsAH(5′TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3，SEQIDNo.49)用下列配對引物對殺鮭氣單胞菌基因進行PCR。PCR反應(yīng)3US-Asncol(5′TTGCCATGGCCGACACTCGCCCCGCC3′，SEQIDNo.50)和lsAH(5′TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3′，SEQIDNo.51)PCR反應(yīng)4US-ASnhel(5′TTGCTAGCGCCGACACTCGCCCCGCC3′，SEQIDNo.52)和lsAH(5′TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3′，SEQIDNo.53)全部PCR產(chǎn)物克隆到PCRbluntII(TOPO載體)中并用反向或正向測序引物測序。來自PCR反應(yīng)1和3的克隆用Nco1和BamHI切割，作為插入物與Nco1/BamHl/磷酸酶切割的pBE5載體連接。來自PCR反應(yīng)2和4的克隆用Nhe1和BamHl切割，作為插入物與Nhe1/BamHl/磷酸酶切割的pUB載體連接?？莶菅挎邨U菌中氣單胞菌屬轉(zhuǎn)移酶基因的表達與所述酶的活性表征。來自兩種氣單胞菌種的?；D(zhuǎn)移酶已成功地在大腸桿菌中表達(結(jié)果如上)。芽孢桿菌pUB110和pBE5基因融合構(gòu)建體用來轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，并通過鋪在卡那霉素板上選擇轉(zhuǎn)化株。經(jīng)分離并在2xYT中生長的卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化體能在枯草芽孢桿菌中異源表達氣單胞菌基因。培養(yǎng)過濾物除具有酰基轉(zhuǎn)移酶與磷脂酶活性外，還具有二半乳糖基二酰甘油(digalactosyldiacylglycerol)(DGDG)半乳糖脂酶活性。針對二半乳糖基二酰甘油(DGDG)的活性在將上清液與底物保溫60分鐘后測定，來自小麥粉的DGDG(來自Sigma)以及針對卵磷脂的活性在圖44中顯示。芽孢桿菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜(20-24小時)至48小時以后作為分泌性蛋白產(chǎn)生。在一些情況中，氣單胞菌基因的表達影響芽孢桿菌和大腸桿菌中的細胞活力和生長，因此有必要仔細選擇表達菌株并優(yōu)化生長條件以確保表達。例如，數(shù)種芽孢桿菌宿主菌株(B.s163，DB104和OS21)用表達載體轉(zhuǎn)化用于生長比較。B.s163可由兩種氣單胞菌基因轉(zhuǎn)化并具有表達活性蛋白的能力。DB104可用所有構(gòu)建體轉(zhuǎn)化但只有表達殺鮭氣單胞菌轉(zhuǎn)移酶的能力。實施例4大腸桿菌中產(chǎn)生的氣單胞菌脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的發(fā)酵和純化大腸桿菌發(fā)酵微生物本研究中使用大腸桿菌的兩個菌株，一個包括嗜水氣單胞菌(實施2)脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶而另外的包括殺鮭氣單胞菌(實施例1)脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶。包含嗜水氣單胞菌基因的大腸桿菌菌株命名為DIDK0124，包含殺鮭氣單胞菌基因的大腸桿菌菌株命名為DIDK0125。DIDK0124的發(fā)酵物命名為HYDRO0303并且DIDK0125的發(fā)酵物命名為SAL0302。從HYDRO025純化的蛋白質(zhì)命名為REF#138。從HYDRO0303純化的蛋白命名為REF#135。生長培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件LB-瓊脂用于維持菌株的LB-瓊脂板包括10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取液，5g/LNaCl，15g/L瓊脂，100mg/L氨芐西林和35mg/L氯霉素。瓊脂板在30℃保溫。LB搖瓶用于產(chǎn)生生物反應(yīng)物培養(yǎng)用接種物原料的LB培養(yǎng)基(50mLpr搖瓶)包括10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/LNaCl，100mg/L氨芐西林(ampicillin)和35mg/L氯霉素(chloramphenicol)。搖瓶用LB瓊脂板培養(yǎng)物接種，30℃、200rpm保溫。生物反應(yīng)物的培養(yǎng)生物反應(yīng)物培養(yǎng)在6L內(nèi)部建造的(in-built)生物反應(yīng)器中進行，所述生物反應(yīng)器中充滿含有以下物質(zhì)的4L培養(yǎng)基10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取液、5g/LNaCl、8g/LKH2PO4、0.9g/LMgSO4，7H2O、40g/L葡萄糖一水合物、0.4mL/ADDFoamstopSin260(ADDAPTChemicalsAG，Helmond，TheNetherlands)、10mg/L(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O、0.7mg/LCuSO4·5H2O、3mg/LZnSO4·7H2O、3mg/LMnSO4·H2O、10mg/LEDTA、0.1mg/LNiSO4·6H2O、0.1mg/LCoCl2、0.1mg/LH3BO4、0.1mg/LKI、0.1mg/LNa2MoO4·2H2O、1g/L氨芐西林和35mg/L氯霉素。在生物反應(yīng)器中接種一定量的LB培養(yǎng)基確保在大約20小時培養(yǎng)后的生長終點(通過以下參數(shù)計算最大比生長速率0.6h-1，LB搖瓶的OD600和生物反應(yīng)器終末OD600，其為大約20)。SAL0302接種了10mL的LB培養(yǎng)基，而HYDR00303接種了4mL的LB培養(yǎng)基。生物反應(yīng)器在下列條件下操作溫度30℃，攪拌800-1000rpm(依照實驗)，通氣5L/min，pH6.9，pH控制8.75％(w/v)NH3-水和2MH2SO4。添加異丙基β-D-硫半乳糖苷(thiogalactoside)至終末濃度0.6mM，誘導(dǎo)完成，分別產(chǎn)生0.4摩爾(HYDR00303)和0.7摩爾CO2。收獲以下操作步驟用于生物質(zhì)的收獲與勻漿1)來自發(fā)酵的發(fā)酵肉湯在5000×g離心，4℃放置10分鐘，棄去上清液。所述生物質(zhì)用前-20℃放置保存。融化所述生物質(zhì)并在500mL20mMNaH2PO4，pH7.4，500mMNaCl，10mM咪唑和完全(無EDTA)蛋白酶抑制劑(Roche，Germany)中重懸。2)懸浮的生物質(zhì)在2kbar，4℃，在來自ConstantSystems公司(Warwick，UK)的細胞破裂儀(celldisrupter)中勻漿。3)細胞碎片在10.000×g離心去除，4℃放置30分鐘，收集上清液。4)使上清液在13.700×g離心而澄清化，4℃放置60分鐘，收集上清。5)所述上清液通過0.2μmVacCap過濾器(PallLifeSciences，UK)過濾，收集濾出液立即層析純化。轉(zhuǎn)移酶的層析純化用50ml螯合型瓊脂糖ff.凝膠填充柱(2.5×10cm)，并用鎳-硫酸鹽裝料(chargedwith)(根據(jù)生產(chǎn)商AmershamBiosciences所述方法)。以200ml20mMNaH2PO4，pH7.4，500mMNaCl，10mM咪唑平衡柱，將400ml粗提物以5ml/min的流速加樣于柱。用20mMNaH2PO4，pH7.4，500mMNaCl，10mM咪唑洗柱直到UV280達到基線，然后用40ml20mMNaH2PO4，pH7.4，500mMNaCl，500mM咪唑洗脫GCAT。實施例5枯草芽孢桿菌中產(chǎn)生的氣單胞菌脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的發(fā)酵與純化發(fā)酵BAC0318-19，BAC0323-24微生物本研究中所用的微生物來源于含有插入pUB110OIS載體中、編碼殺鮭氣單胞菌轉(zhuǎn)移酶的基因的質(zhì)粒對枯草芽孢桿菌宿主菌株#163的轉(zhuǎn)化。該基因的表達受α淀粉酶啟動子控制，轉(zhuǎn)移酶的分泌由枯草芽孢桿菌木聚糖酶信號序列介導(dǎo)(實施例3)。菌株命名為DIDK0138(發(fā)酵BAC0318-19)和DIDK0153(發(fā)酵BAC0323-24)。生長培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件預(yù)培養(yǎng)基搖瓶(總?cè)莘e500mL，有隔板)中加入100mL培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包括NaCl5g/LK2HPO410g/L大豆粉20g/L酵母提取物，BioSpringer10620g/L消泡劑，SIN2605mL/L高壓滅菌前pH調(diào)整到7.0高壓滅菌后向每個搖瓶中添加6mL50％(w/w)Nutriose。并且在高壓滅菌后添加濃度50mg/L的卡那霉素。接種預(yù)培養(yǎng)搖瓶用直接來自25％(w/v)甘油儲存液的冰凍培養(yǎng)物接種。搖瓶在33℃、175rpm保溫大約16小時，取50mL接種發(fā)酵罐。發(fā)酵發(fā)酵在6L內(nèi)部建造的發(fā)酵罐中進行。成批發(fā)酵培養(yǎng)基(batchmedium)(3L)包括玉米漿(50％dw)40g/L酵母提取物BioSpringer153(50％dw)10g/LNaCl5g/LCaCl2，2H2O0.25g/LMn(NO3)2，H2O0.2g/L消泡劑SIN2601mL/L卡那霉素(經(jīng)濾過滅菌處理后加入高壓滅菌的發(fā)酵罐)50mg/L進料(feed)包括葡萄糖一水合物540g/kgMgSO4，7H2O4.8g/kg消泡劑SIN2604mL/kg酵母提取物，BioSpringer153(50％dw)150g/kg(分別高壓滅菌)根據(jù)下列方程式，發(fā)酵BAC0318和BAC0323中的進料基于蓄積的CO2開始進料率-流率(flow)[g/h]＝0，AcCO2＜0.15進料率-流率[g/h]＝2.85+t·1.54，AcCO2≥0.15和t＜12進料率-流率[g/h]＝21.3，t＞12t從蓄積的CO2(AcCO2)達到0.15摩爾的點開始的時間(小時)。根據(jù)下列方程式，發(fā)酵BAC0319和BAC0324中的進料基于蓄積的CO2開始進料率-流率[g/h]＝0，AcCO2＜0.15進料率-流率[g/h]＝2.0+t·1.08，AcCO2≥0.15和t＜12進料率-流率[g/h]＝15，t＞12t從蓄積的CO2(AcCO2)達到0.15摩爾的點開始的時間(小時)。加入12.5％(w/v)氨水或2M磷酸使pH值控制在7.0。通氣量為3L/min對應(yīng)1vvm。溫度33℃。發(fā)酵罐配備有相距10cm的兩個8cmRushton推進器(impeller)。收獲在室溫16,000×g離心10分鐘，去除生物質(zhì)。上清液經(jīng)過濾滅菌，濾出液用于純化和應(yīng)用試驗。實施例6蛋黃中的應(yīng)用試驗在如下實驗中，在大腸桿菌中表達的、分離自殺鮭氣單胞菌的轉(zhuǎn)移酶僅在蛋黃中以及添加了植物固醇的蛋黃中檢出。材料來自殺鮭氣單胞菌REF#138的轉(zhuǎn)移酶蛋黃來自新鮮卵(母雞雞蛋)植物固醇β-谷甾醇，SigmaS5753TLC板二氧化硅板Mercknr.1.05715.0001TLC分析TLC-板在加熱箱(110℃)中放置半小時，使之活化將100ml展開劑倒入加蓋的層析小室。小室的壁覆有濾紙(Whatman2)使該小室被展開劑蒸汽飽和。TLC板放于支架中，并將樣品加到距底部2cm的TLC板上。將TLC板放入有展開劑的TLC小室中。當展開劑距離板底部14cm時，取出TLC板，置于蒸發(fā)板(fumeboard)上干燥，然后置于加熱箱(heatboard)(110℃)中10分鐘。接著使TLC板浸入展開試劑中，在加熱箱(110℃)中干燥15分鐘。展開劑Nr.IV氯仿∶甲醇∶水(65∶25∶4)Nr.IP-醚∶MTBE∶乙酸(60∶40∶1)展開緩沖液(釩酸鹽-緩沖液)32gNa2CO3ad300mlH2O(1M)加入18.2g五氧化二釩(V2O5)微熱溶解。將溶液冷卻至環(huán)境溫度。小心加入460ml2.5MH2SO4.(460mlH2O+61mlH2SO4)加水至1000ml。磷脂酶活性底物0.6％L-α磷脂酰膽堿95％植物(Avanti#441601)+0.4％巛-X100(SigmaX-100)+5mMCaCl2被溶于pH7的0.05MHEPES緩沖液。步驟將400μl底物加到1.5mlEppendorf管，置于Eppendorf熱混合器(thermomixer)，30℃、5分鐘。時間T＝0時，加入50μl酶溶液。對含有水而不是酶的空白進行分析。以1000rpm在Eppendorf熱混合器上于30℃混合所述樣品10分鐘。時間T＝10分鐘時，將Eppendorf管置于另一熱混合器中，在99℃、10分鐘以結(jié)束反應(yīng)。樣品中游離脂肪酸使用WAKOGmbH的NEFA試劑盒分析。測定條件下，酶活性PLU-7pH7以每分鐘產(chǎn)生的微摩爾脂肪酸來計算。脂質(zhì)提取1g蛋黃和7.5ml氯仿∶甲醇2∶1在Whirley中混合，以750×g離心10分鐘。分離3ml氯仿相，用于進一步脂質(zhì)分析。