專利名稱：：生菜hppd蛋白編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及的是一種基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
的蛋白編碼序列，具體地，本發(fā)明涉及一種生菜HPPD蛋白編碼序列。
背景技術(shù)：
：自1922年維生素E的生物學(xué)功能被發(fā)現(xiàn)后，長(zhǎng)期醫(yī)學(xué)研究表明，維生素E不僅僅與生殖系統(tǒng)有關(guān)，而且與中樞神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和肌肉系統(tǒng)的正常代謝都有密切關(guān)系(TraberandSies，1996)。維生素E是一種脂類維生素，其天然產(chǎn)物依結(jié)構(gòu)的不同分為八種類型，分別是ci、e、Y、S-生育酚(tocopherol)和a、e、Y、S-生育三烯酚(tocotrienol)，其中a-生育酚的生物活性最高，被認(rèn)為是維生素E的主要活性成分。維生素E參與細(xì)胞膜的構(gòu)建和維持，是動(dòng)物和人體內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)。維生素E是治療冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化等心腦血管疾病的重要輔助性藥物，有助于降低血脂和血膽固醇含量，抗凝血、抗氧化并且消除自由基，從而起到預(yù)防及治療血管栓塞的作用。維生素E對(duì)于提高機(jī)體免疫能力有著重要的影響，具有抗衰老的功能，可以消除細(xì)胞色素沉淀，改善皮膚彈性，減弱性腺萎縮，因而在大量保健品和美容用品中廣泛使用。維生素E可以預(yù)防和治療多種婦科疾病，治療早產(chǎn)兒溶血性貧血和蠶豆病，治療營(yíng)養(yǎng)不良兒童的巨幼紅細(xì)胞性貧血。維生素E可以促進(jìn)膽汁分泌、膽管形成和膽紅素分泌，對(duì)急慢性肝炎和肝硬化有著治療作用。維生素E可以預(yù)防癌癥發(fā)生，對(duì)于癌癥患者的治療也有重要的輔助作用。維生素E對(duì)于人類和動(dòng)物健康有重要作用，但維生素E的合成途徑只存在于綠色光合植物中，包括低等單細(xì)胞植物藍(lán)藻和高等植物；人體和動(dòng)物體內(nèi)不存在維生素E合成途徑，故而日常營(yíng)養(yǎng)所需的維生素E攝取自綠色植物，特別是各種油類作物的種子，以及由種子所榨取的植物油。直接由植物油脫臭餾出物中獲得的生育酚混縮液的生物活性很低，a-生育酚的含量較低。工業(yè)生產(chǎn)維生素E主要是以上述生育酚混縮液為原料，經(jīng)過半合成法，將其中的非a-生育酚成分轉(zhuǎn)變?yōu)閍-生育酚。但是成本較高，而且產(chǎn)生的a-生育酚消旋性與天然a-生育酚不同，活性也低于天然a-生育酚。因此，提高植物天然生育酚含量及其a-生育酚比例具有很重要的應(yīng)用價(jià)值。隨著近年來植物基因組學(xué)的發(fā)展，DellaPenna于1999年提出了營(yíng)養(yǎng)基因組學(xué)(nutritionalgenomics)的概念，即充分的利用基因組學(xué)的研究成果，分離植物營(yíng)養(yǎng)代謝途徑的關(guān)鍵酶基因，解析植物微量營(yíng)養(yǎng)素代謝途徑，深入了解代謝途徑的調(diào)控方式，從而利用代謝工程的方法和手段改良作物品質(zhì)，提高作物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值?；诨蚪M學(xué)的基礎(chǔ)，維生素E合成途徑的基因分離、克隆和功能性研究已經(jīng)取得了突破性的進(jìn)展。人們已經(jīng)初步完成了對(duì)參與維生素E合成途徑關(guān)鍵基因的分離和功能驗(yàn)證工作，初步分析了維生素E(生育酚)合成途徑概貌。維生素E(生育酚)合成途徑主要由以下五個(gè)步驟組成。(1)4-羥苯丙酮酸(HPP)在4-羥苯丙酮酸二加氧酶(HPPD)的催化下，生成尿黑酸(HGA)(Norrisetal.，1998);(2)尿黑酸在尿黑酸植基異戊烯轉(zhuǎn)移酶(HPT)催化下，與植基二磷酸(PDP)發(fā)生縮合，生成2-甲基-6-植基-苯醌(CollakovaandDellaPenna，2001);(3)2-甲基-6-植基-苯醌在甲基植基苯醌甲基轉(zhuǎn)移酶(MPBQMT)的催化下，生成2,3-二甲基-6-植基-苯醌(vanEenennaametal.，2003);(4)2，3-二甲基-6-植基-苯醌在生育酚環(huán)化酶(TC)的催化下，生成y-生育酚(Porfirovaetal.，2002);(5)y-生育酚在y-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶(y-TMT)的催化下，生成a-生育酚。在對(duì)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的分析中，至今尚未發(fā)現(xiàn)有利用基因工程技術(shù)對(duì)生菜提高植物中維生素E含量的技術(shù)措施，也未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明提及的生菜HPPD蛋白序列及其核酸序列相關(guān)的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種生菜HPPD蛋白編碼序列。