培養(yǎng)基中，28°C，180rpm振蕩培養(yǎng)過 夜。取lmL液體培養(yǎng)物擴(kuò)繁至100mL含有上述抗生素，且另外附加了 lOmMMES和20μΜ乙酰丁香 酮的LB液體培養(yǎng)基中，28°C，180rpm振蕩培養(yǎng)過夜。室溫，5000rpm轉(zhuǎn)速，離心收集菌體，將菌 體重懸在含有100mM MES、10mM MgCl2、200uM乙酰丁香酮的MS液體培養(yǎng)基中。利用分光光度 計調(diào)整濃度為〇〇6〇〇=1.5，在黑暗處放置311(^1^1、了1^2農(nóng)桿菌侵染液的制備與了1^2-CrylAb/Ac相同。將制備好的TRV1分別與TRV2和TRV2-CrylAb/Ac農(nóng)桿菌侵染液等體積混勻， 制成對照侵染液和實(shí)驗(yàn)侵染液，分別加入0.2wt%的表面活性劑Silwet L-77。將GA3預(yù)培養(yǎng) 后的棉花幼胚分別浸入上述制備好的對照侵染液（TRV1和TRV2)和實(shí)驗(yàn)侵染液（TRV1和 TRV2-Cry 1 Ab/Ac)中，25 °C，120rpm/min，暗培養(yǎng)30分鐘，對棉花幼胚進(jìn)行接種。
[0074] 接種后的培養(yǎng):接種后，將幼胚放在滅菌濾紙上，吸去多余侵染液。在培養(yǎng)皿中鋪 放5層滅菌濾紙，用含有200μΜ乙酰丁香酮的MS液體培養(yǎng)基浸濕濾紙，將幼胚平鋪在培養(yǎng)皿 中，25°C暗培養(yǎng)2天。將長出胚根的幼胚移栽到經(jīng)過高溫滅菌的培養(yǎng)土里，23°C，光照時間為 14/10h光暗周期的氣候室中培養(yǎng)。培養(yǎng)期間，需保持環(huán)境溫度不超過26°C。
[0075] (4)分子檢測：
[0076] CrylAb/Ac蛋白的ELISA檢測：培養(yǎng)2月后，用ENVIR0L0GIX公司的QualiPlate Kit for CrylAb/CrylAc試劑盒檢測棉株種的BT蛋白含量。實(shí)驗(yàn)步驟如下：
[0077] 分別取對照組和實(shí)驗(yàn)組棉株(每組10株）的倒3葉，約0.15克，記錄重量，用液氮研 磨，研細(xì)的粉末加到4mL樣品提取液PBST(PBS緩沖液加入0.05wt%的Tween-20)中，4°C過夜 提取。
[0078] 4°C，8000rpm，離心10min，將上清液轉(zhuǎn)至干凈離心管，測量上清液體積。將上清液 稀釋到合適的濃度，備用。取50ul CrylAb/Ac Enzyme conjugate加入酶標(biāo)板中，再加入 50ul稀釋后的上清液。為制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，加入50ul試劑盒提供的Cry 1 Ab/Ac Positive control。每樣品3重復(fù)。常溫避光孵育2h。用PBST洗板4次。加入substrate顯色底物100μΙ， 常溫避光反應(yīng)15_30min，加入stop solution反應(yīng)終止液100μ1，用酶標(biāo)儀測定450nm的0D 值，換算為BT蛋白的含量(單位為ng/g鮮重）。結(jié)果見圖3。實(shí)驗(yàn)組(VIGS)葉片BT蛋白的含量 明顯低于對照組(CK)，說明VIGS病毒侵染棉花幼胚后，可有效誘發(fā)轉(zhuǎn)錄后基因沉默，導(dǎo)致BT 蛋白含量降低。
[0079] 對比例
[0080] 選用完全平展的子葉作為侵染對象，利用注射器滲透子葉法，接種TRV病毒誘發(fā)棉 花GhCLAl基因沉默。侵染載體的制備和侵染液的制備同實(shí)施例1。
[0081] 選擇發(fā)育成熟、顆粒飽滿的棉種200粒，浸入水中，28°C培養(yǎng)過夜催芽。將棉種播種 到培養(yǎng)土中。28°C，光照/黑暗14/10h周期，培養(yǎng)10~20天。待子葉完全平展后，用注射器針 尖輕輕劃破子葉背面表皮，利用lmL注射器將配置好的農(nóng)桿菌侵染液壓滲入子葉中。侵染后 的棉苗用塑料膜覆蓋保濕，放置在25°C培養(yǎng)室中，暗培養(yǎng)1~2天。隨后，對侵染后的棉苗進(jìn) 行正常培養(yǎng)。培養(yǎng)2周后，觀察棉苗白化的情況。