結(jié)果以上述方法分析在大腸桿菌中表達的、來自殺鮭氣單胞菌的轉(zhuǎn)移酶(REF#138)的磷脂酶活性，并在有或沒有β-谷甾醇的蛋黃中檢測。反應(yīng)過程中所述樣品用磁力攪拌器攪拌。實驗設(shè)計如表1。表1加入7.5ml氯仿∶甲醇(2∶1)并在Whirley混合器上混合30秒終止反應(yīng)。離心分離氯仿相，將2μl的氯仿相轉(zhuǎn)移到預(yù)先活化的二氧化硅TLC板，TLC板用展開劑nr.I洗脫，另一TLC板在展開劑IV中洗脫。圖45和46顯示TLC分析結(jié)果。利用來自殺鮭氣單胞菌的轉(zhuǎn)移酶、在添加植物固醇的蛋黃中的轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)說明，該酶在膽固醇酯形成過程將脂肪酸從蛋黃的卵磷脂轉(zhuǎn)移到膽固醇。TLC層析圖也表明加到蛋黃中的部分固醇被轉(zhuǎn)移到甾醇酯。在反應(yīng)過程中與所形成膽固醇酯的量有關(guān)的甾醇酯的量可用HPLC或GLC分析?，F(xiàn)已知植物甾醇酯可減少腸道對膽固醇的吸收。文獻中也表明腸道對膽固醇酯的吸收少于對游離膽固醇的吸收。當將轉(zhuǎn)移酶和植物固醇添加到蛋黃，可得到減少膽固醇吸收的產(chǎn)品，同時產(chǎn)生可改善蛋黃乳化性質(zhì)的溶血卵磷脂。在蛋黃中添加轉(zhuǎn)移酶和植物固醇的更進一步的優(yōu)勢在于植物甾醇酯與天然獲得的膽固醇一同被攝入，預(yù)期這具有使膽固醇吸收減少最大效應(yīng)。實施例7來自殺鮭氣單胞菌的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶對蛋黃的修飾依照本發(fā)明，現(xiàn)已表明使用轉(zhuǎn)移酶有可能從蛋黃中產(chǎn)生溶血卵磷脂而基本上不形成脂肪酸。蛋黃中的卵磷脂含量是制備蛋黃醬的一種重要的乳化劑，但局限在于所得蛋黃醬對熱不穩(wěn)定。因此幾年來人們已知可使用胰腺得來的磷脂酶將蛋黃的卵磷脂修飾為一種更強的乳化劑即溶血卵磷脂。在蛋黃醬生產(chǎn)過程中用酶修飾的蛋黃有助于改善在巴氏滅菌時蛋黃醬的熱穩(wěn)定性。在蛋黃中使用胰磷脂酶的局限性在于游離脂肪酸數(shù)量也增多，這導(dǎo)致抗氧化能力的下降，因為游離脂肪酸比其相應(yīng)酯更易于被氧化。游離脂肪酸也可能導(dǎo)致肥皂味道(soapy-offtaste)的出現(xiàn)。如實施例5所述，來自殺鮭氣單胞菌的轉(zhuǎn)移酶在枯草芽孢桿菌中成功表達并在實驗室范圍內(nèi)發(fā)酵，通過液相層析純化，用來修飾蛋黃脂質(zhì)。經(jīng)酶修飾的蛋黃用于熱穩(wěn)定蛋黃醬的生產(chǎn)。來自殺鮭氣單胞菌的轉(zhuǎn)移酶可在蛋黃中產(chǎn)生溶血卵磷脂和膽固醇酯而不產(chǎn)生大量游離脂肪酸。這就是說不增加或基本不增加食品中的游離脂肪酸。經(jīng)酶修飾的蛋黃顯示改善的乳化劑特性并可用于熱穩(wěn)定的生產(chǎn)。酶通過催化卵磷脂和膽固醇間的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移反應(yīng)(圖47)表現(xiàn)出對蛋黃修飾的高度功能性。該研究進一步研究了轉(zhuǎn)移酶在對蛋黃的修飾中的用途以及經(jīng)修飾的蛋黃在熱穩(wěn)定生產(chǎn)中的用途。本實施例描述了轉(zhuǎn)移酶的發(fā)酵，分離和在蛋黃中的應(yīng)用以及經(jīng)酶修飾的蛋黃在熱穩(wěn)定生產(chǎn)中的應(yīng)用。本實施例分成兩部分A.轉(zhuǎn)移酶在蛋黃中的應(yīng)用B.在蛋黃醬中檢測經(jīng)酶修飾的蛋黃實驗A.應(yīng)用酶與底物來自殺鮭氣單胞菌的轉(zhuǎn)移酶#178-9，純化2554-100C73，15PLU-7/ml來自殺鮭氣單胞菌的轉(zhuǎn)移酶#179，18.5PLU-7/ml磷脂酶A1LECITASETMMltra(NovozymesA/S，Denamrk)蛋黃含8％鹽的液態(tài)蛋黃，SANOVAFOODS，DKTLC分析按前述方法實施(見于前面實施例6)磷脂酶活性見前述實施例。脂質(zhì)提取1g蛋黃和7.5ml氯仿∶甲醇2∶1在Whirley中混合30秒，以750×g離心10分鐘。分離4ml氯仿相用于進一步脂質(zhì)分析。氧化穩(wěn)定性檢測蛋黃醬的氧化穩(wěn)定性在MLOXIPRESS儀器中測量，其中所述樣品通過在氧氣環(huán)境中、加壓條件下的加熱而經(jīng)受氧化應(yīng)激。經(jīng)過被稱作誘導(dǎo)期(IP)的一段時間以后，樣品的氧化導(dǎo)致一定的氧氣消耗，通過壓力傳感器記錄為壓力改變。誘導(dǎo)期越高表明氧化穩(wěn)定性越好。操作步驟5克蛋黃醬放于玻璃容器中且玻璃容器用壓力傳感器封閉。該容器充滿5巴(bar)氧氣。打開閥排空容器。本操作重復(fù)兩次并將樣品以及5巴氧氣的環(huán)境置于80℃。氧壓被測定為時間的函數(shù)且誘導(dǎo)期(IP)以小時計算。結(jié)果來自殺鮭氣單胞菌的經(jīng)純化的轉(zhuǎn)移酶樣品#179和#178-9用于處理蛋黃，如表2所示。初次檢測顯示，加入的GCAT轉(zhuǎn)移酶的磷脂酶(PLU)活性應(yīng)當以比商品磷脂酶的活性低得多。原因在于GCAT是轉(zhuǎn)移酶，因此具有比普通磷脂酶低的多的水解活性。表2按比例將蛋黃和酶放于燒杯中(scalingtheeggyolkandtheenzymeinabeaker)進行酶促反應(yīng)。樣品置于加熱箱中，37℃、慢速攪拌。反應(yīng)1，2和4小時后，取樣品做TLC分析。反應(yīng)4小時后，將所述產(chǎn)物保存在5℃以備蛋黃醬實驗使用。從經(jīng)酶處理的蛋黃提取的脂質(zhì)的TLC分析如圖48所示。圖48所示的TLC分析顯示磷脂酶#3108在形成游離脂肪酸過程中，對于甘油三酯還有一些甘油單酯和甘油二酯具有明顯的水解作用。磷脂酶#3108對膽固醇似乎無影響。兩轉(zhuǎn)移酶樣品都明顯地促成膽固醇酯的形成并伴有膽固醇含量的下降。D在蛋黃醬中的經(jīng)酶修飾的蛋黃為研究表2中提到的對蛋黃樣品修飾作用的效應(yīng)，以含50％脂肪的蛋黃醬進行應(yīng)用實驗。也產(chǎn)生含有未經(jīng)處理的蛋黃的蛋黃醬。研究目的是明確對經(jīng)酶修飾的蛋黃的乳化特性與熱穩(wěn)定性的影響。全部蛋黃醬樣品含有相同的油水平并只有蛋黃被乳化(emulsifiedwithonlyeggyolk)。全部蛋黃醬樣品用KoruMa調(diào)拌器(DishoV60/10)制備，制備過程中加熱至95℃維持5分鐘。由經(jīng)酶處理的蛋黃制備的蛋黃醬樣品(圖49)質(zhì)地細密均勻無油分離。對照樣品在油與水相中分離。由經(jīng)酶處理的蛋黃制備的蛋黃醬樣品中的油滴顆粒大小用MalvernMastersizer測量。測量前樣品與0.1％SDS在pH7的0.1M磷酸鹽緩沖液中混合。讀數(shù)是表3所示的所有顆粒的大小均值。表3顆粒大小測量結(jié)果清楚地顯示了來自殺鮭氣單胞菌的轉(zhuǎn)移酶劑量增加的效應(yīng)。使用大劑量的轉(zhuǎn)移酶，顆粒大小與用LecitaseMltra制備的蛋黃醬的顆粒近似。但是，應(yīng)謹記的是LecitaseMltra產(chǎn)生大量脂肪酸，促成細小顆粒的分布。利用酶所制備的蛋黃醬的油滴大小明顯小于沒有利用酶所制備的蛋黃醬(即對照蛋黃醬)的油滴大小。氧化穩(wěn)定性蛋黃醬樣品7和8的氧化穩(wěn)定性用MLOXIPRES分析，分析結(jié)果如表4所示。表4氧化穩(wěn)定性的測定說明抗氧化穩(wěn)定性有顯著性差異。轉(zhuǎn)移酶179-8處理的蛋黃制成的蛋黃醬比LecitaseMltra處理的蛋黃制成的蛋黃醬具有更好的抗氧化穩(wěn)定性。這是由于LecitaseMltra產(chǎn)生更多的游離脂肪酸，這些游離脂肪酸更易于被氧化成相應(yīng)的脂肪酸酯。用于蛋黃醬生產(chǎn)的蛋黃樣品用氯仿提取，蛋黃中的脂質(zhì)用GLC分析，結(jié)果見表5。表5表5中的GLC結(jié)果證實了TLC分析的結(jié)果，LecitaseMltra可產(chǎn)生非常大量的游離脂肪酸并且大部分的甘油三酯被水解。另一方面，轉(zhuǎn)移酶僅產(chǎn)生適量的游離脂肪酸且甘油三酯不被水解。同樣清楚地顯示轉(zhuǎn)移酶從膽固醇產(chǎn)生膽固醇酯。結(jié)果說明“經(jīng)酶處理的”蛋黃醬中的PC量少于對照蛋黃醬，同時經(jīng)酶處理的蛋黃醬的LPC量高于對照蛋黃醬。LPC量升高可以很好地解釋經(jīng)酶處理的蛋黃醬與對照蛋黃醬相比，前者乳化作用增強的原因。HPLC和GLC與也表明經(jīng)酶處理的蛋黃醬的游離膽固醇水平比對照蛋黃醬的游離膽固醇水平低，可能是由于在轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)中，膽固醇作為受體分子導(dǎo)致經(jīng)酶處理的蛋黃醬與對照蛋黃醬相比，前者有更多的膽固醇酯產(chǎn)生。另外，結(jié)果表明當用轉(zhuǎn)移酶處理蛋黃時游離脂肪酸不顯著性增加。結(jié)果進一步表明經(jīng)脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶處理的食品中的游離脂肪酸含量顯著低于用對照磷脂酶處理的食品中的游離脂肪酸含量，即使食品中溶血卵磷脂形成量一樣也是如此。實施例8殺鮭氣單胞菌轉(zhuǎn)移酶在蛋糕中的效應(yīng)在一蛋糕配方中檢測來自殺鮭氣單胞菌的GCAT?；D(zhuǎn)移酶的效應(yīng)。酶被單獨檢測并與其它脂解酶混合檢測。酶可加到一些蛋糕成分中或在混合蛋糕前與其它蛋糕成分一同加入。初步實驗說明，與對照相比，?；D(zhuǎn)移酶與甘油三酯水解酶結(jié)合可改善蛋糕體積與面團瓤(crumb)結(jié)構(gòu)。在如下實驗中，來自殺鮭氣單胞菌及變體的轉(zhuǎn)移酶可被單獨檢測或與甘油三酯水解酶聯(lián)合檢測。這些酶對雞蛋以及起酥油中的脂質(zhì)成分有活性，并對蛋糕配方組成部分即糖，蛋白質(zhì)，甘油和膽固醇(蛋中)有活性。材料與方法酶#179，來自殺鮭氣單胞菌的?；D(zhuǎn)移酶GrindamylEXEL16，脂酶來自細毛嗜熱霉蛋糕配方設(shè)備混合器帶鏟的HobartN50烤箱Simon蛋糕烤箱操作步驟所有成分控制在室溫。1.使糖和起酥油乳化(creamup)3分鐘-以第二速度開始，30秒內(nèi)調(diào)到第三速度2.添加剩余成分-以第一速度開始30秒內(nèi)調(diào)到第二速度-攪拌總共5分鐘。3.在1dl量杯中測定糊(batter)的體積4.用“Babette”油涂抹物(oilspread)噴灑(spray)磅蛋糕罐(poundcaketin)，并用紙覆蓋5.稱2×350g放入磅蛋糕罐6.用鏟均勻展開團塊7.放入烤箱之前-在蛋糕的頂部(蛋糕的中間沿縱長方向)加一行油-使蛋糕從中間斷開8.180℃烘烤50分鐘9.烘烤完后，將罐從烤箱取出，在蛋糕從罐取出之前把罐“掉落”到桌子上10.除去蛋糕上的紙并將正面朝上11.在稱重和測量體積之前，將蛋糕放在格子上冷卻60分鐘備注所用的酶在混合開始時加入，或在加入其它成分之前加到蛋糕的其它成分中。酶僅在蛋糕成分混合或反應(yīng)過程中有活性，在蛋糕烘烤過程中這些酶失活。結(jié)果以下實驗按下表所示進行根據(jù)上面提供配方，在雞蛋用于制作蛋糕之后，很快使雞蛋，葡萄糖漿和酶在37℃反應(yīng)30分鐘。初步結(jié)果說明?；D(zhuǎn)移酶與來自細毛嗜熱霉的甘油三酯水解酶與水對照物相比改善蛋糕體積、以及面團瓤結(jié)構(gòu)、口感和外觀。初步結(jié)果說明在蛋糕中將脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶和脂酶聯(lián)合使用很好。實施例9這些實驗的目的是檢測在大腸桿菌中表達的來自嗜水氣單胞菌的轉(zhuǎn)移酶在蛋黃中檢測嗜水氣單胞菌#135(0.5NEFA-PLU/ml)的轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)。實驗設(shè)計如表6所示。表6將蛋黃加熱至37℃，加入酶。反應(yīng)時間后加入7ml氯仿∶甲醇2∶1并在Whirley中混合30秒。樣品在800×g離心10分鐘，分離出較低的溶劑相。取2μl樣品加至TLC二氧化硅板上并用洗脫液IV洗脫。TLC分析結(jié)果如圖50、51所示。本實施例提及的材料與方法見于以上實施例詳細描述的材料與方法。本實驗的樣品作為TMS衍生物也經(jīng)GLC分析。GLC結(jié)果如表7所示。表7蛋黃脂質(zhì)的GLC從對游離脂肪酸，膽固醇和膽固醇酯的GLC分析，可以計算出每種成分摩爾濃度并計算出轉(zhuǎn)移酶活性百分比，如表7所示。轉(zhuǎn)移酶活性百分比計算依據(jù)結(jié)果，游離脂肪酸，甾醇酯的增加量如下計算Δ％脂肪酸＝％脂肪酸(酶)-％脂肪酸(對照)Δ％甾醇酯＝％甾醇酯/甾烷醇酯(酶)-％甾醇酯/甾烷醇酯(對照)轉(zhuǎn)移酶活性百分比是占總酶活性的百分比其中Mv甾醇酯＝甾醇酯平均分子量Mv脂肪酸＝脂肪酸平均分子量表8蛋黃中嗜水氣單胞菌#135的轉(zhuǎn)移酶活性TLC和GLC分析都證實最初嗜水氣單胞菌#135的轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)是主要反應(yīng)。反應(yīng)150分鐘后開始出現(xiàn)一些水解活性。1560分鐘后，轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)與水解反應(yīng)水平基本相當。結(jié)果還證實了只要有受體分子膽固醇可用，轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)就是主要反應(yīng)。當膽固醇濃度下降，水解活性就越來越主要。