該基因編碼4-羥苯丙酮酸二加氧酶(HPPD),它參與維生素E的合成代謝途徑；生菜HPPD蛋白在利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高植物維生素E上的應(yīng)用。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有生菜HPPD蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列由SEQIDNO.3中第197-1534位的核苷酸序列構(gòu)成，至少70%的同源性。所述的核苷酸序列由SEQIDNO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物構(gòu)成。所述的多肽是具有SEQIDNO.4序列的多肽。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種利用具有生菜HPPD蛋白核苷酸序列轉(zhuǎn)化入植物提高植物維生素E含量的方法，其步驟如下(1)將編碼具有生菜HPPD蛋白活性的多肽的純化的核苷酸序列連于植物表達(dá)調(diào)控序列，形成含生菜HPPD蛋白基因的植物表達(dá)載體；(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，將含表達(dá)載體的農(nóng)桿菌通過浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥；(3)再通過抗生素篩選，獲得含有生菜HPPD蛋白基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞并最終再生轉(zhuǎn)基因植株及其包括植物種子及植物組織的后代。含有生菜HPPD蛋白基因的轉(zhuǎn)基因植株中維生素E的含量有了顯著提高。較佳地，在該方法中使用的核酸序列具有SEQIDNO.3中第197-1534位的序列。在本發(fā)明中，"分離的"、"純化的"DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。在本發(fā)明中，術(shù)語"生菜HPPD蛋白(或多肽)編碼序列"指編碼具有生菜HPTO蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQIDNO.3中第197-1534位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQIDNO.3序列的編碼框第197-1534位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。該術(shù)語還包括能編碼具有與天然的生菜HPPD相同功能的蛋白的SEQIDNO.3中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。5在本發(fā)明中，術(shù)語"生菜HPPD蛋白(或多肽)"指具有生菜HPPD活性的SEQIDNO.4序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與生菜HPTO相同功能的、SEQIDNO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-IO個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為IO個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。本發(fā)明的生菜HPPD蛋白的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與編碼生菜HPPD蛋白的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗生菜HPPD蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。在本發(fā)明中，"生菜HPPD蛋白保守性變異多肽"指與SEQIDNO.4的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。如下表l表1最初的殘基代表性的取代優(yōu)選的取代Ala(A)ValLeu;lieValArg(R)LysGin;AsnLysAsn(N)GinHis;Lys;ArgGinAsp(D)GluGluCys(C)SerSerGin(Q)AsnAsnGlu(E)AspAspGly(G)Pro;AlaAlaHis(H)Asn;Gin;LysArgArglie(I)Leu;Val;MetAla;PheLeuLeu(L)lie;Val:MetAla:PhelieLys(K)Arg:Gin;AsnArgMet(M)Leu;Phe;lieLeuPhe(F)Leu;Val;lie;Ala;TyrLeuPro(P)AlaAlaSer(S)ThrThrThr(T)SerSerTrp(W)Tyr;PheTyr6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>發(fā)明還包括生菜HPPD蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然的生菜HPPD相關(guān)多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如e、Y-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的生菜HPPD蛋白多肽時(shí)，可以將生菜HPPD蛋白編碼序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成生菜HPPD蛋白表達(dá)載體。