一種復(fù)方丹參浸膏中低聚糖成分的含量測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及一種中藥有效成分的檢測(cè)方法，特別涉及一種復(fù)方丹參浸膏中低聚糖 成分的含量測(cè)定方法。
【背景技術(shù)】：
[0002] 復(fù)方丹參制劑為丹參、三七和冰片制備而成的心血管藥物，目前已經(jīng)上市的有復(fù) 方丹參膠囊，復(fù)方丹參片和復(fù)方丹參滴丸。特別是復(fù)方丹參滴丸在臨床上廣泛用于冠心病、 心絞痛的預(yù)防、治療、急救。現(xiàn)已成為國(guó)內(nèi)心血管市場(chǎng)上的主導(dǎo)品牌之一。
[0003] 復(fù)方丹參浸膏，為丹參和三七的提取物，是復(fù)方丹參制劑的中間體，現(xiàn)有提取方法 有多種，主要活性成分包括，原兒茶醛、三七皂苷R1、丹酚酸B、丹參酮II A與丹參素，復(fù)方丹 參制劑上市十余年中，復(fù)方丹參浸膏已經(jīng)建立起了一整套全面地的工藝質(zhì)量控制體系，并 且不斷進(jìn)行完善和補(bǔ)充。
[0004] 糖類成分廣泛分布于植物的各個(gè)部位，也是中藥材及中藥產(chǎn)品中的主要組成成 分，所占含量比例很高。另外，許多糖類成分對(duì)于中藥活性成分具有輔助藥效作用，同時(shí)糖 類成分本身也具有為機(jī)體提供能量的作用，因此糖類成分的測(cè)定對(duì)于全面掌握中藥材及中 藥產(chǎn)品質(zhì)量非常重要。
[0005] 通過高效凝膠滲透色譜法（HPGPC)測(cè)定，復(fù)方丹參浸膏中的糖類成分分子量均在 2000以下，屬于單糖或低聚糖類。采用聚丙烯酰胺凝膠對(duì)復(fù)方丹參浸膏中的低聚糖成分進(jìn) 行了分離純化，分離得到了五個(gè)低聚糖成分，分別為果糖、葡萄糖、蔗糖、Glu-Fru-Gal三糖 和Gal-Gal-Glu-Fru四糖。所以測(cè)定它們的含量非常必要。
[0006] 針對(duì)糖類成分的常用測(cè)定方法有化學(xué)分析法、氣相色譜法、離子交換色譜法、凝膠 色譜法、毛細(xì)管電泳法、衍生化氣相色譜法等。但這些方法穩(wěn)定性差，靈敏度不高。
[0007] 為得到一種全新的含量測(cè)定方法，同時(shí)測(cè)定復(fù)方丹參浸膏中五種低聚糖成分，本 發(fā)明采用高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（HPLC - EL SD)法，具有穩(wěn)定性好、靈敏度高、能 夠進(jìn)行梯度洗脫等優(yōu)點(diǎn)。
[0008] 本發(fā)明是以"全面表征中藥制劑的質(zhì)量"為目標(biāo)，針對(duì)復(fù)方丹參浸膏產(chǎn)品，采用 SPE - HPLC - ELSD方法，利用五種低聚糖對(duì)照品作為標(biāo)定物，配合固相萃取技術(shù)和HPLC -ELSD方法，建立了一種復(fù)方丹參低聚糖的含量測(cè)定方法。
[0009] 本方法用于低聚糖成分測(cè)定，簡(jiǎn)單快捷、選擇性高，分離度好，取得了良好的效果。 較前期方法，增加了檢測(cè)成分，縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了柱效和分離效率，達(dá)到了對(duì)糖類成 分的全面表征和測(cè)定，節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間，降低了溶劑消耗。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0010] 本發(fā)明提供一種復(fù)方丹參浸膏中低聚糖成分的含量測(cè)定方法，其中所述復(fù)方丹參 浸膏，制備方法如下：取丹參、三七飲片，用純化水煎煮提取兩次，第一次1 - 2小時(shí)，第二次 約1 -1. 5小時(shí)。提取液合并、濾過，濾液濃縮，加入乙醇，靜置使沉淀，取上清液，回收乙醇， 濃縮成稠膏。 toon] 本發(fā)明的含量測(cè)定方法，包括以下步驟：
[0012] (1)對(duì)照品溶液的制備
[0013] 稱取果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖和Gal - Gal - Glu - Fru四糖對(duì)照品，加水制得混 合對(duì)照品洛液；
[0014] ⑵供試品溶液的制備
[0015] 取復(fù)方丹參浸膏，加水溶解，上固相萃取柱，用水洗滌，收集上樣液和洗滌液，加水 制得供試品溶液；
[0016] (3)測(cè)定法：
[0017] 吸取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液，注入蒸發(fā)光散射高效液相色譜儀，得到色譜 圖，根據(jù)色譜圖計(jì)算供試品中低聚糖的含量；
[0018] 其中，所述蒸發(fā)光散射高效液相色譜儀的色譜條件如下：
