乳腺癌診斷標記物組合、應(yīng)用及其測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種乳腺癌診斷標記物組合、應(yīng)用及其測定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年上升。女性乳腺癌患者的長期生存率與疾病發(fā)現(xiàn)和被診斷的時間及階段密切相關(guān)，乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷，是提高療效的關(guān)鍵，能大大減少乳腺癌的死亡率。目前使用最廣泛的篩查乳腺癌的方法是乳房X光檢查，該方法的靈敏度方法為54%-77%。還有其他的方法比如熱敏成像法和磁共振成像(MRI)也是常用的方法，但普遍靈敏度不高。因此尋找乳腺癌早期診斷的生物標志物非常重要?，F(xiàn)在已經(jīng)確定的腫瘤標記物包括癌胚抗原(CEA)、癌抗原(CA15-3, CA27.29，CA125)、組織多肽抗原和組織多肽特異性抗原等，但這些標記物由于敏感性和(或)特異性較低無法被推薦用于臨床乳腺癌的診斷，因而急需找到一種替代的方法。最近有關(guān)乳腺癌方面的代謝組學(xué)研究，通過研究癌癥患者和健康人的血漿/血清，尿液，唾液或者組織等樣本進行分析測試，尋找癌癥診斷標記物。然而到目前為止，尚未有關(guān)于診斷標志物對于乳腺癌區(qū)別于乳腺病以及其他惡性腫瘤的選擇性評價報道。
[0003]專利CN101493464公開了一種診斷乳腺癌的分子標記物，檢測乳房正常周邊組織與包塊組織中的硫氧還蛋白(TH10RED0XIN，TRX)和硫氧還蛋白結(jié)合蛋2(TRX-BINDINGPR0TEIN-2, TBP-2)的表達。采用蛋白免疫印跡實驗檢測硫氧還蛋白、硫氧還蛋白結(jié)合蛋白2的表達量，在乳腺包塊組織中硫氧還蛋白表達增高和硫氧還蛋白結(jié)合蛋白2表達降低，由于與正常乳腺組織存在顯著的差別，硫氧還蛋白和硫氧還蛋白結(jié)合蛋白2可以作為乳腺癌新的分子標記物，可用作為對乳腺癌臨床診斷。但該專利具有疾病早期靈敏度較低及對疾病早期檢測精度低的缺點。
[0004]專利CN103109187A公開了一種用于癌癥診斷、研究和治療的組合物和方法，包括但不限于癌癥標記物。具體地，本發(fā)明涉及用于受試者對癌癥治療的反應(yīng)的預(yù)測的組合物和方法。其包括a)檢測來自患有乳腺癌的受試者的樣品中的循環(huán)腫瘤細胞(CTC)水平；b)基于所述樣品中的所述CTC水平來確定作用療程。但該專利也具有疾病早期靈敏度較低及對疾病早期檢測精度低的缺點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]有鑒于此，本發(fā)明提供了一種乳腺癌診斷標記物組合、應(yīng)用及其測定方法。
[0006]為達到上述目的，具體技術(shù)方案如下:
[0007]—方面，提供了一種乳腺癌診斷標記物組合，為血漿或血清差異性代謝物，包括Aspartate (天(門)冬氨酸鹽(或酯))、Glutamate (谷氨酸鹽/谷氨酸酯)、5-0xoproline (焦谷氨酸)、Isoleucine (異亮氨酸)、Aminoacetone (氨基丙酮 / 丙酮基胺)、Delta-hydroxylysine (異輕賴氨酸)、Cystine (胱氨酸/雙硫丙氨酸)、Glutamine (谷氨酰胺)、Cysteine (半胱氨酸/巰基丙氨酸)、Hypotaurine (亞牛磺酸/氨乙基亞磺酸)、Asparagine (天門冬素/天冬酰胺酸)、Glycerolphosphate (甘油磷酸鹽/甘油磷酸酯)、Glycerophosphocholine (甘油磷酸膽堿)、Arachidonate (花生四烯酸酯/花生四烯酸鹽)、nicotinurate (煙尿酸)、Octadecanoate (十八酸鹽/硬脂酸鹽)、Choline (膽堿)、Myristoleate (十四碳烯酸酯)、Butyrylcarnitine ( 丁?；鈮A)、Prop1nylcarnitine (丙酰肉堿)、a -ketoglutarate ( α -酮戊二酸脫氫1 酶)、Lactate (乳酸)、Malate (蘋果酸鹽(或酯))、Glyoxylate (乙酸酸)、Pentosidine (戊糖素)、Uracil (尿啼唆 / 二氧啼唆)、Quinate (奎尼酸)、Epinephrineglucuronide (腎上腺素葡(萄)糖苷酸)中的一種或多種的組合。
