專利名稱：一種用內(nèi)生枯草芽孢桿菌生產(chǎn)生物農(nóng)藥的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物農(nóng)藥的制造方法，特別涉及一種用內(nèi)生枯草芽孢桿菌生產(chǎn)生物農(nóng)藥的方法。
背景技術(shù)：
小麥紋枯病已成為我國麥區(qū)常發(fā)病害。小麥?zhǔn)芗y枯菌侵染后，在各生育階段出現(xiàn)爛芽、病苗枯死、花稈爛莖、枯株白穗等癥狀。爛芽芽鞘褐變，后芽枯死腐爛，不能出土 ；病苗枯死發(fā)生在3-4葉期，初僅第一葉鞘上現(xiàn)中間灰色，四周褐色的病斑，后因抽不出新葉而致病苗枯死；花稈爛莖拔節(jié)后在基部葉鞘上形成中間灰色，邊緣淺褐色的云紋狀病斑，病斑融合后，莖基部呈云紋花稈狀；枯株白穗病斑侵入莖壁后，形成中間灰褐色，四周褐色的近圓形或橢圓形眼斑，造成莖壁失水壞死，最后病株因養(yǎng)分、水分供不應(yīng)求而枯死，形成枯株白穗。引起小麥紋枯病的病原主要是禾谷絲核菌，小麥紋枯病菌除對小麥表現(xiàn)強(qiáng)勁的致病能力，還侵染玉米，水稻。目前主要的防止方法為播種前藥劑拌種用種子重量0.2%的 33%紋霉凈(三唑酮加多菌靈)可濕性粉劑或用種子重量0. 03% -0. 04%的15%三唑醇 (羥銹寧)粉劑、或0. 03%的15%三唑酮(粉銹寧)可濕性粉劑或0.0125%的12. 5%烯唑醇(速保利)可濕性粉劑拌種。播種時(shí)土壤相對含水量較低則易發(fā)生藥害，如每kg種子加 1. 5kg種子加1. 5mg赤霉素。②翌年春季冬、春小麥拔節(jié)期，667m2用5%井岡霉素水劑7. 5g 對水IOOkg或15%三唑醇粉劑8g，對水60kg或20%三唑酮乳油8-10g，對水60kg，12. 5% 烯唑醇可濕性粉劑12. 5g，對水IOOkg或50%利克菌200g，對水IOOkg噴霧，防效比單獨(dú)拌種的提高10% -30%，增產(chǎn)2% -10%。此外還可選用33%紋霉凈可濕性粉劑或50%甲基立枯靈(利克菌)可濕粉400倍液。以上防治小麥紋枯病的方法會(huì)存在一些不足，上述化學(xué)農(nóng)藥的長期、大量施用容易產(chǎn)生環(huán)境污染、抗藥性以及農(nóng)藥殘留等問題，因此以植物微生態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)控制有害生物的生物防治技術(shù)已成為小麥紋枯病防治研究的熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有小麥紋枯病防治中長期、大量施用化學(xué)農(nóng)藥容易產(chǎn)生環(huán)境污染、抗藥性以及農(nóng)藥殘留等問題，本發(fā)明提供了一種用內(nèi)生芽孢桿菌生產(chǎn)生物農(nóng)藥的方法。該方法利用了能防治小麥紋枯病的內(nèi)生芽孢桿菌的代謝活性物與適樂時(shí)懸浮種衣劑即2. 5%咯菌腈制劑復(fù)配，防治效果明顯。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為
一種內(nèi)生芽孢桿菌EBS，于皿年日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微牛物中心,館藏號為CGMCC No. 5239。保藏單位的地址為“北京市朝陽區(qū)北辰西路1 號院3號中國科學(xué)院微生物研究所”，保藏地址的郵政編碼為“100101”，其分類命名為“枯草芽孢桿菌”，分類命名的拉丁文名稱為Bacillus、subtilis。