實施例10以蛋黃作為底物的轉(zhuǎn)移酶活性的測定實驗-下文成為“蛋黃測定法”脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶從殺鮭氣單胞菌分離并在枯草芽孢桿菌中表達。本次研究的目的是制定一種分析方法，這種方法可以測量酶的轉(zhuǎn)移酶活性和水解活性，通過這些分析，用包含卵磷脂和膽固醇的底物，使酶的轉(zhuǎn)移酶和水解活性的限定成為可能。由于蛋黃包含卵磷脂和膽固醇且已知轉(zhuǎn)移酶與磷脂酶對這種底物可充分地起作用，所以本研究將蛋黃作為酶測定的底物。使用蛋黃的缺點是這種底物是水、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的復(fù)雜混合物。脂質(zhì)成分包括甘油酯，66.2％；磷脂，29.6％；和膽固醇，4.2％。磷脂包括73％卵磷脂，15％腦磷脂，和12％其它磷脂。對于脂肪酸，33％是飽和脂肪酸和67％不飽和脂肪酸，包括42％油酸和7％亞油酸(ref.Kirk-OthmerEncyclopediaofChemicalTechnology，JohnWiley&Sons，Inc.)預(yù)期蛋黃成分有所改變。但文獻(BiochimicaetBiophysicaActa，1124(1992)205-222)中提到“盡管飲食與環(huán)境條件有很大改變，家養(yǎng)母雞的成熟蛋黃中的脂質(zhì)及脂蛋白成分非常恒定”，并進一步引證“結(jié)果，蛋黃持續(xù)提供組成基本穩(wěn)定的食品，這就可保持它的化學(xué)及物理化學(xué)特性從而可信地應(yīng)用于烘烤，化妝品和制藥工業(yè)中”。這篇文獻表明蛋黃組分非常穩(wěn)定，因此決定在蛋黃測定中用雞蛋黃作為底物。量化對蛋黃的酶處理所得的脂質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)物是通過從底物中提取脂質(zhì)，接著做脂質(zhì)成分的GLC分析得來的。操作步驟材料蛋黃巴氏滅菌的液態(tài)蛋黃，來自ProductsA/S，DK-4000Roskilde。HEPES緩沖液Sigma目錄號.H3375氯仿，分析級酶純化的、來自殺鮭氣單胞菌#178-9的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶細毛嗜熱霉脂酶GRINDAMYLEXEL16，產(chǎn)品號147060(對照)以蛋黃為底物的酶測定。在20mlWheaton玻璃杯稱量5克液態(tài)蛋黃，加熱到35℃。添加0.25ml酶溶液，計時開始。以規(guī)律間隔將0.5g樣品移到10mlDram玻璃杯(glass)中。添加20μl4MHCl，以終止酶反應(yīng)并酸化脂肪酸鹽。添加3ml氯仿。將樣品在Whirley中混合30秒。將樣品在3000×g離心10分鐘，并取0.8ml氯仿相移至涂焦油的(tarred)Dram玻璃杯中。在60℃氮蒸汽條件下蒸發(fā)氯仿。再次稱量dram玻璃杯。提取的脂質(zhì)通過GLC和TLC分析。TLC分析-如本文所述。GLC分析-如本文所述。結(jié)果對于用蛋黃作為底物的蛋黃測定法，如表9所示進行實驗。表9分別在15，30，60，120和1080分鐘后取出0.5g樣品，通過溶劑提取分離脂質(zhì)。分別用溶劑I和IV做脂質(zhì)的TLC分析。TLC板的照片如圖52所示。TLC分析清楚的表明殺鮭氣單胞菌的轉(zhuǎn)移酶#178-9的活性(樣品3)。這可以從磷脂PC和PE的下降看出。結(jié)果也表明溶血卵磷脂LPC的量不像期望值那樣高。這說明也許該酶對溶血卵磷脂有水解活性或也可能是由于溶血卵磷脂極性強，可部分的分散在水相中，導(dǎo)致提取不充分所至。為確定游離脂肪酸，膽固醇及膽固醇酯的量，也對溶劑提取所分離的脂質(zhì)進行GLC分析。GLC結(jié)果如表10所示。表10來自經(jīng)酶處理的蛋黃的脂質(zhì)的GLC分析。結(jié)果以基于脂質(zhì)成分的％表示從結(jié)果來看，觀察到在60分鐘后樣品3中的膽固醇幾乎全部被酯化。可以推論在前30分鐘中有多余的反應(yīng)底物。因此，來自15和30分鐘后所取樣品的結(jié)果被用于計算所述酶的活性?；诒?0的信息和蛋黃中含有27％脂質(zhì)的事實，可計算出每毫升酶產(chǎn)生的微摩爾脂肪酸與膽固醇酯的數(shù)量，結(jié)果見于表11。表11的結(jié)果通過對樣品3(殺鮭氣單胞菌，15分鐘)中脂肪酸的結(jié)果進行如下計算得來5g蛋黃中的脂質(zhì)＝5*0.27＝1.35克1.35克脂質(zhì)含1.007％脂肪酸＝1.35*1.007/100＝0.01359克脂肪酸的平均分子量是2720.01359克＝0.01359*1000000/272μmol＝49.9798μmol添加0.25ml酶μmol脂肪酸/ml酶＝49.9798/0.25＝199.9表11從表11的結(jié)果可以計算出，與對照相比，酶引起的脂肪酸和膽固醇酯的量的變化，見表12。表12產(chǎn)生的脂肪酸和膽固醇酯的量作為時間的函數(shù)，如圖53所示。作為時間的函數(shù)的水解活性(FFA形成)和脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶活性(膽固醇酯形成)可從曲線的斜度計算出。接著可以算出相對轉(zhuǎn)移酶活性(％?；D(zhuǎn)移酶活性)和相對水解活性，如表13所示。相對轉(zhuǎn)移酶活性可通過先前描述的?；D(zhuǎn)移酶活性百分比測定方案來測定。例如，計算#178-9的相對活性總活性是FFA活性+轉(zhuǎn)移酶活性＝9,023+7,2884＝16,311μmol/min/ml，相對轉(zhuǎn)移酶活性＝7,2884*100/16,311＝44,7，相對水解活性＝9,023*100/16,311＝55,3表13表13中的結(jié)果證實來自殺鮭氣單胞菌的轉(zhuǎn)移酶具有顯著的轉(zhuǎn)移酶活性，而且所述結(jié)果也證實該酶具有顯著的水解活性。來源于細毛嗜熱霉的脂酶主要有水解活性，相對轉(zhuǎn)移酶活性1.6不能證明具有任何轉(zhuǎn)移酶活性，只能用分析中的不確定因素來解釋。結(jié)論利用蛋黃作為底物，來測定來自殺鮭氣單胞菌的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶和來自細毛嗜熱霉的脂酶的轉(zhuǎn)移酶和水解酶活性。測定條件下，在膽固醇酯與游離脂肪酸的形成與脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的時間之間最初存在線性關(guān)系?；谶@種線性關(guān)系就可計算出水解活性(FFA形成)和轉(zhuǎn)移酶活性(膽固醇酯形成)。相對水解活性和轉(zhuǎn)移酶活性也可計算出來。來自殺鮭氣單胞菌的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶(本例是GCAT)在這種測定條件下，表現(xiàn)出幾乎等同的水解和轉(zhuǎn)移酶活性。來自細毛嗜熱霉的脂酶表現(xiàn)出很低的水解活性而且轉(zhuǎn)移酶活性不顯著。實施例11高水分的蛋黃中的轉(zhuǎn)移酶測定簡介依據(jù)本發(fā)明的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶從殺鮭氣單胞菌分離并在枯草芽孢桿菌中表達。初步實驗顯示該酶對于利用蛋黃為底物將脂肪酸從脂質(zhì)轉(zhuǎn)移到膽固醇有效。如下實驗中，將更詳細研究用蛋黃作為底物的轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)，特別關(guān)注含所述底物中的水濃度。操作步驟材料蛋黃巴氏滅菌的液態(tài)蛋黃，來自ProductsA/S，DK-4000Roskilde。HEPES緩沖液Sigma產(chǎn)品號H3375氯仿，分析級角鯊?fù)?，分析級酶依?jù)本發(fā)明來自殺鮭氣單胞菌的#178-9脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶來自尖鐮孢(fusariumoxysporum)的#2427磷脂酶FfromNovozymes，DK(相當于脂解酶)來自胰腺的#1991磷脂酶A2，LIPOMOD22LfromBiocatalysts，UK(相當于脂解酶)以蛋黃為底物的酶測定用20mlWheaton玻璃杯稱量5克液態(tài)蛋黃，加熱到35℃。添加水和酶溶液，開始計時。以規(guī)律間隔將0.5g樣品移到10mlDram玻璃杯中。添加20μl4MHCl以終止酶反應(yīng)并酸化脂肪酸鹽。添加3ml氯仿。將樣品在Whirley中混合30秒。將樣品在3000×g離心10分鐘并取0.8ml氯仿相移至涂焦油的Dram玻璃杯中。在60℃氮蒸汽下蒸發(fā)氯仿。再次稱量dram玻璃杯。分離的脂質(zhì)通過GLC分析。GLC分析PerkinElmerAutosystem9000CapillaryGasChromatograph，其配備有WCOT融合的硅柱12.5m×0.25mmID×0.1μ薄膜厚度5％苯甲基硅酮(phenyl-methyl-silicone)(CPSil8CB來自Chrompack)。載氣氦注射器.PSSI冷裂注射(最初溫度50℃加熱到385℃)體積1.0μl檢測器FID395℃烘箱程序123烘箱溫度，℃.90280350等溫(isothermal)，時間，分鐘.1010變溫速率(temperaturerate)，℃/min.154樣品制備30mg樣品溶于9ml庚烷吡啶，2∶1含有內(nèi)部標準十七烷，0.5mg/ml。將300μl的樣品溶液移到曲管形瓶(crimpvial)，添加300μlMSTFA(N-甲基N-三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺(N-Methyl-N-trimethylsilyl-trifluoraceamid))，60℃反應(yīng)20分鐘。計算甘油單-二-三酯(mono-di-triglycerides)和游離脂肪酸的反應(yīng)因子(reactionfactor)通過標準2(單-雙-甘油三酯)確定，膽固醇，膽固醇棕櫚酸酯(Cholesterylpalmitate)和膽固醇硬脂酸酯的反應(yīng)因子通過純化的參比物質(zhì)(稱重純化物質(zhì)10mg)來確定。結(jié)果含有2％角鯊?fù)?squalane)的蛋黃作為反應(yīng)的底物。加入角鯊?fù)樽鳛镚LC分析的內(nèi)部標準，以量化蛋黃中的脂質(zhì)成分。實驗設(shè)計如表14所示。表1430，60和120分鐘后取樣品，用上述方法分析(取樣品0.5ml(exp1-4)0.86ml(exp.5-6)和2.2ml(exp.7-8))。GLC結(jié)果如表15所示。GLC結(jié)果用底物(蛋黃)的百分比表示。本表還顯示了反應(yīng)時間與反應(yīng)混合物中的總水含量。表15基于對脂肪酸，膽固醇和膽固醇酯的分析，可計算出產(chǎn)生的游離脂肪酸和膽固醇酯的含量作為反應(yīng)時間和含水量的函數(shù)。在這些結(jié)果的基礎(chǔ)上，就可以以脂肪酸形成和膽固醇酯形成的總和計算出總酶活性。通過表16所示結(jié)果可計算出相對水解活性和相對轉(zhuǎn)移酶活性(即％?；D(zhuǎn)移酶活性)。表16所示結(jié)果也可用StatgraphicMultifactorANOVA做統(tǒng)計分析。圖54的統(tǒng)計結(jié)果證實在此種測定條件下，磷酸脂酶A1，#2427和磷酸脂酶A2，#1991沒有轉(zhuǎn)移酶活性而轉(zhuǎn)移酶#178-9顯示出50％的轉(zhuǎn)移酶活性。在該測定中含水量對于轉(zhuǎn)移酶#178的轉(zhuǎn)移酶活性的影響也經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，如圖55所示。這些結(jié)果表明該測定中的含水量在54-89％范圍之間的情況下，含水量對于相對轉(zhuǎn)移酶活性無明顯影響。反應(yīng)時間對于轉(zhuǎn)移酶#178的轉(zhuǎn)移酶活性的影響利用如表16與圖56所示的結(jié)果評估。圖56結(jié)果表明相對轉(zhuǎn)移酶活性作為反應(yīng)時間的函數(shù)下降。這可以用大多數(shù)受體分子膽固醇被消耗，因此相對水解活性提高這一事實來解釋。#2427轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)的負值僅表明對于這種分析方法，在變異內(nèi)沒有轉(zhuǎn)移酶活性。表16結(jié)論來自殺鮭氣單胞菌的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的檢測在底物蛋黃中、并在不同含水量條件下進行。該酶與對照脂解酶即來自尖鐮孢的磷脂酶A1和來自胰腺的磷脂酶A2對比。結(jié)果證明在膽固醇酯形成過程中只有轉(zhuǎn)移酶催化卵磷脂與膽固醇之間的轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)。結(jié)果表明在底物含水量在54％到89％的范圍內(nèi)，對于來自殺鮭氣單胞菌轉(zhuǎn)移酶的相對轉(zhuǎn)移酶活性幾乎是相同的。實施例12“經(jīng)緩沖的底物中的轉(zhuǎn)移酶測定法”用于測定酰基轉(zhuǎn)移酶活性(例如用于利用卵磷脂與膽固醇的食品)脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶從殺鮭氣單胞菌分離出來并在枯草芽孢桿菌中表達。該酶在形成膽固醇酯過程中，對于將脂肪酸從脂質(zhì)轉(zhuǎn)移到膽固醇非常有效。通過觀察游離脂肪酸的形成，顯示該酶具有一定的水解活性。傳統(tǒng)的磷脂酶(EC3.1.1.4和EC3.1.1.32)在游離脂肪酸和溶血卵磷脂的形成過程中具有水解卵磷脂的能力，并且未有報道這些酶有轉(zhuǎn)移酶活性。