[0008]優(yōu)選的,所述標記物包括Aspartate (天(門)冬氨酸鹽(或酯))、Glutamate (谷氨酸鹽/谷氨酸酯)、5-0xoproline(焦谷氨酸)、Cystine (胱氨酸/雙硫丙氨酸)、Glutamine (谷氨酰胺)、Cysteine (半胱氨酸/巰基丙氨酸)、Hypotaurine (亞?；撬?氨乙基亞磺酸)、Asparagine (天門冬素/天冬酰胺酸)、Glycerolphosphate (甘油磷酸鹽/甘油磷酸酯)、Glycerophosphocholine (甘油磷酸膽堿)、Arachidonate (花生四烯酸酯/花生四烯酸鹽)、Glyoxylate (乙酸酸)、Pentosidine (戊糖素)中的一種或多種的組合。
[0009]另一方面，提供了乳腺癌診斷標記物組合的應(yīng)用，用于診斷乳腺癌的試劑盒。
[0010]優(yōu)選的，診斷標記物的診斷樣品是血漿或血清。
[0011]另一方面，提供了乳腺癌診斷標記物組合的測定方法，包括以下步驟:
[0012]步驟I，取乳腺癌病人臨床血漿或者血清樣本和健康人對照血漿或者血清樣本；
[0013]步驟2，通過色譜質(zhì)譜聯(lián)用代謝組學(xué)分析方法分析鑒定乳腺癌病人臨床血漿/血清樣本和健康人對照血漿/血清樣本的初步差異性代謝物；
[0014]步驟3，在多維OPLS-DA模型的變量權(quán)重(VIP)值大于I及非參檢驗的P值小于0.05的選擇標準下，得到進一步差異性代謝物；
[0015]步驟4，進行邏輯回歸模型進行驗證，得到差異性代謝物。
[0016]優(yōu)選的，所述步驟I中包括不同地區(qū)的乳腺癌病人臨床血漿/血清樣本和健康人對照血漿/血清樣本。
[0017]優(yōu)選的，所述步驟I中包括乳腺癌患者、乳腺疾病患者、良性乳腺腫瘤患者和健康人對照血漿或者血清樣本。
[0018]優(yōu)選的，所述步驟2中的色譜質(zhì)譜聯(lián)用代謝組學(xué)分析方法包括液相/氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用代謝組學(xué)分析方法。
[0019]優(yōu)選的，所述步驟2中氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測試的色譜條件包括:RX1-5ms毛細管柱，載氣:超純氦氣，流量:1.0mL/min，進樣口溫度:260°C，傳輸線溫度:260°C，離子源溫度:210°C，進樣量:luL，進樣方式:不分流進樣，升溫程序:從80°C開始并持續(xù)2min，以10C /min的升溫速度升至220°C，之后以5°C /min的升溫速度升至240°C，再以25°C /min的升溫速度升至290°C，最后在290°C持續(xù)8min，質(zhì)譜離子源:EI源，電子轟擊能量:70eV，質(zhì)譜掃描范圍:m/z,40-600,全掃描方式。
[0020]優(yōu)選的，所述步驟2中液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測試的色譜條件包括=AgilentZ0RBAXEclipseXDB-C18 柱(4.6X 150mm, 5 μ m)，柱溫:30°C。流動相 A:水(0.1%甲酸)，B:乙腈(0.1%甲酸，)，流動相洗脫梯度為0-25min:1-100% B，流速:0.4mL/min，進樣量:10yL。飛行時間質(zhì)譜優(yōu)化條件為:(1)正離子模式(ES+)，毛細管電壓3500V，噴霧器45psig，干燥氣溫度325°C，干燥器流速llL/min;(2)負離子模式(ES-)，毛細管電壓3000V，其他參數(shù)與正離子模式一致。在代謝物譜分析時，數(shù)據(jù)采集形式為plot和centroid同時進行，采集質(zhì)量范圍為50-1000Da。
