專利名稱：一種防病植物內生枯草芽孢桿菌的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種植物內生枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)及其應用，屬于農作物防病控病技術領域。
背景技術：
植物內生細菌是能在健康植物組織內棲居，對植物不造成實質性危害而與植物建立了和諧聯(lián)合關系的微生物。一部分植物內生細菌還能使植物獲益，如固氮，促進植物生長或誘導植物抗病性等。實際上五十多年前已有關于植物體內存在內生細菌而不引起植物病癥的報道。從早期的研究至20世紀90年代，據(jù)不完全文獻統(tǒng)計，已從近30種植物中分離了近60個屬的內生細菌，其中約有2/3為革蘭氏陰性細菌，因此人們開始意識到大多數(shù)高等植物中普遍存在內生細菌。植物-內生細菌這種和諧共生，互利共棲的生命形式，可能是未來生態(tài)型農業(yè)發(fā)展的一條重要思路。所以，開展植物內生細菌的研究不僅對植物微生物學科的基礎研究有重要的理論價值，而且對農業(yè)可持續(xù)發(fā)展也有重要的實踐意義。
近年來的研究結果表明植物內生細菌不僅將棲居植物作為其棲息的場所，而且對棲居植物具有促生、防病、固氮等生物學作用，同時內生細菌還是將外源基因導入植物體內的良好載體。因此，植物內生細菌是植物病蟲害生物防治的天然資源菌，具有十分重要的理論研究和開發(fā)應用價值。植物內生細菌可以通過自然孔口和傷口進入植物體內，一株內生細菌可以在多種植物體內棲居生存。植物內生細菌與從土壤中分離到的拮抗細菌相比，具有不易受環(huán)境條件的影響，在植物體內具有穩(wěn)定的生存空間，可以在植物體內獨立的分裂繁殖和傳遞等優(yōu)勢，篩選有益的內生細菌有可能成為生物防治中最具潛力的微生物農藥、增產(chǎn)菌或作為潛在的生防載體菌而加以利用。利用內生細菌對土傳維管束病害進行生物防治的優(yōu)勢更為突出，由于土傳維管束病害的病原菌侵染后，就在寄主植物維管束中生長、繁殖、為害，造成化學藥劑防治困難，效果不理想又污染環(huán)境，而內生細菌可以通過在植物體內定殖，與病原菌爭奪生存空間，產(chǎn)生拮抗物質直接對病原菌作用等方式達到防病控病的目的。
近來，隨著農藥帶來的毒性、殘留和抗藥性問題日益突顯，人們對食品安全與生物安全問題的認識不斷深化和提高，生物防治越來越受到重視。而植物內生細菌在與棲居植物長期協(xié)同進化的過程中形成了密切的相互關系，且生存微環(huán)境穩(wěn)定，是化肥、農藥和其他微生物制劑的最佳競爭者，它的合理使用將減少化學農藥造成的環(huán)境污染，提高農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的生物多樣性，有利于保護生態(tài)平衡實現(xiàn)可持續(xù)性發(fā)展，適合我國無公害農產(chǎn)品生產(chǎn)的要求。具有抗病作用的枯草芽孢桿菌的報道雖已經(jīng)有一些，但多為植物根際微生物，從植物組織內分離獲得的防病內生性枯草芽孢桿菌還很少，從茄子組織中分離獲得能在多種作物體內定殖，具有防病促生作用，還能產(chǎn)生多種抗菌代謝產(chǎn)物的枯草芽孢桿菌還未見報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠在多種植物體內定殖、具有防病促生長作用的植物內生枯草芽孢桿菌，從而能開發(fā)出新型的生防菌劑，滿足無公害農產(chǎn)品生產(chǎn)的要求。
本發(fā)明所提供的植物內生細菌Jaas ed1是2004年從中國江蘇省南京市麒麟鎮(zhèn)茄子組織中分離獲得的，2005年對該菌株進行了菌種鑒定，結果為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，并于2005年12月12日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC No.1564。該菌株具有下述性質1.菌落形態(tài)特征該菌株在NA培養(yǎng)基上生長良好，菌落呈不規(guī)則狀，乳白色、扁平微隆起，表面有皺褶，邊緣裂葉狀。
2.菌體形態(tài)與主要生理生化特征菌體形態(tài)與主要生理生化特征如表1所示。
表1內生細菌菌株Jaas ed1形態(tài)、生理生化特征

3.遺傳學特征以Eubac27F和Eubac1492R為引物進行PCR擴增出的該菌株的16S rRNA基因的部分序列1428bp，并向GenBank提交，登錄號為EF178293。該菌株的16S rRNA基因的部分序列如序列表中SEQ ID NO1所示。