如本文所用，"可操作地連于"指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA;如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，"可操作地連于"意味著相鄰，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。在本發(fā)明中，術(shù)語"宿主細(xì)胞"為真核細(xì)胞。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、擬南芥細(xì)胞和其它植物細(xì)胞。此外，根據(jù)本發(fā)明的生菜HPPD的核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達(dá)蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選生菜HPPD蛋白相關(guān)同源基因或同源蛋白。本發(fā)明的生菜HPPD相關(guān)核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工化學(xué)合成的方法來合成有關(guān)序列。在本申請(qǐng)之前，現(xiàn)有技術(shù)己完全可以通過先合成多個(gè)多核苷酸小片段，然后再進(jìn)行連接而獲得編碼本發(fā)明中生菜HPPD相關(guān)蛋白的核酸序列。然后，可將該核酸序列引入本領(lǐng)域中各種現(xiàn)有的DNA分子(如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid-PhaseP印tideSynthesis,WHFreemanCo.,SanFrancisco;MerrifieldJ.(1963)J.AmChem.Soc85:2149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動(dòng)進(jìn)行。例如，可以用A卯liedBiosystems的431A型肽合成儀(FosterCity,CA)來自動(dòng)合成肽。可以分別化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長(zhǎng)的分子。利用本發(fā)明的生菜HPPD蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與HPTO蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，或者受體、抑制劑或拮抗劑等。本發(fā)明中所涉及的農(nóng)桿菌為根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株GV3101,該菌株可以從市場(chǎng)上公開購(gòu)買(來源于澳大利亞CAMBIA公司，菌株編號(hào)為Gambar3)。圖1為本發(fā)明的生菜HPPD蛋白的氨基酸序列與其他植物物種中HPPD相關(guān)蛋白的氨基酸序列的同源比較列表。其中，相同的氨基酸在不同多肽序列之間用氨基酸單字符標(biāo)出。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1生菜HPPD基因的克隆1.RNA的提取(RNAextraction)取生菜葉片組織，置于液氮中研碎，加入盛有裂解液的1.5mLEppendorf(EP)離心管中，充分振蕩后，按照TIANGEN試劑盒的說明書抽提總RNA。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計(jì)上測(cè)定RNA含量。2.基因的全長(zhǎng)克隆(CloningofFull-lengthcDNA)根據(jù)擬南芥中相關(guān)基因所編碼的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE(RapidAmplificationofcDNAEnds)方法(Clontech)試劑盒)進(jìn)行cDNA全長(zhǎng)克隆，分三個(gè)階段進(jìn)行(1)首鏈cDNA的合成-利用Clontech試劑盒所提供的5'-CDSprimerA和SMART2Aoligo引物，以所提取的總RNA為模板，在PowerScript反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成5'-RACE-ReadycDNA;利用Clontech試劑盒所提供的3'-CDSprimerA為引物，以所提取的總RNA為模板，在PowerScript反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成3'-RACE-ReadycDNA。