我們這里詳細描述了酶的轉(zhuǎn)移酶和水解活性的測定方法，因此可鑒別與本發(fā)明一致的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶，測定方法所用底物包括卵磷脂和膽固醇。此次研究中所用的底物基于分散在緩沖液中的磷酸卵磷酯和膽固醇。從所述底物中提取脂質(zhì)，然后用GLC分析脂質(zhì)成分，從而定量反應(yīng)產(chǎn)物。操作步驟材料L-α-磷脂酰膽堿95％(植物)Avantino.441601膽固醇Sigma目錄.C8503膽固醇基棕櫚酸酯，SigmaC6072膽固醇基硬脂酸酯，SigmaC3549HEPES緩沖液Sigma目錄號.H3375氯仿，分析級酶來源殺鮭氣單胞菌的#178-9的、純化GCATTLC分析如實施例6描述進行。GLC如實施例11描述進行。結(jié)果轉(zhuǎn)移酶測定基于作為底物的磷酸卵磷酯和膽固醇。根據(jù)下述操作，下列轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)移酶活性在以磷酸卵磷酯和膽固醇基礎(chǔ)的底物中測定。450mg磷酸卵磷酯(＞95％PCAvanti產(chǎn)品號441601)和50mg膽固醇溶于氯仿，在真空條件下蒸發(fā)干燥。300mg膽固醇/磷脂酰膽堿混合物移到一Wheaton玻璃杯中并且添加15ml50mMHEPES緩沖液pH7。在攪拌過程中脂質(zhì)分散到緩沖液中。底物用磁力攪拌器混和同時加熱至35℃，添加0.25ml酶溶液。這是含水量大約95％的高水分環(huán)境。在反應(yīng)0，5，10，15，25，40和60分鐘后取出2ml樣品。立即添加25μl4MHCl以酸化游離脂肪酸，終止酶反應(yīng)。添加3.00ml氯仿。將樣品在Whirley中劇烈搖晃振搖30秒。將樣品離心，分離2ml氯仿相并用0.45-μm的濾紙(filter)過濾，進入10ml涂焦油的Dram玻璃杯中。在60℃氮蒸汽條件下蒸發(fā)氯仿。并再次稱量樣品。提取的脂質(zhì)通過GLC分析。GLC分析結(jié)果如圖17所示。結(jié)果以所提取脂質(zhì)的百分比計算。形成的脂肪酸和膽固醇酯的量作為時間的函數(shù)，如圖57所示。從圖57推斷酶反應(yīng)作為時間的函數(shù)不是線性的，因為可觀察到最初的水解和轉(zhuǎn)移酶活性較高。在大約10分鐘之后，大約60分鐘之前，反應(yīng)顯示出脂肪酸和膽固醇酯的形成與時間的線性關(guān)系。因此決定以這種時間間隔觀察酶反應(yīng)。表17根據(jù)已知的反應(yīng)混合物中的脂質(zhì)含量與添加的酶量可計算脂肪酸和膽固醇酯的生成量，用μmol/ml酶表示(表18與圖58)表18從表18的結(jié)果和圖58的曲線斜率，可以計算出作為時間函數(shù)的脂肪酸和膽固醇酯的數(shù)量，用μmol/min每ml酶表示。水解活性與轉(zhuǎn)移酶活性的計算如表19所示。用在上文描述的％?；D(zhuǎn)移酶活性的測定方案測定相對轉(zhuǎn)移酶活性。表19其它酶的轉(zhuǎn)移酶活性篩選上面提到的方法用來篩選不同脂解酶的轉(zhuǎn)移酶活性和水解活性。檢測的酶如表20所示。表20包含300mg磷脂酰膽堿/膽固醇的底物分散到50mMpH7.0的HEPES緩沖液中，攪拌下加熱至35℃，添加酶溶液，攪拌樣品維持在35℃。以規(guī)律的時間間隔取出樣品并用氯仿提取。分離的脂質(zhì)用GLC分析，結(jié)果如表21所示。表21從GLC分析可以觀察到，只有脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶(178-9)產(chǎn)生大量的膽固醇酯和脂肪酸。并觀察到來自尖鐮孢的磷脂酶使得游離脂肪酸量穩(wěn)定增加，僅最初有少量的膽固醇酯形成，但是沒有觀察到膽固醇酯作為時間函數(shù)而增高。根據(jù)脂質(zhì)底物的量與GLC分析，可以基于得自10到60分鐘反應(yīng)時間的結(jié)果計算出相對轉(zhuǎn)移酶活性和相對水解活性。轉(zhuǎn)移酶178-9和尖鐮孢脂酶的結(jié)果如表21所示。其它被檢驗的酶不表現(xiàn)活性。表21表21所示結(jié)果證實脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶(樣品178-9)具有顯著的轉(zhuǎn)移酶活性。同樣也觀察到相對轉(zhuǎn)移酶活性與表19所示實驗十分一致。然而觀察到來自尖鐮孢的磷脂酶具有很低的轉(zhuǎn)移酶活性。轉(zhuǎn)移酶活性非常低以至于其落在分析的不確定性范圍中。正如意料中一樣，尖鐮孢的磷脂酶具有顯著的水解活性。結(jié)論基于純化的磷脂酰膽堿和膽固醇的人造底物替代蛋黃(實施例11所示)作為測定殺鮭氣單胞菌轉(zhuǎn)移酶活性的底物。在反應(yīng)時間10到60分鐘之間，游離脂肪酸與膽固醇酯形成作為時間的函數(shù)呈現(xiàn)幾乎線性?；诜磻?yīng)時間10到60分鐘之間的活性，可計算出水解活性與轉(zhuǎn)移酶活性。本測定方法中的底物濃度相對低于蛋黃中的底物濃度而言較低，而含水量相對較高。根據(jù)來自殺鮭氣單胞菌的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶(這種情況中是GCAT)在緩沖液中人造底物磷脂酰膽堿/膽固醇中的實驗的結(jié)果，推論這種酶在含水量很高的體系中也具有很好的轉(zhuǎn)移酶活性?；诘包S(參見實施例11)和緩沖液中的磷脂酰膽堿/膽固醇(參見實施例12)的測定方法都可用于測定酶的轉(zhuǎn)移酶活性和水解活性。根據(jù)以下角度優(yōu)選蛋黃水解活性和轉(zhuǎn)移酶活性與時間呈線性關(guān)系，而緩沖液中的磷脂酰膽堿/膽固醇僅在某一時間范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。實施例13食品乳劑(FoodEmulsion)在含60％油的標準食品乳劑配方(standardFoodemulsionrecipe)中測定經(jīng)酶修飾的液態(tài)蛋黃的影響。標準方法與材料如前例的逐條所述。如表22所示，蛋黃用來自殺鮭氣單胞菌(#138)的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶或磷脂酶，即商品酶(commerciallyavailableenzyme)(NovozymesA/S，Denmark)(#2938)處理。表22蛋黃的酶處理來自酶處理過的蛋黃的蛋黃脂質(zhì)的TLC分析顯示在圖59和60。在本實驗中，#2939的劑量增大10倍，這對蛋黃產(chǎn)生十分明顯的活性。游離脂肪酸量明顯升高，卵磷脂(PC)水解為溶血卵磷脂(LPC)。由于游離膽固醇轉(zhuǎn)化為膽固醇酯，部分卵磷脂轉(zhuǎn)化為溶血卵磷脂，所以轉(zhuǎn)移酶#138產(chǎn)生了明顯的轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)。酶修飾作用的另一有趣方面是產(chǎn)物的稠度(consistency)。經(jīng)磷脂酶#2938處理的樣品變得十分堅硬，而用脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶#138處理的樣品與對照樣品具有相同的液體稠度(參見圖61)。在食品乳劑配方中檢測修飾后的蛋黃，如表23所示。表23蛋黃醬與酶修飾蛋黃經(jīng)修飾的蛋黃1和2經(jīng)脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶處理；經(jīng)修飾的蛋黃3經(jīng)商品磷脂酶處理。根據(jù)下列操作程序可生產(chǎn)水包油乳劑的食品乳劑蛋黃與水在燒杯中稱量，油單獨稱量。Turrax混合器(20000rpm)浸于水相中。油以一恒定速度泵入水相，持續(xù)2分鐘?；旌线^程再持續(xù)1分鐘。然后加入醋并混合5秒。在100℃加熱箱中時檢驗乳化劑穩(wěn)定度。100℃、2小時后評定所述乳劑(參見圖62)。本次實驗中未經(jīng)處理蛋黃的乳劑穩(wěn)定度十分良好。但用脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶#138處理蛋黃由于水分離(waterseparation)的量減少而具有提高的穩(wěn)定度。經(jīng)磷脂酶#2938處理的蛋黃產(chǎn)生非常不穩(wěn)定的乳劑，在100℃時油與水相幾乎完全分離。認為，在一些申請中，使用本發(fā)明的組合物和方法可提高乳劑的熱穩(wěn)定性，如水包油色拉調(diào)料等。這一點對于食品乳化劑尤為重要，這些食品乳化劑為延長保質(zhì)期要經(jīng)巴氏滅菌處理和/或儲存之前接受加熱處理，如在食用之前要再加熱處理的經(jīng)預(yù)加工的肉類(如微波爐肉類)。雖然不期望受任何具體理論束縛，在一些申請中，游離脂肪酸的蓄積被認為可損害這些乳劑的熱穩(wěn)定性。應(yīng)認識到使用本發(fā)明方法獲得的熱穩(wěn)定性增強的食品乳劑，在所有食品申請中不能被發(fā)現(xiàn)或甚至不是所需的。這對于這樣的領(lǐng)域中的技術(shù)人員而言顯而易見，在該領(lǐng)域中的申請中這些特點在申請中是可取的，乳劑的穩(wěn)定性可用等同于例如巴氏滅菌或微波爐再加熱的簡單加熱實驗容易地檢測。發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)在優(yōu)選的具體實施方案中，用本發(fā)明的酶獲得的食品乳劑具有提高的熱穩(wěn)定性。實施例14富含植物固醇的蛋黃中的轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)源自殺鮭氣單胞菌的轉(zhuǎn)移酶可催化在富含植物固醇與甘油的蛋黃中形成溶血卵磷脂、甘油單酯和植物甾醇酯。所述酶也在包括棕櫚油，卵磷脂，植物固醇與甘油的低含水量體系中檢測。通過TLC和GLC分析顯示，在這些反應(yīng)條件下有甘油單酯和植物甾醇酯生成。引言在卵磷脂、脂肪、植物固醇與甘油的幾乎不含水的體系(almostwaterfreesystem)中，測定來自殺鮭氣單胞菌的轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)移酶活性。材料蛋黃經(jīng)巴氏滅菌的液態(tài)蛋黃來自ProductsA/S，DK-4000RoskildeGCAT轉(zhuǎn)移酶純化178-9，32PLU-7/ml(Journal2254-100)大豆卵磷脂，YolkinfromAarhusUnited，Denmark.棕櫚油43，來自AarhusUnited，Denmark.L-α磷脂酰膽堿95％植物(Avanti#441601)谷甾醇，SigmanoS5753植物固醇GenerolN122來自Cognis，Germany甘油產(chǎn)品號085915結(jié)果對植物固醇與甘油的轉(zhuǎn)移酶活性初始篩選在蛋黃中如表24所述進行。表24*相對酶溶液中水量的水＝83μl混合各成分并加熱至37℃，在用磁力攪拌器攪拌的過程中保持在這個溫度。3和23小時后取出0.1克樣品，用TLC分析。TLC分析結(jié)果如圖63所示。圖63中的結(jié)果表明，膽固醇與植物固醇可通過轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)酯化，并伴隨溶血卵磷脂的形成(樣品3和4)，原因是在樣品3中幾乎所有的游離固醇和膽固醇都轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酯。結(jié)果也說明只具有甘油和蛋黃的樣品產(chǎn)生甘油單酯。甘油單酯的量需經(jīng)過GLC分析確認。當固醇與甘油(樣品3)同時添加時，甘油單酯的量非常低，以至于應(yīng)用TLC檢測不到。這說明只要固醇和膽固醇有剩余，使用甘油的轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)就是適度的。在另一實驗中，將轉(zhuǎn)移酶178-9添加到大豆卵磷脂、甘油和植物固醇的混合物中，目的是研究酶在該反應(yīng)混合物中的催化活性。在這些實驗中反應(yīng)混合物中的組成如表25所示。表25實驗通過在46℃攪拌下混合所述脂質(zhì)成分來進行。添加酶，4和24小時以后取出樣品。樣品通過TLC分析，如圖64所示。在反應(yīng)24小時后，取出實驗2、4和5的樣品，也進行GLC分析，結(jié)果如表26所示。表26245甘油％3.165.714.17脂肪酸％4.235.366.67甘油單酯％2.243.873.92固醇％2.132.62甾醇酯％2.892.14結(jié)果證實了轉(zhuǎn)移酶178-9在含有大豆卵磷脂，甘油和植物固醇的反應(yīng)混合物中，可催化植物甾醇酯和甘油單酯的形成。在需要甘油單酯的乳化性質(zhì)以及植物固醇的降低膽固醇效應(yīng)的情況下，這種反應(yīng)混合物可用于人造黃油的生產(chǎn)。結(jié)論來源于殺鮭氣單胞菌的CGAT轉(zhuǎn)移酶可催化添加了植物固醇和甘油的蛋黃中植物甾醇酯和甘油單酯的形成。同樣的酶還催化在棕櫚油，卵磷脂，植物固醇和甘油的混合物中形成植物甾醇酯和甘油單酯。因此在需要甘油單酯和溶血卵磷脂以改善乳化作用并需要植物固醇的降低膽固醇效應(yīng)的情況下，該酶可用于人造黃油和其它含油食品的生產(chǎn)。實施例15來源于殺鮭氣單胞菌的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的固定化和在甾醇酯合成中的用途來源于殺鮭氣單胞菌的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶(本例中為GCAT)通過丙酮的沉淀作用固定在Celite上。10ml酶溶液在20mMpH7的TEA緩沖液中與0,1克Celite535535(來自Fluka)在室溫緩慢攪拌2小時。