將該序列在www.ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)站上用BLAST工具與GenBank中已登錄的部分菌株的16S rRNA基因序列進行相似性比較，結果表明與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的同源性為99.1％。分子生物學鑒定的結果與中國科學院微生物研究所對該菌株進行的形態(tài)特征、生理生化鑒定結果相一致，本發(fā)明所述的植物內生細菌Jaas ed1屬于Bacillus subtilis。
通過常規(guī)的微生物發(fā)酵方法可以培養(yǎng)本發(fā)明所述的植物內生細菌枯草芽孢桿菌Jaas ed1，并制得以本發(fā)明所述的植物內生細菌為有效成分的生防菌劑。該菌的最適pH為6.5-8.0，最適培養(yǎng)溫度為25-30℃，可用一般發(fā)酵工業(yè)中的通用發(fā)酵罐進行培養(yǎng)。在制造以本發(fā)明所述的植物內生細菌為生防菌劑時，可同樣使用該技術領域中已知生防菌劑通用的培養(yǎng)基，配制成水劑、粉劑等任意的劑型。
本發(fā)明的所述的植物內生枯草芽孢桿菌及制得的以其為有效成分的生防菌劑與現(xiàn)有技術相比具有如下優(yōu)點。
1、可以在多種植株體內定殖傳導。
將本發(fā)明所述的植物內生枯草芽孢桿菌用抗利福平與拮抗病原真菌雙標記進行內生測定，幾天后從植株體內回收分離。結果表明該菌株可以在多種作物體內定殖，并且可以在植株體內向上和向下傳導。
2、可以促進植株生長、提高產(chǎn)量。
用本發(fā)明所述的植物內生枯草芽孢桿菌菌液潑澆茄子苗，可顯著提高植株的苗高和鮮重。
3、對土傳維管束病害具有突出的防治效果。
用本發(fā)明所述的植物內生枯草芽孢桿菌菌液對植株進行灌根對茄子黃萎病等土傳維管束病害具有突出的防治效果。
4、對多種作物病原菌具有拮抗活性。
室內拮抗活性測定結果表明本發(fā)明所述的植物內生枯草芽孢桿菌具有較廣的抑菌譜，對油菜菌核病菌、水稻稻瘟病菌、棉花立枯病菌、小麥紋枯病菌、小麥赤霉病菌、棉花炭疽病菌、棉花紅腐病菌、水稻惡苗病菌、棉花枯萎病菌、茄子黃萎病菌、棉花黃萎病菌等病原真菌以及番茄斑萎病菌等病原細菌都具有拮抗活性。
5、產(chǎn)生多種抗菌代謝產(chǎn)物。
本發(fā)明所述的植物內生枯草芽孢桿菌能夠產(chǎn)生多種抗菌活性物質，包括產(chǎn)生揮發(fā)性的具有抗菌活性的氣體，以及能被硫酸銨沉淀的具有抗菌活性的蛋白類代謝產(chǎn)物。并且所產(chǎn)生的具有抗菌活性的蛋白類代謝產(chǎn)物具有抑菌譜廣、耐高溫、耐高壓、耐堿性等優(yōu)點。
具體實施例方式下面用實施例來進一步詳述本發(fā)明，但本發(fā)明的內容并不局限于此。
實施例1 液體制劑將植物內生枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)Jaas ed1菌株接種到試管斜面上，培養(yǎng)基為NA，25℃恒溫培養(yǎng)2-4天，獲得試管種。
將試管種接種到NB培養(yǎng)基中，30℃恒溫振蕩培養(yǎng)過夜后，轉接于NB培養(yǎng)基中，30℃恒溫振蕩培養(yǎng)3-4天后的培養(yǎng)液即可為制劑。也可轉接至發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米粉培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進行發(fā)酵生產(chǎn)，用此用玉米粉培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)可以同時滿足高菌體生長量、高抗菌活性物質產(chǎn)生量以及高芽孢得率的要求。
配方一、普通細菌NA培養(yǎng)基(重量％)牛肉浸膏0.3％， 酵母膏0.1％， 蛋白胨0.5％，葡萄糖1.0％，瓊脂1.5-2.0％，pH 6.8-7.0。
配方二、普通細菌NB培養(yǎng)基(重量％)牛肉浸膏0.3％， 酵母膏0.1％，蛋白胨0.5％，葡萄糖1.0％，pH 6.8-7.0。
配方三、玉米粉培養(yǎng)基(重量％)玉米粉1.5％，山芋淀粉0.5％，豆粕粉0.5％，蛋白胨0.8％，MgSO40.01％，K2HPO40.05％，pH 7.5。
實施例2在多種作物體內定殖將植物內生枯草芽孢桿菌菌株Jaas ed1抗利福平馴化后獲得抗Rif 300μg/ml的標記菌株，分別用莖部針刺，傷根灌根不同的接種方法測定標記菌株在多種植株體內的定殖情況。結果表明標記菌株可以通過不同接種方式進入茄子、水稻、小麥、油菜、棉花、黃瓜等作物植株體內，同時還可以在植株體內繁殖、傳導。但不同接種方法對標記菌株的定殖效果有不同的影響，用莖部針刺接種的方法定殖效果最好。