(2)3，-RACE:用Clontech試劑盒提供的通用引物序列(UPM)和利用擬南芥同源區(qū)設(shè)計(jì)的基因特異引物2(GSP2)(SEQIDNO.1)進(jìn)行3'-RACEPCR反應(yīng)。用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，將膠回收的目的片段連接到pMD18-T載體上進(jìn)行測(cè)序。(3)5，-RACE:用Clontech試劑盒提供的通用引物序列(UPM)和利用擬南芥同源區(qū)設(shè)計(jì)的基因特異引物1(GSP1)(SEQIDNO.2)進(jìn)行5'-RACEPCR反應(yīng)。用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，將膠回收的目的片段連接到pMD18-T載體上進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果的重疊區(qū)拼接，得到該基因的完整編碼區(qū)序列。BLAST分析及測(cè)序結(jié)果證明從生菜中得到的基因確為HPPD基因。通過上述步驟，獲得了生菜中參與維生素E合成的HPPD蛋白的全長(zhǎng)編碼序列(SEQIDNO.3)。其中，(ATG)與終止密碼子(TGA)在SEQIDNO.3中用下劃線標(biāo)出。實(shí)施例2生菜HPPD相關(guān)基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明中得到的新的生菜HPPD的全長(zhǎng)cDNA長(zhǎng)度為1743bp，詳細(xì)序列見SEQIDNO.3，其中開放閱讀框位于197-1534位核苷酸(1338個(gè)核苷酸)。根據(jù)所獲得的cDNA推導(dǎo)出生菜HPPD的氨基酸序列，共446個(gè)氨基酸殘基，分子量為49kD，等電點(diǎn)為5.34。詳細(xì)序列見SEQIDNO.4。利用vectorNTI9.0軟件對(duì)來源于各種植物的HPPD的相關(guān)氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，克隆到的生菜HPPD基因與蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)，油菜(Brassicar鄰a)，古月蘿卜(Daucuscarota)，大豆(Glycinemax)，擬南芥(Arabidopsisthaliana)，大麥(Hordeumvulgare)，小麥(Triticumaestivum)中同源基因所編碼的氨基酸序列相似性分別為77%，73%，73%，73%，68%,60%，59%(圖1)。由此可見，生菜HPPD基因與蒺藜苜蓿等物種中的HPPD相關(guān)基因在所編碼的氨基酸水平上存在較高的同源性，可以認(rèn)為它們的產(chǎn)物在功能上也有很高的相似性。實(shí)施例3生菜HPPD相關(guān)蛋白或多肽在擬南芥細(xì)胞中進(jìn)行真核細(xì)胞表達(dá)及轉(zhuǎn)基因植株的維生素E含量鑒定l.含目的基因(生菜HPTO基因)的表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)生菜HPPD的全長(zhǎng)編碼序列(SEQIDNO.3)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并在正反引物上分別引入BamHI和SacI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實(shí)施例1中獲得的5'-RACE-ReadycDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將生菜HPPD的編碼區(qū)序列連接至中間載體pMD18-T中進(jìn)行測(cè)序，再將測(cè)序正確的HPPD的編碼區(qū)序列進(jìn)一步克隆到表達(dá)載體pHB中，接著將其轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌(如GV3101,本實(shí)施例中所用為英國(guó)諾丁漢大學(xué)所贈(zèng))，并進(jìn)行PCR驗(yàn)證。結(jié)果表明，含生菜HPPD基因的植物表達(dá)載體已成功構(gòu)建到根癌農(nóng)桿菌菌株中。采用浸花(floral-dip)法轉(zhuǎn)化擬南芥。2.采用浸花(floral-dip)法轉(zhuǎn)化擬南芥1)取生長(zhǎng)一個(gè)月左右、生長(zhǎng)狀況良好的植株(轉(zhuǎn)化前可以提前一個(gè)星期將植物去頂，使植物產(chǎn)生較多的花苞，提高轉(zhuǎn)化效率)，轉(zhuǎn)化前一天澆水；2)將含有轉(zhuǎn)基因載體的農(nóng)桿菌于28。C培養(yǎng)過夜，至0D6。。"2.0，4，500卬m離心10min;3)菌體沉淀懸浮于新鮮配制的轉(zhuǎn)化液中，至終濃度0D6。。"0.8;4)轉(zhuǎn)化時(shí)小盆倒置，確保擬南芥地上部分全部花苞都被浸沒入事先用轉(zhuǎn)化Buffer懸浮好的菌液中約5sec;5)用吸水紙吸去多余的液體，將植物平放于一個(gè)密封的小盒內(nèi)以保持濕度，避光過夜；6)第二天將植物取出，豎直，轉(zhuǎn)移到正常條件下生長(zhǎng)。