一種用內(nèi)生芽孢桿菌生產(chǎn)生物農(nóng)藥的方法，包括如下步驟(1)將內(nèi)生芽孢桿菌菌株于含有牛肉膏0.3%，蛋白胨1.0%，NaCl 0.5%的種子培養(yǎng)液中，320C、170r/min條件下振蕩培養(yǎng)Mh，備用；(2)將上述內(nèi)生細(xì)菌種子培養(yǎng)液，按接種量為6%的比例接種至包括有黃豆餅粉、 可溶性淀粉、蛋白胨和NaCl的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度為30°C -34°C，pH值為5_9的條件下發(fā)酵培養(yǎng)72h ；(3)當(dāng)所述發(fā)酵培養(yǎng)液菌體濃度大于0.5 X IO9CfuAiL后，進(jìn)行噴霧干燥，制成菌體含量大于2. OX 109cfu/g的可濕性粉劑。作為本技術(shù)方案進(jìn)一步改進(jìn)，將所述發(fā)酵后的發(fā)酵培養(yǎng)液與10%適樂時(shí)懸浮種衣劑即2. 5%咯菌腈制劑復(fù)配，其復(fù)配比例為7 3。有益效果內(nèi)生枯草芽孢桿菌(簡稱EBQ能在小麥根際和體內(nèi)定殖以及該內(nèi)生細(xì)菌可產(chǎn)生表面活性素(Surfactin)類抗菌物質(zhì)；活菌劑對小麥紋枯病的室內(nèi)防治效果為91. 2%，大田防治效果為66. 3%，代謝活性物與適樂時(shí)懸浮種衣劑或咯菌腈制劑復(fù)配后 EC50為81. 845μ g/mL，增效比值為SR = 1. 23，二者對小麥紋枯病的防治具相加作用，而且防治效果穩(wěn)定。大田防治效果與咯菌腈單劑相當(dāng)，大大降低了化學(xué)農(nóng)藥的施用量和防治成本。說明書附1為EBS的菌落生長形態(tài)圖；圖2為EBS的芽孢形態(tài)顯微觀察圖；圖3為raS生長曲線圖；圖4為EBS在小麥體內(nèi)定殖動(dòng)態(tài)圖5為EBS粗提物對小麥紋枯病菌抑制作用實(shí)驗(yàn)圖；圖6為EBS粗提物對黃瓜灰霉病菌抑制作用實(shí)驗(yàn)圖；圖7為EBS粗提物小麥赤霉病菌抑制作用實(shí)驗(yàn)圖；圖8為EBS粗提物西瓜炭疽病菌抑制作用實(shí)驗(yàn)圖；圖9為EBS粗提物黃瓜枯萎病菌抑制作用實(shí)驗(yàn)圖；


圖10為EBS粗提物煙草赤星病菌抑制作用實(shí)驗(yàn)圖；
圖11為EBS粗提物為EBS粗提物小麥全蝕病菌抑制作用實(shí)驗(yàn)圖；
圖12為EBS粗提物高梁炭疽病菌抑制作用實(shí)驗(yàn)圖；
圖13為EBS粗提物瓜果腐霉抑制作用實(shí)驗(yàn)圖。表1為EBS對小麥紋枯病的盆栽防治效果表2為EBS對小麥紋枯病的大田防治效果
具體實(shí)施例方式下面闡述的實(shí)施例代表允許本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)踐本發(fā)明的必要信息，并且示出實(shí)踐本發(fā)明的最佳方式。一旦根據(jù)附圖閱讀了以下的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員就將理解本發(fā)明的構(gòu)思并且將認(rèn)識到此處未特別闡明的這些構(gòu)思的應(yīng)用。應(yīng)當(dāng)理解，這些構(gòu)思和應(yīng)用落入本公開和所附權(quán)利要求書的范圍。參照附
圖1-13
(1)從植物組織中分離出內(nèi)生枯草芽孢桿菌(EBS)，該菌株于2011年09月05日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保存編號為CGMCC NO. 5239。(2)將EBS菌株于含有牛肉膏0. 3%，蛋白胨1.0%，NaCl 0.5%的種子培養(yǎng)液中， 320C、170r/min條件下振蕩培養(yǎng)Mh，備用；(3)將上述內(nèi)生細(xì)菌種子培養(yǎng)液，按接種量為6%的比例接種至包括有黃豆餅粉、 可溶性淀粉、蛋白胨和NaCl的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度為30°C -34°C，pH值為5_9的條件下發(fā)酵培養(yǎng)72h ；發(fā)酵液中菌體濃度大于0. 5X 109cfu/mL。(3)當(dāng)所述發(fā)酵培養(yǎng)液菌體濃度大于0. 5X109cfu/mL后，進(jìn)行噴霧干燥，制成菌體含量大于2. OX 109cfu/g的可濕性粉劑。所述發(fā)酵后的發(fā)酵培養(yǎng)液與10%適樂時(shí)懸浮種衣劑即2. 5%咯菌腈制劑復(fù)配， 其復(fù)配比例為7 3，因?yàn)榇x活性物與適樂時(shí)懸浮種衣劑或咯菌腈制劑復(fù)配后EC5tl為 81. 845μ g/mL，增效比值為SR = 1. 23，二者對小麥紋枯病的防治具相加作用，而且防治效果穩(wěn)定。大田防治效果與咯菌腈單劑相當(dāng)，大大降低了化學(xué)農(nóng)藥的施用量和防治成本。EBS菌株接種于NA培養(yǎng)平板，條件下培養(yǎng)Id 3d，觀察其菌落形態(tài)和顏色， 如附
