沒藥枝抗腫瘤提取物及其組合物的制備方法和醫(yī)藥應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種維吾爾藥沒藥枝抗腫瘤有效部位及其組合物的制備方法和其在制備預(yù)防及治療肝癌、肺癌、胃癌、腸癌、胰腺癌、膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤藥物上的應(yīng)用。沒藥枝經(jīng)溶劑超聲提取，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱，先用石油醚洗脫，繼用甲醇溶劑洗脫，甲醇洗脫液干燥后得提取物；或維吾爾藥沒藥枝經(jīng)溶劑超聲提取，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱，先用石油醚洗脫，繼用石油醚：乙酸乙酯=100：10-100：50的溶劑洗脫，收集100：10-100：50的洗脫液，洗脫液干燥后得提取物。
【專利說明】
沒藥枝抗腫瘤提取物及其組合物的制備方法和醫(yī)藥應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種維吾爾藥沒藥枝抗腫瘤提取物及其組合物 的制備方法和其在制備預(yù)防及治療肝癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、宮頸癌、腦膠 質(zhì)瘤等惡性腫瘤的上的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 沒藥枝（Ramulus myrrhae)為撤攬科植物沒藥樹（Commiphora myrrha EngL )的 干燥樹枝。割取樹枝，切斷、晾干。主產(chǎn)于非洲索馬里、埃塞俄比亞以及印度等地。舊約時 期，常被做成油膏，涂抹在傷口，促進傷口愈合。該藥材主治增強營養(yǎng)離，通滯散氣，解毒散 寒，用于頭昏目眩，氣短咳嗽，癲癇，癱瘓，失眠，胃寒脅痛，久婚不孕，毒蛇咬傷等。
[0003] 本發(fā)明在研究沒藥枝抗腫瘤活性時意外地發(fā)現(xiàn)，沒藥枝亦具有很好的乳腺癌、宮 頸癌、肝癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、腦膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤的預(yù)防及治療作用，可以應(yīng)用 癌癥的預(yù)防和治療。
[0004] 但是，對其抗腫瘤的有效成分一直不清楚，本發(fā)明通過系統(tǒng)地篩選研究，發(fā)現(xiàn)了沒 藥枝的有效提取提取物，可以應(yīng)用于腫瘤的預(yù)防和治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是提供一種沒藥枝提取物，該提取物可以用于治療肝 癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、宮頸癌、腦膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤。
[0006] 本發(fā)明還提供了該提取物的制備方法。
[0007] 本發(fā)明還提供了以沒藥枝提取物作為活性成分的組合物及其制備方法和用途。
[0008] 本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0009] 維吾爾藥沒藥枝經(jīng)溶劑超聲提取，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠 柱，先用石油醚洗脫，繼用石油醚：乙酸乙酯=100 :10-100 :50的溶劑洗脫，收集100 : 10-100 :50的洗脫液，洗脫液干燥后得提取物，具有顯著的抗腫瘤活性，其TLC分析表征如 圖1，TLC分析色譜條件：GF254硅膠板，展開系統(tǒng)：石油醚：乙酸乙酯：丙酮=6:1:1，顯色方 法：香草醛-濃硫酸。
[0010] 具體，發(fā)現(xiàn)過程如下：
[0011] 1、沒藥枝經(jīng)溶劑超聲提取物的制備
[0012] 取維吾爾藥沒藥枝20g，經(jīng)100mL溶劑超聲提取15min，提取液濃縮后，得提取物 SN0019A759. 9mg，SN0019B 219. lmg，合并共 979mg,留樣 31. 2mg 剩余 947. 8mg。
[0013] 2、石油醚：乙酸乙酯混合溶劑梯度洗脫方法和結(jié)果