待植物長(zhǎng)至一定程度后，將其依附竹簽綁好，以便更好地結(jié)實(shí)；7)T。代種子成熟后將其整株剪下，過篩。種子鋪于含50pg/mL潮霉素(Hyg)的篩選培養(yǎng)基上，4'C春化48h，移到人工氣候室24h連續(xù)光照條件下生長(zhǎng)一周；8)待長(zhǎng)出綠色的轉(zhuǎn)基因抗性幼苗(轉(zhuǎn)化子為綠色的幼苗且根較長(zhǎng)；非轉(zhuǎn)化子基本為黃化苗，或綠色無根幼苗)后移栽入土繼續(xù)生長(zhǎng)；9)單株收獲轉(zhuǎn)基因植株(因轉(zhuǎn)基因的插入位點(diǎn)不同，每個(gè)都是不同的)標(biāo)成不同的株系；10)單株收獲的T2代種子已經(jīng)出現(xiàn)性狀分離。將種子均勻地鋪到9cm平板上，因要確定是否是單位點(diǎn)插入，所以不加抗生素。待長(zhǎng)至6-7片真葉后，噴除草劑，篩選3:1單位點(diǎn)插入的株系，單株收獲。繼續(xù)篩選直至獲得純合的轉(zhuǎn)基因植株。3.轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的PCR檢測(cè)根據(jù)CaMV35S的序列設(shè)計(jì)正向引物，根據(jù)HPPD的序列設(shè)計(jì)反向引物對(duì)目的基因進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，用CaMV35S正向引物和HPPD反向引物能擴(kuò)增出目的基因大小的特異DNA片段。而以非轉(zhuǎn)化擬南芥基因組DNA為模板時(shí)，沒有擴(kuò)增出11任何片段。實(shí)施例4利用HPLC-UVD測(cè)定轉(zhuǎn)基因擬南芥中維生素E含量1.HPLC-UVD條件及系統(tǒng)適用性以及標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制HPLC:采用Waters2695s印arationsmodule系統(tǒng)，色譜柱為C-18反相硅膠柱(CalesilODS-100C18,4.6mmI.D.X250mmlength)，流動(dòng)相為甲醇水，甲醇水的體積比為98:2，柱溫為3(TC，流速1.0raL/min，進(jìn)樣量3(^L。UVD:采用Waters2996photodiodearraydectector系統(tǒng)，紫外光檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)292nm。精密稱取生育酚標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司)2.0mg用lmL甲醇完全溶解，得到2mg/mL生育酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液，保存于-2(TC備用。本發(fā)明中流動(dòng)相為甲醇(methanol):水，比例為98%:2%時(shí)，生育酚的出峰時(shí)間為26.3min，峰型良好。2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將所述對(duì)照品溶液在相應(yīng)色譜條件下分別進(jìn)樣5pL，lOpL，15pL，20nL，30pL記錄圖譜及色譜參數(shù)，分別以峰面積(Y)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品含量(X,pg)進(jìn)行回歸分析。通過研究，本發(fā)明中生育酚在10-60ng范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的log-log線性關(guān)系。生育酚對(duì)照品的log-log線性回歸方程為Y=7.26e+002X+1.09e+004;R=0.999740。3.樣品的制備和生育酚含量的測(cè)定生育酚的提取過程如下取少量新鮮的擬南芥葉片(l-2g鮮重)，液氮研磨，用4mL正己垸提取，超聲30分鐘。離心，收集上清液，用氮吹儀吹干，用適量甲醇溶解提取物，用于HPLC檢測(cè)。采用HPLC-UVD測(cè)定生育酚含量，樣品進(jìn)樣體積為30^1,根據(jù)峰面積代入線形回歸方程計(jì)算出樣品中的生育酚含量(mg)，折合成物質(zhì)的量(pmol)，再除以樣品的擬南芥葉片鮮重(mg)，從而計(jì)算出擬南芥植株中生育酚的含量。在本發(fā)明中HPPD基因的轉(zhuǎn)化顯著提高了擬南芥葉片中維生素E含量，這使得轉(zhuǎn)基因植株中維生素E的含量超過對(duì)照的50y。以上。由此可見，HPPD基因可作為一種提高植物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的候選基因。用于利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高作物維生素E含量的研究和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中。