實施例3 對茄苗的促生長作用茄子種子用清水浸泡12h，于30℃潮濕條件下催芽，待茄種長出小芽后轉入裝有無菌土壤的盆缽中生長，茄子苗長到兩三片真葉后，用傷根灌根法，每株茄子苗灌澆20ml枯草芽孢桿菌菌株Jaas ed1菌液(濃度為108cfu/ml)，三天后再灌澆一次該菌菌液，以清水為對照。三周后隨機抽取15株苗，測定株高、根長、株重和干重。結果顯示，經(jīng)菌液處理過的茄子苗明顯比對照長勢好，莖干粗，葉片大而綠。株高增加率達到91.64％；根長增加率達到4.28％，鮮重增加率達到122.4％；干重增加率達到129.3％。
實施例4 對茄子黃萎病的防治作用茄子種子用清水浸泡12h，于30℃潮濕條件下催芽，待茄種長出小芽后轉入裝有無菌土壤的盆缽中生長，茄子苗長到兩三片真葉后，用傷根灌根法接種，每株茄子苗灌澆20ml枯草芽孢桿菌菌株Jaas ed1菌液(濃度為108cfu/ml)，三天后灌澆茄子黃萎病菌孢子液(濃度為105孢子/ml)，每株20ml。第六天再灌澆一次該內生細菌培養(yǎng)液，以清水為對照。兩周后調查病情指數(shù)。結果顯示，菌液處理對茄子黃萎病具有顯著的防治效果，在接種該內生細菌后的第14d，第18d和第22d對茄子黃萎病的防治效果分別達到100％、80％和100％。
實施例5產(chǎn)生多種抗菌代謝產(chǎn)物將植物內生枯草芽孢桿菌菌株Jaas ed1劃線培養(yǎng)于NA平板上，在另一塊PDA平板中央接一塊茄子黃萎病菌菌餅，然后將兩塊平板口對口合在一起，用封口膜封閉。將接有茄子黃萎病菌菌餅的平板朝上，25℃恒溫培養(yǎng)2-4周。以NA培養(yǎng)基上不接菌株Jaas ed1為對照。結果顯示，菌株Jaas ed1代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體物質顯著抑制茄子黃萎病菌的生長。
另外，將植物內生枯草芽孢桿菌菌株Jaas ed1菌液離心，取上清液，用硫酸銨沉淀后，沉淀物用pH7.0、50mM磷酸緩沖液溶解并透析過夜后，得到抗菌蛋白類物質粗提物，測定其對茄子黃萎病菌孢子萌發(fā)和菌絲生長的影響。結果顯示粗提物顯著抑制茄子黃萎病菌孢子的萌發(fā)和菌絲的生長。
實施例6 產(chǎn)生的抗菌代謝產(chǎn)物耐高溫、耐高壓、耐堿性、抗蛋白酶、抑菌譜廣將植物內生枯草芽孢桿菌菌株Jaas ed1菌液離心，取上清液，用硫酸銨沉淀后，沉淀物用pH7.0、50mM磷酸緩沖液溶解并透析過夜后，得到抗菌蛋白類物質粗提物，經(jīng)40℃、60℃、80℃處理30min后，仍保持接近100％的抗菌活性，100℃處理1h的樣品活性降至對照樣品活性的81％，121℃處理30min的樣品活性降至對照的65％，說明抗菌物質對熱有一定的耐受能力。在pH值6-9的范圍內該抗菌物質的抗菌活性比較穩(wěn)定，pH值為5和10時，抗菌活性僅略有下降，說明抗菌物質具有一定的耐堿性。用胰蛋白酶和蛋白酶K處理過的樣品抑菌圈與對照抑菌圈大小沒有太大差異，說明此抗菌物質對胰蛋白酶和蛋白酶K不敏感。另外，粗提物還對茄子黃萎病菌、油菜菌核病菌、水稻稻瘟病菌、棉花立枯病菌、小麥紋枯病菌、小麥赤霉病菌，棉花炭疽病菌，棉花紅腐病菌，水稻惡苗病菌，棉花枯萎病菌等10種植物病原真菌及番茄斑萎病菌1種植物病原細菌均有抑制作用，說明此物質是一種具有廣譜拮抗植物病菌性質的抗菌物質，在防治植物病害中有很大的潛力。
序列表<110>江蘇省農業(yè)科學院<120>一種防病植物內生枯草芽孢桿菌<140>200710022993.2<141>2007-05-30<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1428<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<220>
<221>rRNA<222>(1)..(1428)<400>1gcctaataca tgctagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga 60agggtgagta acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg 120ctaataccgg atggttgttt gaaccgcatg gttcagacat aaaaggtggc ttcggctacc 180acttacagat ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcga 240cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac 300tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg 360ccgcgtgagt gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa gaacaagtgc 420cgttcaaata gggcggcacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc 480
cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagggc 540tcgcaggcgg tttcttaatt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg 600gaaactgggg aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg 660cgtagagatg tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta actgacgctg 720aggagcgaaa gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg 780atgagtgcta agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg cattaagcac 840tccgcctggg gagtacggtc gcaagactga aacttcaaag gaattgacgg gggcccgcac 900aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca 960tcctctgaca atcctagaga taggacgtcc ccttcggggg cagagtgaca ggtggtgcat 1020ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt 1080gatcttagtt gccagcattc agttgggcac tctaaggtga ctgccggtga caaaccggag 1140gaaggtgggg aggacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac 1200aatggacaga acaaagggca gcgaaaccgc gaggttaagc caatcccaca aatctgttct 1260cagttcggat cgcagtctgc aactcgactg cgtgaagctg gaatcgctag taatcgcgga 1320tcagcattcc gcggtgaata cgttcccggc ccttgtacac accgcccgtc tctcctcgag 1380agtttgtatc acccgaagtc ggtgatgtaa cctttatgga gccacccg 1428
權利要求
1.一種具有防病作用的植物內生細菌，其特征在于該菌是一種枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，已于2005年12月12日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC No.1564。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種植物內生細菌，其特征在于該菌株可在多種作物體內定殖；用抗利福平與拮抗病原真菌雙標記進行內生測定，從植株體內回收分離的菌株，在含利福平培養(yǎng)基上出現(xiàn)相同的菌落。
3.權利要求1或2所述植物內生細菌在制劑生產(chǎn)中的應用，其中以權利要求1或2所述植物內生細菌為生產(chǎn)菌株來生產(chǎn)制劑。
4.以權利要求1或2所述植物內生細菌為有效成分的制劑在農業(yè)上的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種植物內生枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)及其應用，屬于農作物防病控病技術領域。本發(fā)明采用的枯草芽孢桿菌菌株Jaas ed1已于2005年12月12日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC No.1564。該菌株可在較低的菌液濃度下進入多種作物體內，并能在多種作物體內定殖；可用于防治植物不同類型的病害，特別是對于土傳維管束病害具有良好的防治效果；并且該菌株對植物具有明顯的促進生長作用，還能產(chǎn)生多種抗菌代謝產(chǎn)物。具有成本低廉、操作簡單、無污染、無公害等優(yōu)點。
文檔編號A01N63/02GK101092599SQ20071002299
公開日2007年12月26日 申請日期2007年5月30日 優(yōu)先權日2007年5月30日
發(fā)明者林玲, 喬勇升, 周益軍, 顧本康 申請人:江蘇省農業(yè)科學院