[0014] 取維吾爾藥沒藥枝20g，經(jīng)100mL甲醇超聲提取15min，提取液濃縮后，得提取物 SN0019A759. 9mg，SN0019B 219. lmg，合并共 979mg,留樣 3L 2mg 剩余 947. 8mg。上柱，甲醇 溶解，共用甲醇20ml。上硅膠柱色譜，拌樣硅膠lg，空白硅膠10g，玻璃柱內(nèi)徑2. 0cm，石油 醚：乙酸乙酯系統(tǒng)梯度洗脫（條件見表1)，柱體積22ml，每個梯度洗脫200ml，得到，各個濃 度提取洗脫液的洗脫物，回收溶劑，即得，石油醚：乙酸乙酯梯度洗脫提取物，收率見表1， TLC分析結(jié)果見圖2, TLC分析色譜條件=GF254硅膠板，展開系統(tǒng)：石油醚：乙酸乙酯：丙酮= 6:1:1，顯色方法：香草醛-濃硫酸。
[0015]表 1
[0017] 3、抗腫瘤活性篩選方法和結(jié)果
[0018] 1)實驗條件
[0019] a)細胞株信息
[0020] 大鼠腦膠質(zhì)瘤細胞C6購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心細胞庫。
[0021] b)藥品及試劑
[0022] 樣品無菌條件下，DMSO溶解配置成母液濃度為100mg/mL，使用時用RPMI-1650培 養(yǎng)液稀釋至所需濃度（DMSO彡1%。）。
[0023] RPMI Medium 1650培養(yǎng)基干粉購于美國GIBCO公司。胎牛血清購于北京元亨圣馬 生物技術(shù)研究所。Trypsin 1:250、二甲基二苯基四氮唑溴鹽（MTT)。
[0024] c)儀器
[0025] CO2培養(yǎng)箱（SANYO,日本）
[0026] 垂直層流潔凈工作臺（上海上凈凈化設(shè)備有限公司）
[0027] 倒置生物顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）
[0028] 低/高速臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）
[0029] 電子天平（奧豪斯儀器有限公司）
[0030] 酶標儀（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）
[0031] 立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）
[0032] 鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）
[0033] PH 計（SART0RIUS，德國）
[0034] 2)實驗方法和過程
[0035] 大鼠腦膠質(zhì)瘤細胞C6以5000/孔的密度鋪于96孔板，每孔100ul，12h后使用。 各組分以DMSO溶解為lOOmg/mL儲存液，保存于-20°C待用。鋪板后12h，觀察細胞匯合率 約為50%，加藥，濃度均為100yg/mL，每個組分3個復(fù)孔。每板細胞設(shè)立二個對照組（培 養(yǎng)基+細胞；含〇. 1% DMSO培養(yǎng)基+細胞），3個空白孔（只有培養(yǎng)基）。加入藥物24小 時后，加入20 μ 1四甲基偶氮唑鹽化學(xué)名為3- (4, 5-二甲基噻唑）-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽 (3_(4, 5-dimethyl_2thiazolyl)-2, 5-diphenyl-tetrazolium bromide，ΜΤΤ)，繼續(xù)培養(yǎng) 4 小時。完全棄去上清液，加入100 μ I DMS0,混勻使MTT完全溶解，去氣泡。490nm測定OD 值。
[0036]
[0037] 3)實驗結(jié)果
[0038] 表 2

[0046] 維吾爾藥沒藥枝經(jīng)溶劑超聲提取，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠 柱，先用石油醚洗脫，繼用石油醚：乙酸乙酯=100 :10-100 :50的溶劑洗脫，收集100 : 10-100 :50的洗脫液，洗脫液干燥后得提取物，具有顯著的抗腫瘤活性。
[0047] 4、抗腫瘤有效提取物的提取方法研究
[0048] 1)提取溶劑的種類研究
[0049] 分別用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶劑、乙醇水混合溶劑等溶 劑提取，并測試提取物對C6細胞的抗腫瘤活性，結(jié)果如下：
[0050] 表 3