在持續(xù)攪拌過程中加入50ml冷丙酮。沉淀物通過在5000g離心1分鐘分離。沉淀物用20ml冷丙酮洗滌2次。Celite在環(huán)境溫度干燥1小時固定化轉(zhuǎn)移酶在含有13％磷脂酰膽堿酶和7％植物固醇的油混合物中檢測。(表27)表27卵磷脂，植物固醇和大豆油加熱至46℃，溶解植物固醇。添加固定化的轉(zhuǎn)移酶。在用磁力攪拌器溫和攪拌的過程中，轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)在46℃持續(xù)進行。在1/2、1、3、6和24小時后取出樣品，并進行TLC分析。反應(yīng)24小時后終止反應(yīng)，濾出(filteroff)固定化的酶。TLC分析樣品結(jié)果如圖65所示。TLC分析明確顯示來自殺鮭氣單胞菌的固定化的轉(zhuǎn)移酶在將膽固醇轉(zhuǎn)化為膽固醇酯中的效應(yīng)。也可觀察到少量甘油單酯形成。酶也顯示在含水量高(6-89％)的環(huán)境中具有高的活性，轉(zhuǎn)移酶和用于本發(fā)明的其它轉(zhuǎn)移酶因此也可用于具有高含水量的固定化的酶的應(yīng)用中。這就允許在利用轉(zhuǎn)移酶的脂質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化中替代目前的固定化的脂酶。實施例16嗜水氣單胞菌轉(zhuǎn)移酶可從磷脂轉(zhuǎn)移到固醇形成甾醇酯和/或轉(zhuǎn)移到糖分子形成糖酯。來自嗜水氣單胞菌、在大腸桿菌(Hydro0303HVP)中表達的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶(標號#139)在螯合型瓊脂糖凝膠FF，HR2.5/10柱上純化并分析磷脂酶活性。在蛋黃中評價轉(zhuǎn)移酶活性來確定在蛋黃中的酶活性與功能性。所述酶也可在含有葡萄糖的蛋黃中檢測。磷脂酶活性從螯合型瓊脂糖凝膠FF，HR2.5/10柱分離的轉(zhuǎn)移酶#139用NEFA-PLU(pH7)測定，活性為1,15單位NEFA-PLU/ml。蛋黃在初始申請試驗中，轉(zhuǎn)移酶#139是根據(jù)下列操作步驟在蛋黃中檢測的。1克新鮮蛋黃在10ml有螺旋蓋的燒瓶中稱量。加入酶制劑并在旋渦混合器中混和。樣品放置于37℃并用磁性攪拌器攪拌。加入7.5ml氯仿∶甲醇(2∶1)終止反應(yīng)并在Whirley中混和30秒。氯仿相通過離心分離，將2μl氯仿相轉(zhuǎn)移至預(yù)活化的硅TLC板上并用流動的緩沖液nr.I洗脫，另一TLC板在流動的緩沖液IV中洗脫。實驗設(shè)計如表28所示表28TLC分析如圖66和圖67所示。TLC分析清楚顯示了轉(zhuǎn)移酶#139的轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)。膽固醇轉(zhuǎn)化為膽固醇酯，卵磷脂量減少。然而結(jié)果同樣也說明由于轉(zhuǎn)移酶#139也作用于溶血卵磷脂，所以溶血卵磷脂僅有少量的蓄積。游離脂肪酸(FFA)的形成支持本次觀察結(jié)果。蛋黃與葡萄糖初期已顯示來自殺鮭氣單胞菌的轉(zhuǎn)移酶(#138)可在轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)中利用葡萄糖作為受體分子。也檢測了轉(zhuǎn)移酶(#139)是否可利用葡萄糖作為受體分子。實驗設(shè)計見于表29。表29反應(yīng)產(chǎn)物通過TLC分析(圖68和圖69)。TLC分析表明在反應(yīng)時間220分鐘后形成葡萄糖酯(圖69泳道6)但在反應(yīng)1200分鐘后觀察不到葡萄糖酯。因此可以推論轉(zhuǎn)移酶#139具有轉(zhuǎn)移酶和水解活性。游離脂肪酸作為反應(yīng)時間的函數(shù)穩(wěn)定升高也證明了這一點。概述(resume)來自嗜水氣單胞菌的轉(zhuǎn)移酶在蛋黃中檢測。結(jié)果證實該酶催化膽固醇酯的形成并伴有溶血卵磷脂的形成。延長的反應(yīng)時間之后，當大部分膽固醇消耗掉，游離脂肪酸也形成。因此可以推論該酶主要具有轉(zhuǎn)移酶活性，當只有水作為供體分子時，也可觀察到水解活性。在利用蛋黃與葡萄糖的實驗中，觀察到來自嗜水氣單胞菌的轉(zhuǎn)移酶在含水量高的食物環(huán)境中可催化葡萄糖酯的原位形成(圖70)。實施例17來自嗜水氣單胞菌(Ahyd2)的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的變體(SEQIDNo.36(參見圖71))用來自Stratagene，LaJolla，CA92037，USA的Multi-SiteDirectedMutagenesis試劑盒引入突變，按Stratagene提供的說明進行。變異位于酪氨酸256的變體表現(xiàn)出對磷脂的活性增加。變異位于酪氨酸256和酪氨酸260的變體顯示對半乳糖脂的活性增加。變異位于酪氨酸265的變體顯示對作為?；w的半乳糖脂的轉(zhuǎn)移酶活性增加。編號指示在下列序列中的位置來自嗜水氣單胞菌的酶，其氨基酸序列如圖71SEQIDNo.36所示(加下劃線的氨基酸表示木聚糖酶信號肽)。核苷酸序列如圖72中SEQIDNo54所示。實施例18?；D(zhuǎn)移酶反應(yīng)在產(chǎn)生用于制備人造黃油的植物甾醇酯和甘油單酯中的用途在枯草芽孢桿菌中表達的、源自殺鮭氣單胞菌的?；D(zhuǎn)移酶在包含植物卵磷脂，植物固醇和甘油的棕櫚油混合物中被檢測。酰基轉(zhuǎn)移酶在產(chǎn)生植物甾醇酯和甘油單酯的過程中，表現(xiàn)出利用植物固醇和甘油作為受體分子的能力。反應(yīng)混合物用于基于反應(yīng)混合物中的甘油單酯生產(chǎn)高品質(zhì)的食用(table)人造黃油，與此同時，人造黃油中富含有降膽固醇作用的植物甾醇酯。此次實驗的目的是研究通過溶于植物脂肪中的卵磷脂、植物固醇和甘油的酶促反應(yīng)生成甘油單酯和植物甾醇酯的可能性。初始實驗表明利用來自殺鮭氣單胞菌的?；D(zhuǎn)移酶從卵磷脂、甘油和植物固醇生成甘油單酯和植物甾醇酯是可能的。此次實驗中，這種反應(yīng)混合物被用于生產(chǎn)食用人造黃油。材料來自殺鮭氣單胞菌的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶，#196C101，18.6PLU/g(Journal2254-104)棕櫚油43，來自AarhusUnited，DKL-α磷脂酰膽堿95％植物(Avanti#441601)植物固醇GenerolN122來自Cognis，Germany甘油產(chǎn)品號085915蒸餾過的甘油單酯，DimodanHP來自Danisco.人造黃油的制備1、混合水相成分。(如有需要，將水相加熱至約80℃進行巴氏滅菌)。調(diào)節(jié)到pH5.5。2、熔化脂肪相，溫度調(diào)節(jié)到大約40-45℃。3、加熱乳化劑，其中一些油為以下比例1份乳化劑比5份的油脂到一定溫度(75-80℃)，所述溫度比乳化劑的熔點高5-10℃。當混合物完全熔化并充分攪拌后，將其加入持續(xù)加熱的油中，持續(xù)攪拌。4、添加調(diào)味料。5、將水相添加到脂肪相中，持續(xù)攪拌。6、在冷凝管(正常容量，正常冷卻)中冷卻至出口溫度8-10℃。結(jié)果在棕櫚油混合物中檢測源自殺鮭氣單胞菌的?；D(zhuǎn)移酶，如表30所示。為使植物固醇和卵磷脂溶解，在攪拌過程中將卵磷脂、植物固醇、甘油和棕櫚油加熱至60℃。表30底物％Avanti卵磷脂12植物固醇，Generol122N6.6棕櫚油，熔點4376.4甘油5底物冷卻至48℃，按表31所示量添加?；D(zhuǎn)移酶#196。緩慢攪拌中保持反應(yīng)混合物在48℃24小時。表31克底物220轉(zhuǎn)移酶#196C101，1518.6PLU/g在反應(yīng)1、4和24小時后從反應(yīng)混合物中取出樣品，并在溶劑I中做TLC分析(圖73)。TLC結(jié)果清楚顯示有植物甾醇酯和甘油單酯形成。在圖73中，第一泳道是反應(yīng)1小時后，泳道2是反應(yīng)4小時后，泳道3是反應(yīng)24小時后，泳道4是植物固醇。反應(yīng)24小時后終止反應(yīng)，棄去不溶性植物固醇的殘余物，澄清溶液用于生產(chǎn)人造黃油。人造黃油根據(jù)表32所示配方，含甘油單酯和植物甾醇酯的反應(yīng)混合物用于生產(chǎn)食用人造黃油。表32從反應(yīng)混合物中產(chǎn)生的人造黃油品質(zhì)優(yōu)良，具有良好的可涂抹性(spreadability)，良好的口感且沒有任何風(fēng)味喪失。人造黃油與用蒸餾過的甘油單酯DimodanHP生產(chǎn)的參比人造黃油在質(zhì)量水平上進行對比。觀察到人造黃油jour.3734no2與反應(yīng)混合物的唯一不同就是稍稍硬一些，原因是配方中所含的棕櫚油43比參比人造黃油中的含量大。實施例19脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶在面包制作中的用途在制作面包時，使用脂酶的局限性之一是脂酶反應(yīng)過程中有游離脂肪酸形成。眾所周知，過多的游離脂肪酸形成將對面粉的烘烤效果產(chǎn)生負面影響，原因是谷蛋白變得太硬和僵(bucky)(即彈性下降)的面團形成，其在發(fā)酵和烘烤過程中不能膨脹。從抗氧化穩(wěn)定性角度而言，也應(yīng)避免形成游離脂肪酸，原因是游離脂肪酸比相應(yīng)的甘油三酯更易于發(fā)生脂質(zhì)氧化。本發(fā)明中，在面團中添加脂解酶導(dǎo)致游離脂肪酸形成的問題可以用添加脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的方法克服，脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶不產(chǎn)生游離脂肪酸，而將一個或多個脂肪酸從脂質(zhì)?；w轉(zhuǎn)移到面團中的非水受體分子上，如碳水化合物、蛋白或肽鏈，或者如果用于含有乳脂肪面包中，固醇可選或與其它上面列出的受體聯(lián)合添加到面團中，所述固醇如植物固醇或phytostanol。優(yōu)選，面團中的受體分子可能是葡萄糖、蔗糖或麥芽糖和/或其它常用在面團中的碳水化合物中的一種或多種物質(zhì)。在下列實驗中，在微型烘烤實驗中檢測脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶。反應(yīng)產(chǎn)物的形成，充分醒發(fā)成形的(fullyproved)面團中的脂質(zhì)成分由水飽和的丁醇提取，并通過HPLC和GLC分析。材料與方法酶?；D(zhuǎn)移酶，550PLU-7/mlLipopanTMFBG，Novozymes.提供的商品脂酶.12000LIPU/g或GrindamylExel16.12000LIPU/g卵磷脂粉，95％磷脂(DaniscoA/SDenmark提供)雙半乳糖甘油二酯，來自全麥(面)粉(來自SigmaD4651)面粉nr.2001084(丹麥小麥粉，來自Havnemollerne，Odense，Denmark)微型烘烤實驗面粉50克，干酵母10克，葡萄糖0.8克，鹽0.8克，70ppm抗壞血酸和400Brabender單位的水在50克Brabender混合碗中、30℃揉捏5分鐘。34℃靜置10分鐘。將面團分成各15克的面團。然后在一特殊裝置中成形，其中面團卷在木盤和樹脂玻璃支架之間。所述面團在罐中34℃醒發(fā)45分鐘，在Voss家用烤爐中225℃烘烤8分鐘。烘烤后，使面包冷卻至室溫。20分鐘后稱量面包并用油菜籽置換法(rapeseeddisplacementmethod)測量體積。面包還被切開，并評價面團瓤(crumb)和面包皮(crust)。結(jié)果與結(jié)論初步結(jié)果表明脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶對于面包的體積與外觀都顯示出明顯的積極作用。具體地，初步結(jié)果表明與對照(無酶)及與使用商品脂解酶即GrindamylExel16或LipopanFTM時相比，使用脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶使比面包體積(spcificbreadvolume)增大。實施例20利用乳脂的標準冰淇淋用于冰淇淋的乳化劑可產(chǎn)生受控制的脂肪結(jié)晶化和輕微的去穩(wěn)定化，這是由于在冰淇淋的陳化(aging)過程中蛋白質(zhì)吸附作用導(dǎo)致。這種改變改善了冰淇淋品質(zhì)。甘油單酯或甘油二酯通常用于冰淇淋生產(chǎn)，也已知在冰淇淋生產(chǎn)過程中聯(lián)合使用極性乳化劑如聚山梨酯和糖酯以及甘油單-二酯(mono-diglyceride)，有助于控制脂肪去穩(wěn)定化，生產(chǎn)的冰淇淋具有良好的奶油質(zhì)感和幼滑的口感。冰淇淋乳化劑通常以粉劑形式添加到冰淇淋混合物。但近來已表明使用脂酶對冰淇淋配方中的脂肪進行酶促反應(yīng)，可產(chǎn)生甘油單-二酯。但是使用脂酶帶來的問題是當反應(yīng)混合物中存在有水時，脂酶也催化游離脂肪酸的形成。但是，令人吃驚的是脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶克服了脂酶的缺陷，因為脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以將脂肪酸從卵磷脂和其它脂質(zhì)上轉(zhuǎn)移至受體分子如固醇，膽固醇，葡萄糖，甘油和蛋白/肽鏈，而不形成大量的游離脂肪酸。冰淇淋中的主要成分之一是含有38％乳脂的乳制奶油(diarycream)。乳制奶油也包含少量的卵磷脂，卵磷脂是脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的供體分子。