[0019] 色譜柱選自：氨基柱、鈣型柱、復(fù)合物色譜柱，柱長(zhǎng)：150 - 300mm，
[0020] 流動(dòng)相：乙腈和ο -ο. 5%的甲酸水或乙酸水為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相的流 速為(λ 6 - L OmL/min，柱溫 25 - 35°C，
[0021] ELSD檢測(cè)器漂移管溫度為55 - 65°C，氣壓20 - 40psi。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明，步驟（2)中的固相萃取柱選自ProElut PLS，Waters Oasis WAX-SPE，或者采用D101大孔樹脂柱。優(yōu)選ProElut PLS，0. 5g. 6mL - 1。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明，步驟（3)中流動(dòng)相優(yōu)選為乙腈和0 -0. 5%的甲酸水。進(jìn)一步地，采用 乙腈和體積比為〇. 1%的甲酸水為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫，梯度程序見表1 ;
[0024] 表1流動(dòng)相梯度程序
[0025]
[0026] 根據(jù)本發(fā)明，步驟（3)中的色譜柱優(yōu)選為PrevailTM Carbohydrate ES色譜柱。流 動(dòng)相的流速為〇. 8mL/min，柱溫30°C。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選：Waters 2695液相色譜儀，2424ELSD檢測(cè)器。ELSD檢測(cè)器漂移 管溫度為60°C，氣壓30psi。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式之一，步驟（1)中混合對(duì)照品溶液中果糖、葡萄糖、蔗糖、 棉子糖和Gal - Gal - Glu - Fru四糖的濃度分別為每毫升含上述物質(zhì)0. 5、0. 5、0. 5、0. 3和 2. 5mg〇
[0029] 本發(fā)明的含量測(cè)定方法，優(yōu)選的，包括以下步驟：
[0030] (1)對(duì)照品溶液的制備
[0031] 精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥過的果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖（Glu - Fru - Gal三糖 含量以棉子糖計(jì)）和Gal - Gal - Glu - Fru四糖對(duì)照品適量，加水制得每毫升含上述物質(zhì)分 別為0. 5、0. 5、0. 5、0. 3和2. 5mg的混合對(duì)照品溶液。
[0032] (2)供試品溶液的制備
[0033] 取復(fù)方丹參浸膏0. 5g，精密稱定，加水20ml，超聲溶解，上至ProElut PLS， 0. 5g. 6mL - 1固相萃取柱，再用水洗滌固相萃取柱，收集上樣液和洗滌流出液，合并，轉(zhuǎn)移至 50ml量瓶中，加水至刻度，混勻，取供試品溶液10 μ 1，注入液相色譜儀，測(cè)定即得。
[0034] (3)測(cè)定法：
[0035] 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液5 μ 1、10 μ 1，供試品溶液10 μ 1，注入液相色譜儀， 測(cè)定，用外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程分別計(jì)算果糖、葡萄糖、鹿糖、Glu -Fru -Gal三糖和Gal -Gal -Glu-Fru四糖的含量，即得。
[0036] 其中，色譜條件如下：
[0037] PrevailTM Carbohydrate ES 色譜柱，
[0038] 乙腈和0. 1 %甲酸水為流動(dòng)相梯度洗脫，梯度程序如下：
[0039]
[0040] 流速刃 U. 8mL/min,枉溫;iU-U。
[0041] ELSD檢測(cè)器漂移管溫度為60°C，氣壓30psi。
[0042] 以下為本發(fā)明相關(guān)術(shù)語解釋
[0043] ELSD - HPLC :蒸發(fā)光散射高效液相色譜檢測(cè)法。SPE固相萃取法。
[0044] Glu - Fru - Gal 三糖：a - D -批喃葡萄糖-(1 - 2) - β -D -呋喃果糖-(1 - 1)-β - D-吡喃半乳糖
[0045] Gal - Gal - Glu - Fru 四糖：0 - a - D -吡喃半乳糖-(1 - 6) - 0 - a - D -吡喃 半乳糖-(1 - 6) - 0 - α - D -吡喃葡萄糖-(1 - 2) - 0 - α - D -呋喃果糖
[0046] 棉子糖：a - D -吡喃半乳糖基-(1 - 6) - a - D -吡喃葡萄糖基-(1 - 2) - β -D -呋喃果糖
