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一種復(fù)方丹參浸膏中低聚糖成分的含量測(cè)定方法

文檔序號(hào):9909186閱讀:806來源:國(guó)知局
一種復(fù)方丹參浸膏中低聚糖成分的含量測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001] 本發(fā)明涉及一種中藥有效成分的檢測(cè)方法,特別涉及一種復(fù)方丹參浸膏中低聚糖 成分的含量測(cè)定方法。
【背景技術(shù)】:
[0002] 復(fù)方丹參制劑為丹參、三七和冰片制備而成的心血管藥物,目前已經(jīng)上市的有復(fù) 方丹參膠囊,復(fù)方丹參片和復(fù)方丹參滴丸。特別是復(fù)方丹參滴丸在臨床上廣泛用于冠心病、 心絞痛的預(yù)防、治療、急救。現(xiàn)已成為國(guó)內(nèi)心血管市場(chǎng)上的主導(dǎo)品牌之一。
[0003] 復(fù)方丹參浸膏,為丹參和三七的提取物,是復(fù)方丹參制劑的中間體,現(xiàn)有提取方法 有多種,主要活性成分包括,原兒茶醛、三七皂苷R1、丹酚酸B、丹參酮II A與丹參素,復(fù)方丹 參制劑上市十余年中,復(fù)方丹參浸膏已經(jīng)建立起了一整套全面地的工藝質(zhì)量控制體系,并 且不斷進(jìn)行完善和補(bǔ)充。
[0004] 糖類成分廣泛分布于植物的各個(gè)部位,也是中藥材及中藥產(chǎn)品中的主要組成成 分,所占含量比例很高。另外,許多糖類成分對(duì)于中藥活性成分具有輔助藥效作用,同時(shí)糖 類成分本身也具有為機(jī)體提供能量的作用,因此糖類成分的測(cè)定對(duì)于全面掌握中藥材及中 藥產(chǎn)品質(zhì)量非常重要。
[0005] 通過高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)測(cè)定,復(fù)方丹參浸膏中的糖類成分分子量均在 2000以下,屬于單糖或低聚糖類。采用聚丙烯酰胺凝膠對(duì)復(fù)方丹參浸膏中的低聚糖成分進(jìn) 行了分離純化,分離得到了五個(gè)低聚糖成分,分別為果糖、葡萄糖、蔗糖、Glu-Fru-Gal三糖 和Gal-Gal-Glu-Fru四糖。所以測(cè)定它們的含量非常必要。
[0006] 針對(duì)糖類成分的常用測(cè)定方法有化學(xué)分析法、氣相色譜法、離子交換色譜法、凝膠 色譜法、毛細(xì)管電泳法、衍生化氣相色譜法等。但這些方法穩(wěn)定性差,靈敏度不高。
[0007] 為得到一種全新的含量測(cè)定方法,同時(shí)測(cè)定復(fù)方丹參浸膏中五種低聚糖成分,本 發(fā)明采用高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(HPLC - EL SD)法,具有穩(wěn)定性好、靈敏度高、能 夠進(jìn)行梯度洗脫等優(yōu)點(diǎn)。
[0008] 本發(fā)明是以"全面表征中藥制劑的質(zhì)量"為目標(biāo),針對(duì)復(fù)方丹參浸膏產(chǎn)品,采用 SPE - HPLC - ELSD方法,利用五種低聚糖對(duì)照品作為標(biāo)定物,配合固相萃取技術(shù)和HPLC -ELSD方法,建立了一種復(fù)方丹參低聚糖的含量測(cè)定方法。
[0009] 本方法用于低聚糖成分測(cè)定,簡(jiǎn)單快捷、選擇性高,分離度好,取得了良好的效果。 較前期方法,增加了檢測(cè)成分,縮短了檢測(cè)時(shí)間,提高了柱效和分離效率,達(dá)到了對(duì)糖類成 分的全面表征和測(cè)定,節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間,降低了溶劑消耗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明提供一種復(fù)方丹參浸膏中低聚糖成分的含量測(cè)定方法,其中所述復(fù)方丹參 浸膏,制備方法如下:取丹參、三七飲片,用純化水煎煮提取兩次,第一次1 - 2小時(shí),第二次 約1 -1. 5小時(shí)。提取液合并、濾過,濾液濃縮,加入乙醇,靜置使沉淀,取上清液,回收乙醇, 濃縮成稠膏。 toon] 本發(fā)明的含量測(cè)定方法,包括以下步驟:
[0012] (1)對(duì)照品溶液的制備
[0013] 稱取果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖和Gal - Gal - Glu - Fru四糖對(duì)照品,加水制得混 合對(duì)照品洛液;
[0014] ⑵供試品溶液的制備
[0015] 取復(fù)方丹參浸膏,加水溶解,上固相萃取柱,用水洗滌,收集上樣液和洗滌液,加水 制得供試品溶液;
[0016] (3)測(cè)定法:
[0017] 吸取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液,注入蒸發(fā)光散射高效液相色譜儀,得到色譜 圖,根據(jù)色譜圖計(jì)算供試品中低聚糖的含量;
[0018] 其中,所述蒸發(fā)光散射高效液相色譜儀的色譜條件如下:
[0019] 色譜柱選自:氨基柱、鈣型柱、復(fù)合物色譜柱,柱長(zhǎng):150 - 300mm,
[0020] 流動(dòng)相:乙腈和ο -ο. 5%的甲酸水或乙酸水為流動(dòng)相,進(jìn)行梯度洗脫,流動(dòng)相的流 速為(λ 6 - L OmL/min,柱溫 25 - 35°C,
[0021] ELSD檢測(cè)器漂移管溫度為55 - 65°C,氣壓20 - 40psi。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明,步驟(2)中的固相萃取柱選自ProElut PLS,Waters Oasis WAX-SPE,或者采用D101大孔樹脂柱。優(yōu)選ProElut PLS,0. 5g. 6mL - 1。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明,步驟(3)中流動(dòng)相優(yōu)選為乙腈和0 -0. 5%的甲酸水。進(jìn)一步地,采用 乙腈和體積比為〇. 1%的甲酸水為流動(dòng)相,進(jìn)行梯度洗脫,梯度程序見表1 ;
[0024] 表1流動(dòng)相梯度程序
[0025]
[0026] 根據(jù)本發(fā)明,步驟(3)中的色譜柱優(yōu)選為PrevailTM Carbohydrate ES色譜柱。流 動(dòng)相的流速為〇. 8mL/min,柱溫30°C。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明,優(yōu)選:Waters 2695液相色譜儀,2424ELSD檢測(cè)器。ELSD檢測(cè)器漂移 管溫度為60°C,氣壓30psi。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式之一,步驟(1)中混合對(duì)照品溶液中果糖、葡萄糖、蔗糖、 棉子糖和Gal - Gal - Glu - Fru四糖的濃度分別為每毫升含上述物質(zhì)0. 5、0. 5、0. 5、0. 3和 2. 5mg〇
[0029] 本發(fā)明的含量測(cè)定方法,優(yōu)選的,包括以下步驟:
[0030] (1)對(duì)照品溶液的制備
[0031] 精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥過的果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖(Glu - Fru - Gal三糖 含量以棉子糖計(jì))和Gal - Gal - Glu - Fru四糖對(duì)照品適量,加水制得每毫升含上述物質(zhì)分 別為0. 5、0. 5、0. 5、0. 3和2. 5mg的混合對(duì)照品溶液。
[0032] (2)供試品溶液的制備
[0033] 取復(fù)方丹參浸膏0. 5g,精密稱定,加水20ml,超聲溶解,上至ProElut PLS, 0. 5g. 6mL - 1固相萃取柱,再用水洗滌固相萃取柱,收集上樣液和洗滌流出液,合并,轉(zhuǎn)移至 50ml量瓶中,加水至刻度,混勻,取供試品溶液10 μ 1,注入液相色譜儀,測(cè)定即得。
[0034] (3)測(cè)定法:
[0035] 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液5 μ 1、10 μ 1,供試品溶液10 μ 1,注入液相色譜儀, 測(cè)定,用外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程分別計(jì)算果糖、葡萄糖、鹿糖、Glu -Fru -Gal三糖和Gal -Gal -Glu-Fru四糖的含量,即得。
[0036] 其中,色譜條件如下:
[0037] PrevailTM Carbohydrate ES 色譜柱,
[0038] 乙腈和0. 1 %甲酸水為流動(dòng)相梯度洗脫,梯度程序如下:
[0039]
[0040] 流速刃 U. 8mL/min,枉溫;iU-U。
[0041] ELSD檢測(cè)器漂移管溫度為60°C,氣壓30psi。
[0042] 以下為本發(fā)明相關(guān)術(shù)語解釋
[0043] ELSD - HPLC :蒸發(fā)光散射高效液相色譜檢測(cè)法。SPE固相萃取法。
[0044] Glu - Fru - Gal 三糖:a - D -批喃葡萄糖-(1 - 2) - β -D -呋喃果糖-(1 - 1)-β - D-吡喃半乳糖
[0045] Gal - Gal - Glu - Fru 四糖:0 - a - D -吡喃半乳糖-(1 - 6) - 0 - a - D -吡喃 半乳糖-(1 - 6) - 0 - α - D -吡喃葡萄糖-(1 - 2) - 0 - α - D -呋喃果糖