[0052] 研究結(jié)果表明：提取用溶劑可以為甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合 溶劑、乙醇水混合溶劑。
[0053] 2)提取溶劑的用量研究
[0054] 分別用1、2、5、10、20、30、50、50倍（重量/體積比）溶劑提取，并測試提取物對〇6 細胞的抗腫瘤活性，結(jié)果如下：
[0055] 表 4

[0059] 提取物提取用溶劑用量為藥材重量的2-50倍（重量/體積比）。
[0060] 3)干燥方法的研究
[0061] 分別用真空干燥法、冷凍干燥法、鼓風(fēng)干燥、離心干燥、旋蒸干燥法等方法，對得到 的抗腫瘤活性部位進行干燥，以含水量、TLC、活性測試為指標，發(fā)現(xiàn)真空干燥法、冷凍干燥 法、鼓風(fēng)干燥、離心干燥、旋蒸干燥法適用于對抗腫瘤活性部位進行干燥，其中，最優(yōu)為真空 干燥法、冷凍干燥法。
[0062] 表 5 :
[0064] 因此，沒藥枝抗胛瘤提取物的制備方法為：
[0065] 維吾爾藥沒藥枝經(jīng)溶劑超聲提取，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠 柱，先用石油醚2-50倍洗脫，繼用石油醚：乙酸乙酯=100 :10-100 :50的溶劑2-50倍洗脫， 收集100 :10-100 :50的洗脫液，洗脫液干燥后得提取物，具有顯著的抗腫瘤活性。最優(yōu)為先 用石油醚洗脫10倍柱體積，繼用石油醚：乙酸乙酯=100 :10-100 :50洗脫15倍柱體積；
[0066]其中，
[0067] 1)提取物提取用溶劑可以為甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶劑、 乙醇水混合溶劑，最優(yōu)條件為甲醇和95%乙醇。提取物提取用溶劑用量為藥材重量的2-50 倍（重量/體積比）。
[0068] 2)提取物干燥方法可以為真空干燥法、冷凍干燥法、鼓風(fēng)干燥、離心干燥、旋蒸干 燥法等，最優(yōu)為真空干燥法、冷凍干燥法。
[0069] 5.沒藥枝抗腫瘤有效提取物（先用石油醚洗脫，繼用甲醇洗脫）的抗腫瘤活性研 究
[0070] 利用各種腫瘤細胞，如膠質(zhì)瘤、肺癌、胃癌、腸癌、胰腺癌、乳腺癌、宮頸癌、肝癌等 惡性腫瘤細胞株，分別測試沒藥枝抗腫瘤提取物的抗腫瘤活性，IC50結(jié)果如下：
[0071] 表 6

[0074] 因此，我們發(fā)現(xiàn)，沒藥枝抗腫瘤提取物具備抗腫瘤活性，可望用于各種腫瘤如膠質(zhì) 瘤、肺癌、胃癌、腸癌、胰腺癌、乳腺癌、宮頸癌、肝癌等惡性腫瘤的預(yù)防及治療。
[0075] 6、沒藥枝抗腫瘤有效提取物的組合物及其制備方法研究
[0076] 1)固體分散體
[0077] 處方 沒藥枝提取物 2〇g 聚乙烯吡咯烷酮 Sflg 固體分散1:0?
[0078] 制備方法：
[0079] 稱取沒藥枝提取物和載體聚乙烯吡咯烷酮（PVP)按比例、1:2、1:4、1:6的質(zhì)量比 分別放入燒杯中，加入無水乙醇，磁力攪拌器攪拌至沒藥枝提取物和載體完全溶解，轉(zhuǎn)入旋 蒸儀中去除有機溶劑，干燥，粉碎過80目篩，即得沒藥枝提取物PVP包合物。
[0080] 2)環(huán)糊精包合物
[0081] 處方：
[0082] 沒藥枝提取物 20g β-環(huán)糊精 80g 包合物100g
[0083] 制備方法：
[0084] 將β -環(huán)糊精與1~5倍水研勻，加沒藥枝提取物（水難溶性的應(yīng)先溶于少量有 機溶劑中）充分研磨至成糊狀物，低溫干燥即得。
[0085] 3)分散片處方：
[0086] 沒藥枝提取物 IOQ 十二烷基硫酸鈉 1 預(yù)膠化淀粉 10 可溶性淀粉 100 交聯(lián)聚維酮 1:0
[0087] 微晶纖維素 10 微分硅膠 0,3 L0088」 制爸萬沄：
[0089] 1.沒藥枝提取物淀粉分散體的制備，精密稱取沒藥枝提取物提取物，加入適量的 十二烷基硫酸鈉，用70%的乙醇溶解加入等比例的可溶性淀粉混合均勻后，在70°C的溫度 下蒸干，粉碎，過100目篩；
[0090] 2.稱取處方量，沒藥枝提取物淀粉分散體，交聯(lián)聚維酮，預(yù)膠化淀粉，用70 %乙 醇做濕潤劑，邊加入邊攪拌，制成濕顆粒過14目篩，室溫下放置15min后，60°C烘箱烘干 45min，16目篩整粒，加入滑石粉和微分硅膠，混合均勻后，壓片。
[0091 ] 7、沒藥枝抗腫瘤有效提取物的檢測方法研究
[0092] 我們發(fā)現(xiàn)，可以用薄層色譜的方法，很好地檢測和標示沒藥枝抗腫瘤有效提取物 的特征。見圖1