(“containssmalleramountoflecithin，whichisadonormoleculeforacyl-transferase.(“Complexmilklipidsaccountforabout1％ofthetotalmilkfatandaremainlycomposedofphospholipids”Ref.Mllmann′sEncyclopediaofIndustrialChemistryCopyright2003byWiley-VCHVerlagGmbH&Co.KGaA.)。乳制奶油還含有少量作為脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的受體分子的膽固醇。根據(jù)冰淇淋的組成成分，有可能產(chǎn)生甘油單酯和極性乳化劑，如溶血卵磷脂和糖酯，這些對于冰淇淋生產(chǎn)有益。在乳制奶油中酰基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)的另一有益效果是形成膽固醇酯，這可以減慢膽固醇在腸道中的吸收。冰淇淋配方冰淇淋生產(chǎn)過程1.將乳制奶油，葡萄糖糖漿和甘油加熱至約40℃。添加脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶，并讓混合物反應(yīng)30分鐘。取出樣品用于分析。2.加熱所有其它脂質(zhì)成分至約40℃。3.添加其它干燥成分。(添加之前，先混合穩(wěn)定劑混合物(stabiliserblend)和糖)4.當干燥成分溶解，加入乳制奶油-葡萄糖混合物。5.80-85℃巴氏滅菌20-40秒。6.80℃勻漿(配方1，190巴；配方2，175巴)7.冷卻至陳化溫度，4℃8.在持續(xù)冷凍箱中冷凍到所需超限(desiredoverrun)(建議100％)9.在管道(tunnel)中-40℃硬化10.-25℃以下保存結(jié)果與使用商品乳化劑CremodanSE30制備的冰淇淋相比相比，在冰淇淋生產(chǎn)過程中使用?；D(zhuǎn)移酶有助于生產(chǎn)味道極佳，奶油口感很好的冰淇淋。由脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶生產(chǎn)的冰淇淋的熔化現(xiàn)象也有改善。實施例21乳酪中的?；D(zhuǎn)移酶乳酪是通過凝固牛奶，脫脂牛奶，部分脫脂牛奶，奶油，乳清奶油，或酪乳，或這些物質(zhì)的任何組合，通過粗制凝乳酶(rennet)或其它適宜的促凝劑的作用，部分排出所述凝固所產(chǎn)生的乳清，制成的新鮮或成熟的固體或半固體產(chǎn)品。乳酪產(chǎn)量主要依賴于牛奶中的脂肪與蛋白成分。鹽(具體是鈣鹽)和蛋白濃縮物，還有酸度，對于凝固非常重要。(ref.Mllmann′sEncyclopediaofIndustrialChemistryCopyright2003byWiley-VCHVerlagGmbH&Co)。所述努力是為優(yōu)化和增加乳酪產(chǎn)量，其可通過乳酪生產(chǎn)程序的最優(yōu)化(USP4,959,229)或通過使用改良凝固方法(USP4,581,240)實現(xiàn)，后一種方法可以增加凝乳中乳清蛋白的含量。在本發(fā)明中，使用脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶制備乳酪過程中，通過對牛奶的處理，通過酶促修飾乳清蛋白使凝乳中乳清蛋白的含量增加。當脂肪酸與非膜性蛋白如β-乳球蛋白共價結(jié)合時，它的物理的和功能的特性將顯著改變。為本發(fā)明的乳酪生產(chǎn)，在牛奶中添加粗制凝乳酶之前或同時將脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶加到牛奶中。酪蛋白沉淀的過程中，?；D(zhuǎn)移酶可在形成酰化的蛋白或?；碾逆溸^程中利用卵磷脂和牛奶中的其它脂質(zhì)作為供體，肽或蛋白作為受體分子。乳蛋白疏水性的改變有助于增加乳酪生產(chǎn)過程中凝乳中的蛋白沉淀。由于本發(fā)明獲得的乳酪產(chǎn)量增加源于提高常常丟失到乳清中的蛋白在乳酪凝塊中的保留量增加，因此一種直接與本發(fā)明機制相關(guān)的適宜方法是建立在測定乳清中的最終蛋白含量的基礎(chǔ)上。乳清中的蛋白越少必然意味著凝乳中的蛋白越多，乳酪產(chǎn)量也越高。乳清中蛋白量的測定含可按以下方法進行。在100ml燒杯中，將脫脂或全脂牛奶加熱至適宜粗制凝乳酶凝固的溫度，通常是30-35℃。任選添加1％的批乳酸菌起子(bulklacticacidbacteriastarter)，并添加相應(yīng)量(例如0.03-0.05％)的標準粗制凝乳酶。當牛奶轉(zhuǎn)變成凝塊，其硬度足夠大從而允許被切成約邊長0.5cm的小塊，用鋒利的刀進行所述切割。脫水收縮作用從而開始，保持30分鐘后，使凝乳沉降，取出乳清樣品，用實驗室離心機離心10分鐘。用例如Kjeldahl方法分析該樣品的蛋白含量。做為選擇，和/或作為補充，樣品應(yīng)通過能確定單獨蛋白組分的類型和質(zhì)量的方法分析。實施例22“低水分環(huán)境中的測定法”脂解酶在低含水量環(huán)境中的轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)。操作步驟材料膽固醇Sigma目錄.C8503L-α-磷脂酰膽堿95％(植物)Avanti#441601大豆油，AarhusUnited，DK.氯仿，分析級酶#179，GCAT來自殺鮭氣單胞菌#2427，磷脂酶A1來自尖鐮孢(Fusariumoxysporum)，F(xiàn)來自Novozymes，Denmark#1991，來自胰腺的磷脂酶A2，LIPOMOD22L來自Biocatalysts，UK#2373，南極念珠菌(Candidaantarctica)脂酶，Novozyme525L來自NovozymesDenmark.酶測定通過在攪拌過程中加熱到60℃，使13.1％卵磷脂與6.6％膽固醇溶于大豆油用20mlWheaton玻璃杯稱量底物并加熱到46℃添加水與酶溶液并開始計時以規(guī)律間隔將50mg樣品轉(zhuǎn)移到10mlDram玻璃杯中并冷凍分離出的脂質(zhì)通過GLC分析GLC分析GLC分析按實施例11所述實施結(jié)果實驗設(shè)計如表33所示將以含有13.1％卵磷脂與6.6％膽固醇的大豆油為基礎(chǔ)的底物加熱到46℃。添加酶溶液并開始計時。反應(yīng)30，60和120分鐘后，取樣品做GLC分析。表33GLC結(jié)果如表34所示。結(jié)果以基于總樣品組分的百分比表示。以GLC結(jié)果為基礎(chǔ)，可計算出相對不加酶的對照樣品，通過酶反應(yīng)產(chǎn)生的脂肪酸與膽固醇酯的量。在這樣的實驗條件下，總體酶活性可以以水解活性(通過游離脂肪酸形成測定)與轉(zhuǎn)移酶活性(通過膽固醇酯形成估計)來評價。從這些結(jié)果以及脂肪酸與膽固醇酯的分子量信息可計算出相對摩爾水解活性與相對摩爾轉(zhuǎn)移酶活性，如表35所示。表34酶反應(yīng)時間脂肪酸膽固醇膽固醇酯分％％％對照1200.5337.0940.000#179300.7705.7612.229#179600.8525.3692.883#1791200.8764.9003.667#2427303.2697.0940.000#2427603.4207.0940.000#24271203.7107.0940.000#1991302.8717.0940.000#1991603.5787.0940.000#19911203.9287.0940.000#2373301.4187.0940.000#2373601.4217.0940.000#23731201.9157.0940.000表35結(jié)論在這些實驗中可觀察到所有被檢測的酶都表現(xiàn)有水解活性，這是由于脂肪酸的量增加。但只有來自殺鮭氣單胞菌的GCAT表現(xiàn)出轉(zhuǎn)移酶活性。因此推論在具有卵磷脂與膽固醇的、含6％水的油性體系中，來自尖鐮孢的磷脂酶A1，來自胰腺的磷脂酶A2和來自南極念珠菌的脂酶只有水解活性。上面說明書中提及的所有公開的內(nèi)容包含在本文中作為參考。本發(fā)明方法和體系的不同修飾和改變對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是清楚的而不會偏離本發(fā)明的范圍和精神。盡管本發(fā)明根據(jù)優(yōu)選的具體實施方案進行了描述，但本發(fā)明權(quán)利要求保護的范圍不應(yīng)該不適當?shù)叵抻谶@些特殊的具體實施方案是可以理解的。事實上，對用于實現(xiàn)發(fā)明的所述模式的各種修飾對于生物化學(xué)領(lǐng)域和生物工程學(xué)領(lǐng)域或相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是清楚明白的，意圖包含在下面的權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。布達佩斯條約關(guān)于用于專利程序的國際認可的微生物保藏國際局表格丹尼斯科公司(DaniscoA/S)Langebrogade1DK-1001Copenhagen丹麥保藏人的姓名和地址1當適用于細則6.4(d)時，所述的日期為國際保藏單位的資格被認定的日期。表格sp/4(只此一頁)布達佩斯條約關(guān)于用于專利程序的國際認可的微生物保藏國際局表格丹尼斯科公司(DaniscoA/S)存活證明Langebrogade1由下一頁所指明的國際保DK-1001Copenhagen藏單位根據(jù)細則10.2出具丹麥應(yīng)接到此存活證明的單位的名稱和地址1指的是初始保藏日，或者，當進行了新的保藏或保藏的轉(zhuǎn)換時，指的是最相關(guān)的日期(新保藏的日期或是轉(zhuǎn)保藏的日期)。2對于那些法規(guī)10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情況，指的是最近的存活性檢驗。3用打叉表示選定。4如果要求該信息并且如果檢驗為陰性，則填寫此項。布達佩斯條約關(guān)于用于專利程序的國際認可的微生物保藏國際局表格丹尼斯科公司(DaniscoA/S)Langebrogade1DK-1001Copenhagen丹麥保藏人的姓名和地址當適用于細則6.4(d)時，所述的日期為國際保藏單位的資格被認定的日期。表格sp/4(只此一頁)布達佩斯條約關(guān)于用于專利程序的國際認可的微生物保藏國際局表格丹尼斯科公司(DaniscoA/S)存活證明Langebrogade1由下一頁所指明的國際保DK-1001Copenhagen藏單位根據(jù)細則10.2出具丹麥應(yīng)接到此存活證明的單位的名稱和地址1指的是初始保藏日，或者，當進行了新的保藏或保藏的轉(zhuǎn)換時，指的是最相關(guān)的日期(新保藏的日期或是轉(zhuǎn)保藏的日期)。2對于那些法規(guī)10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情況，指的是最近的存活性檢驗。3用打叉表示選定。4如果要求該信息并且如果檢驗為陰性，則填寫此項。序列表<110>丹尼斯科公司(DaniscoA/S)<120>方法<130>p015574WOAAW<140>PCT/IB2004/000655<141>2004-01-15<150>GB0301121.0<151>2003-01-17<150>GB0301122.8<151>2003-01-17<150>GB0301117.8<151>2003-01-17<150>GB0301120.2<151>2003-01-17<150>GB0301119.4<151>2003-01-17<150>GB0301118.6<151>2003-01-17<150>GB030330016.7<151>2003-12-24<150>US60/489441<151>2003-07-23<160>54<170>PatentInversion3.0<210>1<211>361<212>PRT<213>人工<220><223>共有序列<400>1IleValAlaPheGlyAspSerLeuThrAspGlyGluAlaTyrTyrGly151015AspSerAspGlyGlyGlyTrpGlyAlaGlyLeuAlaAspArgLeuThr202530AlaLeuLeuArgLeuArgAlaArgProArgGlyValAspValPheAsn354045ArgGlyIleSerGlyArgThrSerAspGlyArgLeuIleValAspAla505560LeuValAlaLeuLeuPheLeuAlaGlnSerLeuGlyLeuProAsnLeu65707580ProProTyrLeuSerGlyAspPheLeuArgGlyAlaAsnPheAlaSer859095AlaGlyAlaThrIleLeuProThrSerGlyProPheLeuIleGlnVal100105110GlnPheLysAspPheLysSerGlnValLeuGluLeuArgGlnAlaLeu115120125GlyLeuLeuGlnGluLeuLeuArgLeuLeuProValLeuAspAlaLys130135140SerProAspLeuValThrIleMetIleGlyThrAsnAspLeuIleThr145150155160SerAlaPhePheGlyProLysSerThrGluSerAspArgAsnValSer165170175ValProGluPheLysAspAsnLeuArgGlnLeuIleLysArgLeuArg180185190SerAsnAsnGlyAlaArgIleIleValLeuIleThrLeuValIleLeu195200205AsnLeuGlyProLeuGlyCysLeuProLeuLysLeuAlaLeuAlaLeu210215220AlaSerSerLysAsnValAspAlaSerGlyCysLeuGluArgLeuAsn225230235