圖1-2所示，EBS在NA培養(yǎng)基上生長良好，菌落乳白色，不產(chǎn)生色素，沒有熒光，菌落不規(guī)則、隆起，表面形成不規(guī)則的褶皺(見圖4)。培養(yǎng)24d后產(chǎn)生輕微腥臭氣味。在NA培養(yǎng)液中生長良好，在培養(yǎng)液表面形成褶皺的膜層，生長物聚在膜下，液體不渾濁。菌體呈桿狀， 大小為2μπι 8μπι。革蘭氏染色陽性(G+)。芽孢呈卵圓形或球形如附圖3所示，EBS產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)隨菌體的生長而逐漸積累，培養(yǎng)7 后菌體數(shù)量達(dá)最高值，此時(shí)抑菌物質(zhì)產(chǎn)量達(dá)最大值，72h后菌體數(shù)量迅速下降，抑菌活性也隨之降低。分析活性物質(zhì)活性強(qiáng)弱與菌體繁殖數(shù)量的關(guān)系，活性物質(zhì)是在細(xì)菌生長過程中逐漸積累的，至生長后期活性物質(zhì)產(chǎn)量減少，可能是隨著菌體濃度增加，培養(yǎng)基中養(yǎng)分消耗殆盡，菌體生長活力下降，次級代謝能力隨之降低。提示，在對該菌進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵時(shí)，需要進(jìn)行分批補(bǔ)料，以維持其活性物質(zhì)的大量積累。在7 時(shí)活性物質(zhì)產(chǎn)生最多，因此在發(fā)酵液制備時(shí)培養(yǎng)時(shí)間以7 為宜。分別選取施加了該編號1、2、3農(nóng)藥試劑的小麥植株與分別施加等量井R霉素、清水的小麥植株進(jìn)行對比試驗(yàn)，接種小麥紋枯病菌(Miizoctonia cerealis) 10_12天后，施加該生物農(nóng)藥1、2、3的小麥植株生長良好，施加井R霉素的效果較次，對照組出現(xiàn)明顯的病害癥狀表現(xiàn)。本活體內(nèi)生枯草芽孢桿菌在植物根際和小麥體內(nèi)具有較強(qiáng)的定殖能力，且能從根部向莖、葉部轉(zhuǎn)移，其定殖量與菌株的接種濃度呈正相關(guān)。其定殖量在施用10-12天后達(dá)到最大值，施用該菌劑進(jìn)行小麥紋枯病害防治的時(shí)，應(yīng)分別于小麥紋枯病發(fā)病高峰期即冬前期和返青期的前IOd左右施藥可達(dá)到理想的防治效果。該內(nèi)生細(xì)菌EBS可產(chǎn)生脂肽類代謝活性物質(zhì)，經(jīng)鑒定其活性成分為β-羥基12-15 碳脂肪酸肽類生物表面活性素(i3-hydrOXy-C12-C15-Leu7Surfactin Α)同系物，其分子量分別為1035. 65Da, 1021. 64Da, 1007. 63Da和993. 65Da,活性成分對多種植物病原真菌和煙草花葉病毒具有抑制活性，可有效防治植物土傳真菌病害和病毒病害。如附圖5-13所示，其顯示了 EBS的抗菌譜，菌體生長正常的為對照組，菌體生長受到抑制的為加有EBS的實(shí)驗(yàn)組，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，實(shí)驗(yàn)組附近的菌體生長明顯受到了 EBS代謝產(chǎn)物的抑制。