[0093] 具體條件為：色譜條件：GF254硅膠板，展開系統(tǒng)：石油醚：乙酸乙酯：丙酮= 6:1:1，顯色方法：香草醛-濃硫酸
【附圖說明】：
[0094] 圖1提取物的TLC色譜圖；
[0095] 圖2沒藥枝得到的化學(xué)組分的TLC色譜圖。
【具體實施方式】
[0096] 以下實施例表示本發(fā)明的實用性，本發(fā)明不受此限制。
[0097] 實施例1 :
[0098] 取沒藥枝20g，經(jīng)100mL溶劑超聲提取15min，提取液濃縮后回收溶劑，真空干燥， 即為該提取物，收率15. 1%。
[0099] 實施例2 :
[0100] 取沒藥枝20g，經(jīng)100mL甲醇超聲提取15min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣 后的硅膠柱（I. 5cm內(nèi)徑小柱），先用石油醚洗脫20倍柱體積，繼用甲醇洗脫30倍柱體積， 甲醇洗脫液經(jīng)回收有機溶劑，真空干燥，即為該提取物，收率8. 3%。
[0101] 實施例3:
[0102] 取沒藥枝20g，經(jīng)100mL甲醇超聲提取15min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上 樣后的硅膠柱（I. 5cm內(nèi)徑小柱），先用石油醚洗脫20倍柱體積，繼用石油醚：乙酸乙酯= 100 :50洗脫30倍柱體積，洗脫液經(jīng)回收有機溶劑，真空干燥，即為該提取物，收率6. 6%。
[0103] 實施例4:
[0104] 取沒藥枝20g，經(jīng)100mL乙醇超聲提取15min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上 樣后的硅膠柱（I. 5cm內(nèi)徑小柱），先用石油醚洗脫20倍柱體積，繼用石油醚：乙酸乙酯= 100 :50洗脫30倍柱體積，洗脫液經(jīng)回收有機溶劑，冷凍干燥，即為該提取物，收率5. 1 %。
[0105] 實施例5 :
[0106] 取沒藥枝20g，經(jīng)100mL丙酮超聲提取15min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上 樣后的硅膠柱（I. 5cm內(nèi)徑小柱），先用石油醚洗脫20倍柱體積，繼用石油醚：乙酸乙酯= 100 :50洗脫30倍柱體積，洗脫液經(jīng)回收有機溶劑，鼓風(fēng)干燥，即為該提取物，收率4. 8%。
[0107] 實施例6:
[0108] 取沒藥枝20g，經(jīng)100mL氯仿超聲提取15min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上 樣后的硅膠柱（I. 5cm內(nèi)徑小柱），先用石油醚洗脫20倍柱體積，繼用石油醚：乙酸乙酯= 100 :50洗脫30倍柱體積，洗脫液經(jīng)回收有機溶劑，離心干燥，即為該提取物，收率3. 7%。
[0109] 實施例7 :
[0110] 取沒藥枝20g，經(jīng)100mL乙酸乙酯超聲提取15min，提取液濃縮后，用硅膠柱分 離，上樣后的硅膠柱（I. 5cm內(nèi)徑小柱），先用石油醚洗脫20倍柱體積，繼用石油醚：乙酸 乙酯=100 :50洗脫30倍柱體積，洗脫液經(jīng)回收有機溶劑，旋蒸干燥，即為該提取物，收率 4. 4%〇
[0111] 實施例8:
[0112] 取沒藥枝20g，經(jīng)100mL甲醇水混合溶劑（甲醇：水=1:1)超聲提取15min，提取 液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（I. 5cm內(nèi)徑小柱），先用石油醚洗脫20倍柱體 積，繼用石油醚：乙酸乙酯=100 :50洗脫30倍柱體積，洗脫液經(jīng)回收有機溶劑，冷凍干燥， 即為該提取物，收率5. 3%。
[0113] 實施例9:
[0114] 取沒藥枝20g，經(jīng)100mL乙醇水混合溶劑（乙醇：水=1:1)超聲提取15min，提取 液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（I. 5cm內(nèi)徑小柱），先用石油醚洗脫20倍柱體 積，繼用石油醚：乙酸乙酯=100 :50洗脫30倍柱體積，洗脫液經(jīng)回收有機溶劑，真空干燥， 即為該提取物，收率5.0%。
[0115] 實施例9:
[0116] 取沒藥枝20g，經(jīng)100mL乙醇水混合溶劑（乙醇：水=90:10)超聲提取15min，提 取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（I. 5cm內(nèi)徑小柱），先用石油醚洗脫20倍柱體 積，繼用石油醚：乙酸乙酯=100 :50洗脫30倍柱體積，洗脫液經(jīng)回收有機溶劑，冷凍干燥， 即為該提取物，收率4. 5%。
[0117] 實施例10 :固體分散體
[0118] 稱取沒藥枝提取物和載體聚乙烯吡咯烷酮（PVP)按比例、1:2、1:4、1:6的質(zhì)量比 分別放入燒杯中，加入無水乙醇，磁力攪拌器攪拌至沒藥枝提取物和載體完全溶解，轉(zhuǎn)入旋 蒸儀中去除有機溶劑，干燥，粉碎過80目篩，即得沒藥枝提取物PVP包合物。
[0119] 實施例11 :環(huán)糊精包合物
[0120] 將β -環(huán)糊精與1~5倍水研勻，加沒藥枝提取物（水難溶性的應(yīng)先溶于少量有 機溶劑中）充分研磨至成糊狀物，低溫干燥即得。
[0121] 實施例12 :分散片
[0122] 1.稱取干燥的沒藥枝提取物，加入適量的十二烷基硫酸鈉，使用70%的乙醇充分 溶解，加入水溶性淀粉與沒藥枝提取物（1 :1)，攪拌混合均勻，在70°C下干燥，粉碎，過100 目篩，得沒藥枝提取物分散體。
[0123] 2.精密稱取處方量，沒藥枝提取物分散體，交聯(lián)聚維酮，可壓性淀粉，用70 %乙醇 做濕潤劑，邊加入邊攪拌，14目篩制成濕顆粒，室溫下放置15min后，70°C烘箱烘干45min， 16目篩整粒，加入滑石粉和微分硅膠，混合均勻后，壓片。
【主權(quán)項】
1. 一種維吾爾藥沒藥枝提取物，其特征為，維吾爾藥沒藥枝經(jīng)溶劑超聲提取，提取液濃 縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱，先用石油醚洗脫，繼用甲醇溶劑洗脫，甲醇洗脫液干 燥后即得； 或維吾爾藥沒藥枝經(jīng)溶劑超聲提取，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后 的硅膠柱，先用石油醚洗脫，繼用石油醚：乙酸乙酯=100 :10-100 :50的溶 劑洗脫，收集100 :10-100 :50的洗脫液，洗脫液干燥后得提取物。2. 如權(quán)利要求1所述的維吾爾藥沒藥枝提取物，其特征在于，所述的溶劑為甲醇、乙 醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶劑或乙醇水混合溶劑，最優(yōu)為甲醇和95%乙醇。3. 如權(quán)利要求1所述的維吾爾藥沒藥枝提取物，其特征為，樣后的硅膠柱，先用石油醚 洗脫2-50倍柱體積，繼用甲醇洗脫2-50倍柱體積；優(yōu)選先用石油醚洗脫10倍柱體積，繼用 甲醇洗脫15倍柱體積。4. 如權(quán)利要求1所述的維吾爾藥沒藥枝提取物，其特征為，先用石油醚2-50倍洗脫，繼 用石油醚：乙酸乙酯=100 :10-100 :50的溶劑2-50倍洗脫，優(yōu)選先用石油醚10倍洗脫，繼 用石油醚：乙酸乙酯=100 :10-100 :50的溶劑15倍洗脫。5. -種藥物組合物，其特征在于，包含權(quán)利要求1-4任何一項所述的沒藥枝提取物和 藥學(xué)上可接受的載體。6. -種藥物制劑，其特征在于，包含權(quán)利要求1-4任何一項所述的沒藥枝提取物或權(quán) 利要求5所述的藥物組合物。7. 如權(quán)利要求6所述的藥物制劑，其特征在于，所述的制劑為固體分散體、環(huán)糊精包合 物、分散片。8. 權(quán)利要求1-4任何一項所述的沒藥枝提取物或權(quán)利要求5所述的組合物或權(quán)利要求 6所述的藥物制劑在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。9. 如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征為，所述的腫瘤為乳腺癌、宮頸癌、肝癌、肺癌、胃 癌、結(jié)腸癌、胰腺癌或腦膠質(zhì)瘤。10. 權(quán)利要求1-4任何一項所述的維吾爾藥沒藥枝提取物，其特征在于，用TLC法檢 測，其色譜條件為：GF254硅膠板，展開系統(tǒng)：石油醚：乙酸乙酯：丙酮=6:1:1，顯色方法：香 草醛-濃硫酸。
【文檔編號】A61P35/00GK105982942SQ201510081741
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月15日
【發(fā)明人】王金輝, 黃健, 鄭雅鑫
【申請人】沈陽藥科大學(xué)