[0046] 棉子糖:a - D -吡喃半乳糖基-(1 - 6) - a - D -吡喃葡萄糖基-(1 - 2) - β -D -呋喃果糖
[0047] 本發(fā)明的方法是經(jīng)過篩選獲得的,篩選過程如下:
[0048] 一、色譜條件考察:
[0049] (1)色譜柱的選擇
[0050] 本發(fā)明對(duì)比了兩種不同廠牌色譜柱,(A) Hypersil GOLD Amide ; (B) PrevailTM Carbohydrate ES.。從液相色譜圖(參見附圖1)的對(duì)比中可以看出,待分析成分在A型色 譜柱上出峰較快,但前三個(gè)色譜峰分離效果不好,B型色譜柱分離度良好,且時(shí)間適中,因此 本發(fā)明優(yōu)化選用(B)型色譜柱。
[0051] (2)洗脫梯度的篩選:
[0052] 本方法選擇最常用的乙腈一水系統(tǒng),使果糖、葡萄糖和蔗糖色譜峰得到了良好的 分離效果。對(duì)于后面的低聚糖色譜峰采用了不同梯度條件,在保證分離度的前提下尋求最
[0055] 短檢驗(yàn)周期,梯度條件如下:[0053] 梯度條件1、[0054]
[0056]
[0057] 不同條件下所得色譜圖參見附圖2,可見條件2的情況下檢驗(yàn)周期最短。
[0058] 二、方法學(xué)考察
[0059] (1)精密度試驗(yàn)
[0060] 依法制備供試品溶液,重復(fù)進(jìn)樣6次,記錄果糖、葡萄糖、蔗糖、Glu - Fru - Gal三 糖和Gal - Gal - Glu - Fru四糖的峰面積,計(jì)算得峰面積的平均值分別為953247、284451和 308657U278499 和 1095142, RSD 分別為 2. 2%、2. 4%、L 9%、2· 4%和 L 5%,儀器精密度 良好。
[0061] (2)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)
[0062] 取復(fù)方丹參浸膏樣品,依法制備供試品溶液6份,分別測(cè)定果糖、葡萄糖、蔗糖、 Glu -Fru -Gal三糖和Gal -Gal -Glu -Fru四糖的含量,計(jì)算得含量的平均值分別為3. 77%、 2· 91%、8· 44%、2· 28%和 21. 11,RSD 分別為 1. 8%、1· 8%、1· 6%、2· 3%和 1. 8%,樣品重現(xiàn) 性良好。
[0063] (3)穩(wěn)定性試驗(yàn)
[0064] 取復(fù)方丹參浸膏樣品,依法制備供試品溶液,分別于0、2、4、8、24小時(shí)進(jìn)樣,記錄 峰面積并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,果糖、葡萄糖、蔗糖、Glu - Fru - Gal三糖和Gal - Gal - Glu -Fru四糖峰面積的RSD分別為1. 2%、1. 6%、1. 5%、2. 0%和1. 8%,表明供試品溶液在24小 時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。
[0065] 三、線性關(guān)系考察
[0066] 精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥過的果糖、葡萄糖、蔗糖、水蘇糖和Gal - Gal - Glu -Fru四糖對(duì)照品適量,加水制成系列混合對(duì)照溶液,注入液相色譜儀,測(cè)定,以濃度的對(duì)數(shù)對(duì) 測(cè)得的峰面積的對(duì)數(shù)進(jìn)行線性回歸,求得回歸方程。結(jié)果見表2。
[0067] 表2回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍
[0068]
[0069] 結(jié)果表明在相應(yīng)濃度范圍內(nèi),五種低聚糖的峰面積的對(duì)數(shù)與濃度線性關(guān)系良好。
[0070] 四、測(cè)量結(jié)果的加樣回收率考察
[0071] 精密稱取0. 20g、0. 25g和0. 30g的復(fù)方丹參浸膏,各稱3份,置燒杯中,分別精密 加入與含量相應(yīng)的對(duì)照品,自"加水約20ml"起,照含量測(cè)定項(xiàng)下依法處理,作為供試品溶 液,取l〇ul注入色譜儀,分別計(jì)算回收率,結(jié)果表明樣品回收率良好。
[0072] 表3回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(mg, η = 6)
[0073]
[0074]
[0075] 本發(fā)明采用自制Gal-Gal-Glu-Fru四糖標(biāo)準(zhǔn)品作為Gal-Gal-Glu-Fru四糖對(duì)照 品,經(jīng)過對(duì)復(fù)方丹參浸膏的五步分離純化,純度達(dá)到
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