結(jié)果顯示，該生物農(nóng)藥對小麥紋枯病菌(Rhizoctonia cerealis)小麥全燭病菌(Gaeumannomyces graminis)、小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)、西瓜炭疽病菌(Colletetrichum orbiculare)、黃瓜灰霉病菌(Botrytis cinerea)、黃瓜枯萎病菌 (Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum)、煙草赤星病菌(Alternaria alternata)、高梁炭直病菌(Colletotrichum graminicola)、瓜果腐毒(Pythium aphani derma turn)等多禾中植物病原真菌具有良好的拮抗作用。表1、表2結(jié)果顯示，EBS對小麥紋枯病具有良好的防治效果，無論是盆栽試驗(yàn)還是大田試驗(yàn)，EBS的防治效果均優(yōu)于對照藥劑咯菌腈。除菌發(fā)酵液對小麥紋枯病的盆栽和大田防治效果分別可達(dá)88. 2%和56. 2%，說明EBS代謝活性物質(zhì)在其生防過程中發(fā)揮重要作用。而帶菌發(fā)酵液對小麥紋枯病的大田防治效果顯著高于除菌發(fā)酵液和對照藥劑，則說明 EBS代謝活性物質(zhì)在發(fā)揮生防作用的同時(shí)，菌體在小麥體內(nèi)的定殖與其在田間持續(xù)發(fā)揮防治作用具有密切關(guān)系，因此，在進(jìn)行菌劑開發(fā)時(shí)，無論是采用固體發(fā)酵還是液體發(fā)酵技術(shù)， 直接以發(fā)酵混合物(液)為主要成分進(jìn)行劑型加工是可行的。表IEBS對小麥紋枯病的盆栽防治效果
權(quán)利要求
1.一種用內(nèi)生枯草芽孢桿菌生產(chǎn)生物農(nóng)藥的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將內(nèi)生枯草芽孢桿菌EBS菌株于含有牛肉膏0.3%，蛋白胨1. 0%,NaClO. 5%的種子培養(yǎng)液中，320C、170r/min條件下振蕩培養(yǎng)Mh，備用；(2)將上述內(nèi)生細(xì)菌種子培養(yǎng)液，按接種量為6%的比例接種至包括有黃豆餅粉、可溶性淀粉、蛋白胨和NaCl的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度為30°C -34 pH值為5_9的條件下發(fā)酵培養(yǎng)72h ；(3)當(dāng)所述發(fā)酵培養(yǎng)液菌體濃度大于0.5X109cfu/mL后，進(jìn)行噴霧干燥，制成菌體含量大于2. OX 109cfu/g的可濕性粉劑。
2.如權(quán)利要求1所述的一種用內(nèi)生枯草芽孢桿菌生產(chǎn)生物農(nóng)藥的方法，其特征在于， 將所述發(fā)酵后的發(fā)酵培養(yǎng)液與10%適樂時(shí)懸浮種衣劑即2. 5%咯菌腈制劑復(fù)配，其復(fù)配比例為7 3。
全文摘要
一種用內(nèi)生枯草芽孢桿菌生產(chǎn)生物農(nóng)藥的方法，屬于生物農(nóng)藥的制造領(lǐng)域，將內(nèi)生芽孢桿菌菌株于含有牛肉膏0.3％，蛋白胨1.0％，NaCl 0.5％的種子培養(yǎng)液中，32℃、170r/min條件下振蕩培養(yǎng)24h，作為生產(chǎn)菌種子；將上述種子培養(yǎng)液按接種量為6％的比例接種至包括有黃豆餅粉、可溶性淀粉、蛋白胨和NaCl的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于發(fā)酵溫度為30℃-34℃，pH值為5-9的條件下發(fā)酵培養(yǎng)72h；將菌體濃度大于0.5×109cfu/mL的發(fā)酵培養(yǎng)液噴霧干燥后，制成菌體含量大于2.0×109cfu/g的可濕性粉劑。該方法利用了內(nèi)生枯草芽孢桿菌能在小麥根際和體內(nèi)定殖以及該內(nèi)生細(xì)菌可產(chǎn)生生物表面活性素(Surfactin)類抗菌物質(zhì)的特性，對小麥紋枯病防治效果明顯。
文檔編號A01P3/00GK102511504SQ201110352670
公開日2012年6月27日 申請日期2011年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月10日
發(fā)明者文才藝, 汪敏, 趙玉華 申請人:文才藝, 汪敏