240GluAlaValAlaAspPheAsnGluAlaLeuArgGluLeuAlaIleSer245250255LysLeuGluAspGlnLeuArgLysAspGlyLeuProAspValLysGly260265270AlaAspValProTyrValAspLeuTyrSerIlePheGlnAspLeuAsp275280285GlyIleGlnAsnProSerAlaTyrValTyrGlyPheGluThrThrLys290295300AlaCysCysGlyTyrGlyGlyArgTyrAsnTyrAsnArgValCysGly305310315320AsnAlaGlyLeuCysAsnValThrAlaLysAlaCysAsnProSerSer325330335TyrLeuLeuSerPheLeuPheTrpAspGlyPheHisProSerGluLys340345350GlyTyrLysAlaValAlaGluAlaLeu355360<210>2<211>335<212>PRT<213>嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)<400>2MetLysLysTrpPheValCysLeuLeuGlyLeuValAlaLeuThrVal151015GlnAlaAlaAspSerArgProAlaPheSerArgIleValMetPheGly202530AspSerLeuSerAspThrGlyLysMetTyrSerLysMetArgGlyTyr354045LeuProSerSerProProTyrTyrGluGlyArgPheSerAsnGlyPro505560ValTrpLeuGluGlnLeuThrAsnGluPheProGlyLeuThrIleAla65707580AsnGluAlaGluGlyGlyProThrAlaValAlaTyrAsnLysIleSer859095TrpAsnProLysTyrGlnValIleAsnAsnLeuAspTyrGluValThr100105110GlnPheLeuGlnLysAspSerPheLysProAspAspLeuValIleLeu115120125TrpValGlyAlaAsnAspTyrLeuAlaTyrGlyTrpAsnThrGluGln130135140AspAlaLysArgValArgAspAlaIleSerAspAlaAlaAsnArgMet145150155160ValLeuAsnGlyAlaLysGluIleLeuLeuPheAsnLeuProAspLeu165170175GlyGlnAsnProSerAlaArgSerGlnLysValValGluAlaAlaSer180185190HisValSerAlaTyrHisAsnGlnLeuLeuLeuAsnLeuAlaArgGln195200205LeuAlaProThrGlyMetValLysLeuPheGluIleAspLysGlnPhe210215220AlaGluMetLeuArgAspProGlnAsnPheGlyLeuSerAspGlnArg225230235240AsnAlaCysTyrGlyGlySerTyrValTrpLysProPheAlaSerArg245250255SerAlaSerThrAspSerGlnLeuSerAlaPheAsnProGlnGluArg260265270LeuAlaIleAlaGlyAsnProLeuLeuAlaGlnAlaValAlaSerPro275280285MetAlaAlaArgSerAlaSerThrLeuAsnCysGluGlyLysMetPhe290295300TrpAspGlnValHisProThrThrValValHisAlaAlaLeuSerGlu305310315320ProAlaAlaThrPheIleGluSerGlnTyrGluPheLeuAlaHis325330335<210>3<211>336<212>PRT<213>殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonicida)<400>3MetLysLysTrpPheValCysLeuLeuGlyLeuIleAlaLeuThrVal151015GlnAlaAlaAspThrArgProAlaPheSerArgIleValMetPheGly202530AspSerLeuSerAspThrGlyLysMetTyrSerLysMetArgGlyTyr354045LeuProSerSerProProTyrTyrGluGlyArgPheSerAsnGlyPro505560ValTrpLeuGluGlnLeuThrLysGlnPheProGlyLeuThrIleAla65707580AsnGluAlaGluGlyGlyAlaThrAlaValAlaTyrAsnLysIleSer859095TrpAsnProLysTyrGlnValTyrAsnAsnLeuAspTyrGluValThr100105110GlnPheLeuGlnLysAspSerPheLysProAspAspLeuValIleLeu115120125TrpValGlyAlaAsnAspTyrLeuAlaTyrGlyTrpAsnThrGluGln130135140AspAlaLysArgValArgAspAlaIleSerAspAlaAlaAsnArgMet145150155160ValLeuAsnGlyAlaLysGlnIleLeuLeuPheAsnLeuProAspLeu165170175GlyGlnAsnProSerAlaArgSerGlnLysValValGluAlaValSer180185190HisValSerAlaTyrHisAsnLysLeuLeuLeuAsnLeuAlaArgGln195200205LeuAlaProThrGlyMetValLysLeuPheGluIleAspLysGlnPhe210215220AlaGluMetLeuArgAspProGlnAsnPheGlyLeuSerAspValGlu225230235240AsnProCysTyrAspGlyGlyTyrValTrpLysProPheAlaThrArg245250255SerValSerThrAspArgGlnLeuSerAlaPheSerProGlnGluArg260265270LeuAlaIleAlaGlyAsnProLeuLeuAlaGlnAlaValAlaSerPro275280285MetAlaArgArgSerAlaSerProLeuAsnCysGluGlyLysMetPhe290295300TrpAspGlnValHisProThrThrValValHisAlaAlaLeuSerGlu305310315320ArgAlaAlaThrPheIleGluThrGlnTyrGluPheLeuAlaHisGly325330335<210>4<211>295<212>PRT<213>天藍色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)<400>4MetProLysProAlaLeuArgArgValMetThrAlaThrValAlaAla151015ValGlyThrLeuAlaLeuGlyLeuThrAspAlaThrAlaHisAlaAla202530ProAlaGlnAlaThrProThrLeuAspTyrValAlaLeuGlyAspSer354045TyrSerAlaGlySerGlyValLeuProValAspProAlaAsnLeuLeu505560CysLeuArgSerThrAlaAsnTyrProHisValIleAlaAspThrThr65707580GlyAlaArgLeuThrAspValThrCysGlyAlaAlaGlnThrAlaAsp859095PheThrArgAlaGlnTyrProGlyValAlaProGlnLeuAspAlaLeu100105110GlyThrGlyThrAspLeuValThrLeuThrIleGlyGlyAsnAspAsn115120125SerThrPheIleAsnAlaIleThrAlaCysGlyThrAlaGlyValLeu130135140SerGlyGlyLysGlySerProCysLysAspArgHisGlyThrSerPhe145150155160AspAspGluIleGluAlaAsnThrTyrProAlaLeuLysGluAlaLeu165170175LeuGlyValArgAlaArgAlaProHisAlaArgValAlaAlaLeuGly180185190TyrProTrpIleThrProAlaThrAlaAspProSerCysPheLeuLys195200205LeuProLeuAlaAlaGlyAspValProTyrLeuArgAlaIleGlnAla210215220HisLeuAsnAspAlaValArgArgAlaAlaGluGluThrGlyAlaThr225230235240TyrValAspPheSerGlyValSerAspGlyHisAspAlaCysGluAla245250255ProGlyThrArgTrpIleGluProLeuLeuPheGlyHisSerLeuVal260265270ProValHisProAsnAlaLeuGlyGluArgArgMetAlaGluHisThr275280285MetAspValLeuGlyLeuAsp290295<210>5<211>295<212>PRT<213>天藍色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)<400>5MetProLysProAlaLeuArgArgValMetThrAlaThrValAlaAla151015ValGlyThrLeuAlaLeuGlyLeuThrAspAlaThrAlaHisAlaAla202530ProAlaGlnAlaThrProThrLeuAspTyrValAlaLeuGlyAspSer354045TyrSerAlaGlySerGlyValLeuProValAspProAlaAsnLeuLeu505560CysLeuArgSerThrAlaAsnTyrProHisValIleAlaAspThrThr65707580GlyAlaArgLeuThrAspValThrCysGlyAlaAlaGlnThrAlaAsp859095PheThrArgAlaGlnTyrProGlyValAlaProGlnLeuAspAlaLeu100105110GlyThrGlyThrAspLeuValThrLeuThrIleGlyGlyAsnAspAsn115120125SerThrPheIleAsnAlaIleThrAlaCysGlyThrAlaGlyValLeu130135140SerGlyGlyLysGlySerProCysLysAspArgHisGlyThrSerPhe145150155160AspAspGluIleGluAlaAsnThrTyrProAlaLeuLysGluAlaLeu165170175LeuGlyValArgAlaArgAlaProHisAlaArgValAlaAlaLeuGly180185190TyrProTrpIleThrProAlaThrAlaAspProSerCysPheLeuLys195200205LeuProLeuAlaAlaGlyAspValProTyrLeuArgAlaIleGlnAla210215220HisLeuAsnAspAlaValArgArgAlaAlaGluGluThrGlyAlaThr225230235240TyrValAspPheSerGlyValSerAspGlyHisAspAlaCysGluAla245250255ProGlyThrArgTrpIleGluProLeuLeuPheGlyHisSerLeuVal260265270ProValHisProAsnAlaLeuGlyGluArgArgMetAlaGluHisThr275280285MetAspValLeuGlyLeuAsp290295<210>6<211>238<212>PRT<213>釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)<400>6MetAspTyrGluLysPheLeuLeuPheGlyAspSerIleThrGluPhe151015AlaPheAsnThrArgProIleGluAspGlyLysAspGlnTyrAlaLeu202530GlyAlaAlaLeuValAsnGluTyrThrArgLysMetAspIleLeuGln354045ArgGlyPheLysGlyTyrThrSerArgTrpAlaLeuLysIleLeuPro505560GluIleLeuLysHisGluSerAsnIleValMetAlaThrIlePheLeu65707580GlyAlaAsnAspAlaCysSerAlaGlyProGlnSerValProLeuPro859095GluPheIleAspAsnIleArgGlnMetValSerLeuMetLysSerTyr100105110HisIleArgProIleIleIleGlyProGlyLeuValAspArgGluLys115120125TrpGluLysGluLysSerGluGluIleAlaLeuGlyTyrPheArgThr130135140AsnGluAsnPheAlaIleTyrSerAspAlaLeuAlaLysLeuAlaAsn145150155160GluGluLysValProPheValAlaLeuAsnLysAlaPheGlnGlnGlu165170175GlyGlyAspAlaTrpGlnGlnLeuLeuThrAspGlyLeuHisPheSer180185190GlyLysGlyTyrLysIlePheHisAspGluLeuLeuLysValIleGlu195200205ThrPheTyrProGlnTyrHisProLysAsnMetGlnTyrLysLeuLys210215220AspTrpArgAspValLeuAspAspGlySerAsnIleMetSer225230235<210>7<211