本發(fā)明涉及的序列及記號(hào)分列如下(1)SEQIDNO.1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度:25bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQIDNO.15'-ATCCGCCGTCTTGATCACGCCGTAG-3'(2)SEQIDN0.2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度:27bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQIDNO.25'-CCGGCGCCTTCGTTGTGTTCCAGATAC-3(3)SEQIDNO.3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度:1743bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型核苷酸(iii)序列描述SEQIDNO.3(4)SEQIDN0.4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度446氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型:多肽(iii)序列描述SEQIDNO.4MGTEAKPSNVAGEQTGSAFKLVGFNNFIRTNPMSDKFSVKRFHHIGFWCSDATNTARRFSWGLGMPIVQKSDLSTGNATHASYLRSGQNFFTAPYSPSISSAVTSTTASIPSFSHTDCRNFTASHGAVRSVAIEVEDAEIAFSVSVSHGAKPSSSPITGNNDVVLSEVKYGDVVLRYIsYKNPNFDGISNFLPGFEPVEKTSSFPDDYGIRRDHAVGNVPEAPAVDYVKSITGFHEFAEFTAEDVGTSESGLNSVVLACNsEMVIPMNEPVYGTKRKSQIQTYEHNEGAGVQHLAAsEDIFRTREMRKRSGIGGEFMPSPPPTYYRNKNRVGDVTDEEIKECEELGIVDRDDQGTQIFTKPVGDRPTIFIEIIQRVGCMVKDGEGKVQQKAGCGGFGKGNFsEFKSIEEYEETLEARTTTEPTAAA權(quán)利要求1.一種生菜HPPD蛋白編碼序列，其特征在于，包括編碼具有生菜HPPD蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列由SEQIDNO.3中第197-1534位的核苷酸序列構(gòu)成，至少70％的同源性。2.如權(quán)利要求1所述的生菜HPPD蛋白編碼序列，其特征是，所述的核苷酸序列由SEQIDNO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物構(gòu)成。3.如權(quán)利要求1所述的生菜HPPD蛋白編碼序列，其特征是，所述的多肽是具有SEQIDNO.4序列的多肽。4.如權(quán)利要求1所述的生菜HPPD蛋白編碼序列轉(zhuǎn)化入植物提高植物維生素E含量的方法，其特征是，步驟如下(1)將編碼具有生菜HPPD蛋白活性的多肽的純化的核苷酸序列連于植物表達(dá)調(diào)控序列，形成含生菜HPPD蛋白基因的植物表達(dá)載體；(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，將含表達(dá)載體的農(nóng)桿菌通過浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥；(3)再通過抗生素篩選，獲得含有生菜HPPD蛋白基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞并最終再生轉(zhuǎn)基因植株及其包括植物種子及植物組織的后代。全文摘要本發(fā)明涉及一種基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
的生菜HPPD蛋白編碼序列。它包括編碼具有生菜HPPD蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列由SEQIDNO.3中第197-1534位的核苷酸序列構(gòu)成，至少70％的同源性。本發(fā)明轉(zhuǎn)化入植物提高植物維生素E含量的方法將編碼具有生菜HPPD蛋白活性的多肽的純化的核苷酸序列連于植物表達(dá)調(diào)控序列，形成含生菜HPPD蛋白基因的植物表達(dá)載體；將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，將含表達(dá)載體的農(nóng)桿菌通過浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥；再通過抗生素篩選，獲得含有生菜HPPD蛋白基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞并最終再生轉(zhuǎn)基因植株及其包括植物種子及植物組織的后代。本發(fā)明將所說的基因在植物中表達(dá)，所獲得的轉(zhuǎn)基因植物中維生素E的含量有了顯著的提高。文檔編號(hào)A01H1/00GK101586108SQ20081020344公開日2009年11月25日申請(qǐng)日期2008年11月27日優(yōu)先權(quán)日2008年11月27日發(fā)明者任薇薇,唐克軒,唐岳立申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)