[0047] 本發(fā)明的方法是經(jīng)過篩選獲得的，篩選過程如下：
[0048] 一、色譜條件考察：
[0049] (1)色譜柱的選擇
[0050] 本發(fā)明對(duì)比了兩種不同廠牌色譜柱，（A) Hypersil GOLD Amide ; (B) PrevailTM Carbohydrate ES.。從液相色譜圖（參見附圖1)的對(duì)比中可以看出，待分析成分在A型色 譜柱上出峰較快，但前三個(gè)色譜峰分離效果不好，B型色譜柱分離度良好，且時(shí)間適中，因此 本發(fā)明優(yōu)化選用（B)型色譜柱。
[0051] (2)洗脫梯度的篩選：
[0052] 本方法選擇最常用的乙腈一水系統(tǒng)，使果糖、葡萄糖和蔗糖色譜峰得到了良好的 分離效果。對(duì)于后面的低聚糖色譜峰采用了不同梯度條件，在保證分離度的前提下尋求最
[0055] 短檢驗(yàn)周期，梯度條件如下：[0053] 梯度條件1、[0054]
[0056]
[0057] 不同條件下所得色譜圖參見附圖2,可見條件2的情況下檢驗(yàn)周期最短。
[0058] 二、方法學(xué)考察
[0059] (1)精密度試驗(yàn)
[0060] 依法制備供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄果糖、葡萄糖、蔗糖、Glu - Fru - Gal三 糖和Gal - Gal - Glu - Fru四糖的峰面積，計(jì)算得峰面積的平均值分別為953247、284451和 308657U278499 和 1095142, RSD 分別為 2. 2%、2. 4%、L 9%、2· 4%和 L 5%，儀器精密度 良好。
[0061] (2)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)
[0062] 取復(fù)方丹參浸膏樣品，依法制備供試品溶液6份，分別測(cè)定果糖、葡萄糖、蔗糖、 Glu -Fru -Gal三糖和Gal -Gal -Glu -Fru四糖的含量，計(jì)算得含量的平均值分別為3. 77%、 2· 91%、8· 44%、2· 28%和 21. 11，RSD 分別為 1. 8%、1· 8%、1· 6%、2· 3%和 1. 8%，樣品重現(xiàn) 性良好。
[0063] (3)穩(wěn)定性試驗(yàn)
[0064] 取復(fù)方丹參浸膏樣品，依法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、24小時(shí)進(jìn)樣，記錄 峰面積并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，果糖、葡萄糖、蔗糖、Glu - Fru - Gal三糖和Gal - Gal - Glu -Fru四糖峰面積的RSD分別為1. 2%、1. 6%、1. 5%、2. 0%和1. 8%，表明供試品溶液在24小 時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。
[0065] 三、線性關(guān)系考察
[0066] 精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥過的果糖、葡萄糖、蔗糖、水蘇糖和Gal - Gal - Glu -Fru四糖對(duì)照品適量，加水制成系列混合對(duì)照溶液，注入液相色譜儀，測(cè)定，以濃度的對(duì)數(shù)對(duì) 測(cè)得的峰面積的對(duì)數(shù)進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程。結(jié)果見表2。
[0067] 表2回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍
[0068]
[0069] 結(jié)果表明在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)，五種低聚糖的峰面積的對(duì)數(shù)與濃度線性關(guān)系良好。
[0070] 四、測(cè)量結(jié)果的加樣回收率考察
[0071] 精密稱取0. 20g、0. 25g和0. 30g的復(fù)方丹參浸膏，各稱3份，置燒杯中，分別精密 加入與含量相應(yīng)的對(duì)照品，自"加水約20ml"起，照含量測(cè)定項(xiàng)下依法處理，作為供試品溶 液，取l〇ul注入色譜儀，分別計(jì)算回收率，結(jié)果表明樣品回收率良好。
[0072] 表3回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（mg, η = 6)
[0073]
[0074]
[0075] 本發(fā)明采用自制Gal-Gal-Glu-Fru四糖標(biāo)準(zhǔn)品作為Gal-Gal-Glu-Fru四糖對(duì)照 品，經(jīng)過對(duì)復(fù)方丹參浸膏的五步分離純化，純度達(dá)到