>1005<212>DNA<213>嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)<400>7atgaaaaaatggtttgtgtgtttattgggattggtcgcgctgacagttcaggcagccgac60agccgtcccgccttctcccggatcgtgatgtttggcgacagcctctccgataccggcaag120atgtacagcaagatgcgcggttacctcccctccagccccccctactatgagggccgcttc180tccaacgggcccgtctggctggagca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cacggttactgatagaccggataccgacct421tgtgcctcgtcctacggttcgcccaagcgctacggtagtcgctacgccggttggcgtacc481atgacttgccacggttcgtctatgacgacaagttggacggcctagacccggtcttgggca541gtcgagcgtcagtcttccaccagctccgccagtcggtacagaggcggatagtgttggtcg601acgacgacttggaccgtgcggtcgaccgggggtggccgtaccatttcgacaagctctagc661tgttcgttaaacggctctacgacgcactaggcgtcttgaagccggactcgctgcagctct721tggggacgatgctgccgccgatacacaccttcggcaaacggtgggcgtcgcagtcgtggc781tggcggtcgagaggcggaagtcaggcgtccttgcggagcggtagcggccgttgggcgacg841accgtgtccggcaacggtcaggataccgggcggcgtcgcggtcgggggagttgacactcc901cgttctacaagaccctagtccatgtgggctggtgacagcacgtgcgtcgggactcgctcg961cgcggcggtggaagtagcgcttggtcatgctcaaggagcgggtgact1008<210>56<211>1011<212>DNA<213>殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonicida)(SeqID35底鏈)<400>56tacttttttaccaaacaaacaaataaccccaactagcgcgactgtcaagtccgtcggctg60tgagcggggcggaagagggcctagcactacaagccgctgtcggagaggctatggccgttt120tacatgtcgttctacgcgccaatggaggggaggtcgggcgggatgatactcccggcaaag180aggttgcctgggcagaccgacctcgtcgactggttcgtcaagggcccagactggtagcgg240ttgcttcgccttccgccacggtgacggcaccgaatgttgttctagaggaccttagggttc300atagtccagtagttgttggacctgatgctccagtgggtcaagaacgtctttctgtcgaag360ttcggcctgctagaccactaggagacccagccacggttactgatagaccgtataccgacc420ttatgcctcgtcctacggttcgctcaagcgctacggtagtcgctacgccggttggcgtac480catgacttgccacggttcgtctatgacgacaagttggacggcctagacccggtcttgggc540agtcgggcgtcagtcttccaccagctccgccagtcggtacagaggcggatagtgttgttc600gacgacgacttggaccgtgcggtcgaccgggggtggccgtaccatttcgacaagctctag660ctgttcgttaaacggctctacgacgcactaggcgtcttgaagccggactcgctgcagctc720ttggggacgatgctgccgccgatacacaccttcggcaaacggtgggcgtcgcagtcgtgg780ctggcggtcgagaggcggaagtcaggcgtccttgcggagcggtagcggccgttgggcgac840gaccgtgtccggcaacggtcaggataccgggcggcgtcgcggtcgggggagttgacactc900ccgttctacaagaccctagtccatgtgggctggtgacagcacgtgcgtcgggactcgctc960gcgcggcggtggaagtagctctgggtcatgctcaaggagcgggtgcctact1011<210>57<211>35<212>DNA<213>人工<220><223>PCR引物<400>57agcatatgaaaaaatggtttgtttgtttattgggg35<210>58<211>1047<212>DNA<213>嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)(seqID54底鏈)<400>58tacaaattcaaatttttcttaaagaatcaacctaatagccgtcgaaattactcataatcg60aacaaaagccgttggcggagacgtcgatcgcggctgtcggcagggcggaaaagggcctag120cactacaagccgctgtcggagaggctatggccgttttacatgtcgttctacgcgccaatg180gaggggaggtcgggcgggatgatactcccggcaaagaggttgcctgggcagaccgacctc240gtcgactggtttgtcaagggcccagactggtagcggttgcttcgccttccgccacggtga300cggcaccgaatgttgttctagaggaccttagggttcatagtccagtagttgttggacctg360atgctccagtgggtcaagaacgtctttctgtcgaagttcggcctgctagaccactaggag420acccagccacggttactgatagaccggataccgaccttgtgcctcgtcctacggttcgcc480caagcgctacggtagtcgctacgccggttggcgtaccatgacttgccacggttcgtctat540gacgacaagttggacggcctagacccggtcttgggcagtcgagcgtcagtcttccaccag600ctccgccagtcggtacagaggcggatagtgttggtcgacgacgacttggaccgtgcggtc660gaccgggggtggccgtaccatttcgacaagctctagctgttcgttaaacggctctacgac720gcactaggcgtcttgaagccggactcgctgcagctcttggggacgatgctgccgccgata780cacaccttcggcaaacggtgggcgtcgcagtcgtggctggcggtcgagaggcggaagtca840ggcgtccttgcggagcggtagcggccgttgggcgacgaccgtgtccggcaacggtcagga900taccgggcggcgtcgcggtcgggggagttgacactcccgttctacaagaccctagtccat960gtgggctggtgacagcacgtgcgtcgggactcgctcgcgcggcggtggaagtagcgcttg1020gtcatgctcaaggagcgggtgactact1047<210>59<211>8<212>PRT<213>人工<220><223>區(qū)1GDSX區(qū)(說明書18頁的序列)<220><221>NON_CONS<222>(1)..(8)<223>X是疏水殘基，其選自Met，Ile，Leu，Val，Ala，Gly，Cys，His，Lys，Trp，Tyr或Phe<400>59XaaXaaXaaXaaGlyAspSerXaa15<210>60<211>6<212>PRT<213>人工<220><223>區(qū)2GANDY區(qū)(說明書18頁的序列)<220><221>NON_CONS<222>(1)..(6)<223>X是疏水殘基，其選自Met，Ile，Leu，Val，Ala，Gly，Cys，His，Lys，Trp，Tyr或Phe<400>60XaaGlyXaaAsnAspXaa1權(quán)利要求1.脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶用于從食物原料制備包含乳化劑的烘烤產(chǎn)品或面團制品中的用途，其中所述乳化劑通過脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶從食物原料的組分產(chǎn)生。2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述面團制品或烘烤產(chǎn)品是面包、油炸制品、小吃、蛋糕、餡餅、胡桃巧克力小方餅、曲奇、面條、休閑零食品或面食制品。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的用途，其中所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶是這樣的酶(a)當利用高水分蛋黃中的轉(zhuǎn)移酶測定法在含有54％水分的蛋黃中進行測定時，所述的酶具有多至100％的相對轉(zhuǎn)移酶活性；(b)當利用經(jīng)緩沖的底物中的轉(zhuǎn)移酶測定法進行測定時，所述的酶具有至少2％的?；D(zhuǎn)移酶活性；或(c)當利用低水分環(huán)境中的轉(zhuǎn)移酶測定法進行測定時，所述的酶具有至少1％的相對轉(zhuǎn)移酶活性。4.制備包含乳化劑的烘烤產(chǎn)品或面團制品的方法，其中所述方法包括將脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶添加于面團制品或烘烤產(chǎn)品的步驟。5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述面團制品或烘烤產(chǎn)品是面包、油炸制品、小吃、蛋糕、餡餅、胡桃巧克力小方餅、曲奇、面條、休閑零食品或面食制品。6.根據(jù)權(quán)利要求4-5中任一項的方法，其中所述脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶是這樣的酶(a)當利用高水分蛋黃中的轉(zhuǎn)移酶測定法在含有54％水分的蛋黃中進行測定時，所述的酶具有多至100％的相對轉(zhuǎn)移酶活性；(b)當利用經(jīng)緩沖的底物中的轉(zhuǎn)移酶測定法進行測定時，所述的酶具有至少2％的酰基轉(zhuǎn)移酶活性；或(c)當利用低水分環(huán)境中的轉(zhuǎn)移酶測定法進行測定時，所述的酶具有至少1％的相對轉(zhuǎn)移酶活性。7.含有脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的食品酶組合物或飼料酶組合物。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的食品酶組合物或飼料酶組合物，其中所述脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶是這樣的酶(a)當利用高水分蛋黃中的轉(zhuǎn)移酶測定法在含有54％水分的蛋黃中進行測定時，所述的酶具有多至100％的相對轉(zhuǎn)移酶活性；(b)當利用經(jīng)緩沖的底物中的轉(zhuǎn)移酶測定法進行測定時，所述的酶具有至少2％的?；D(zhuǎn)移酶活性；或(c)當利用低水分環(huán)境中的轉(zhuǎn)移酶測定法進行測定時，所述的酶具有至少1％的相對轉(zhuǎn)移酶活性。9.根據(jù)權(quán)利要求7-8中任一項的食品酶組合物或飼料酶組合物依照權(quán)利要求1-3中任一項的用途或在根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一項的方法中的用途。10.通過根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一項的方法可獲得的食品。全文摘要本發(fā)明涉及使用脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶產(chǎn)生乳化劑的方法。一種在原位產(chǎn)生乳化劑的方法，其中將脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶添加到食品中。優(yōu)選地乳化劑的產(chǎn)生不增加或基本不增加所述食品中游離脂肪酸含量。優(yōu)選地，脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可將脂質(zhì)上的酰基轉(zhuǎn)移到一種或多種下列?；荏w固醇、甾烷醇、碳水化合物、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)亞單位、甘油。優(yōu)選地，除乳化劑以外，可能產(chǎn)生一種或多種甾烷醇酯，或蛋白質(zhì)酯，或碳水化合物酯，或甘油二酯，或甘油單酯。它們中的一種或多種也可以作為附加乳化劑。文檔編號A23K1/165GK101606646SQ20091013430公開日2009年12月23日申請日期2004年1月15日優(yōu)先權(quán)日2003年1月17日發(fā)明者阿爾諾·D·克賴杰,蘇珊·M·馬德里德,喬恩·D·米克爾森,喬恩·B·索申請人:丹尼斯科公司