[0021]優(yōu)選的，所述步驟2中氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測試的血清樣本前處理包括:取50 μ L血清，加入1ul氯苯丙氨酸(0.lmg/mL，水溶)和10 μ L十七酸(lmg/mL，醇溶)作為內(nèi)標來監(jiān)測樣本的重現(xiàn)性；再加入175 μ L氯仿甲醇混合溶劑(l:3，v/v)，渦旋振蕩30s ;置離心管于-20°C放置1min以促進蛋白沉淀；然后13000rpm離心1min,取上清200 μ L于高回收進樣瓶中，室溫下真空干燥得到樣本品。
[0022]優(yōu)選的，所述步驟2中樣本品經(jīng)抽干后使用兩步法進行衍生，首先加入50 μ L甲氧胺(15mg/mL，吡啶溶)，渦旋振蕩30s，在30°C下反應(yīng)90min，然后再加入50 μ LBSTFA (含I %TMCS)在70°C反應(yīng)60min，靜置后進行GC-TOFMS分析。
[0023]優(yōu)選的，所述步驟2中液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測試的血清樣本前處理包括:取50ul血清樣本與200ul含氯苯丙氨酸(5ug/mL，水溶)的甲醇乙腈混合液(5:3，v/v)混合，渦旋振蕩2min,靜置1min后,用13000rpm離心20min,取上清液。
[0024]相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的技術(shù)方首次提出Aspartate, Glutamate,
5— OxoproIine, Cystine, Glutamine, Cysteine, Hypotaurine, Asparagine ,Glycerolphosphate,Glycerophosphocholine,Arachidonate,Glyoxylate,Pentosidine 作為乳腺癌診斷標記物，對乳腺癌的診斷具有高靈敏度和高特異性，并且對于早期乳腺腺癌診斷也具有較高的靈敏度和特異性，可用于乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)，為患者爭取時間，盡早開始治療，提高臨床治療效果。同時通過運用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-TOFMS)和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-TOFMS)對乳腺癌病人及健康人對照血漿或血清進行代謝物全譜分析測試，結(jié)合生物信息學(xué)工具，尋找差異性代謝物，并通過驗證確定其作為乳腺癌的診斷標記物，可以用于乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)和診斷，提高乳腺癌治療效果。
【附圖說明】
[0025]構(gòu)成本發(fā)明的一部分的附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，本發(fā)明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中:
[0026]圖1A是訓(xùn)練集中乳腺癌患者(η = 100)和正常對照(η = 80)之間血漿代謝物差異柱形圖。其中，變化倍數(shù)(FC)值通過計算在乳腺癌患者和健康人對照組中每個代謝物的平均強度比率得到。每一個柱狀分別代表一個FC值，不同灰度值對應(yīng)相應(yīng)的P值，說明各物質(zhì)的統(tǒng)計學(xué)意義；
[0027]圖1B是訓(xùn)練集乳腺癌血漿樣本的ROC曲線圖(包含13個代謝物組合成的代謝物組 Asp