[0082] 同時，選擇發(fā)育成熟、顆粒飽滿的棉種200粒，利用本發(fā)明的方法，對幼胚為受體進(jìn) 行VIGS基因沉默實(shí)驗(yàn)。
[0083]自棉種28°C浸水催芽始(記做第一天），對兩種方法的接種時間等進(jìn)行對比。結(jié)果 如表1所示。
[0084] 表1不同受體的比較
[0085]
[0086] 由表1可以看出，本發(fā)明首次以棉花幼胚作為受體接種TRV病毒，不對幼胚進(jìn)行破 壞性處理，不產(chǎn)生任何損傷，克服了接種病毒時對棉苗造成機(jī)械損傷的缺點(diǎn);采用浸泡幼胚 接種方式，操作簡單，有效縮短接種時間。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種以棉花幼胚為受體的TRV病毒誘導(dǎo)棉花基因沉默的方法，其特征在于，步驟如 下： (1) 將目的基因插入TRV病毒載體中，制備重組載體，然后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，制得轉(zhuǎn)化后的農(nóng) 桿菌； (2) 取棉花種子，經(jīng)脫絨、滅菌后，經(jīng)萌發(fā)后去除萌發(fā)種子的內(nèi)、外皮，幼胚放入含有2.5 ~3 · 5mg/L GA3 (赤霉素）的MS液體培養(yǎng)基中，25~30 °C，120rpm/min暗培養(yǎng)6~10h，制得待 侵染胚； (3) 培養(yǎng)步驟（1)制得的轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌，制得農(nóng)桿菌侵染液，然后加入農(nóng)桿菌侵染液 質(zhì)量百分比0.15~0.25%的表面活性劑，制得侵染液，將步驟(2)制得的待侵染胚浸入侵染 液中，22~28°C，100~150rpm/min，暗培養(yǎng)20~40分鐘，去除多余侵染液，經(jīng)共培養(yǎng)后，栽種 到滅菌的營養(yǎng)土中，進(jìn)行營養(yǎng)土培養(yǎng)，即可。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1)中的目的基因?yàn)槊藁℅hCLAl基 因，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1)中的重組載體，為將目的基因用 限制性內(nèi)切酶EcoRI和ΚρηΙ雙酶切后，連接入同樣經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI和Kpra酶切后的 TRV病毒載體中； 優(yōu)選的，所述步驟(1)中的轉(zhuǎn)化為凍融法轉(zhuǎn)化。4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1)中的病毒載體TRV載體系統(tǒng)，包 含TRV1和TRV2載體;農(nóng)桿菌為農(nóng)桿菌GV3101。5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中脫絨為采用濃硫酸脫絨，滅菌 為采用質(zhì)量濃度為15%的雙氧水浸泡0.5~1.511; 優(yōu)選的，所述步驟(2)中萌發(fā)為在滅菌水中25~30 °C浸泡15~18h。6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中農(nóng)桿菌侵染液的制備步驟如 下： 將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌涂布在含有50mg/L卡那霉素、50mg//L慶大霉素、50mg//L利福平的LB 固體培養(yǎng)基上，25~30 °C暗培養(yǎng)2~3天;挑取單克隆接入含有相同濃度抗生素的LB液體培 養(yǎng)基中，25~30°C振蕩過夜培養(yǎng)，制得液體培養(yǎng)物； 取lmL液體培養(yǎng)物擴(kuò)繁至100mL含有上述相同濃度抗生素且含有10mM的MES和20μΜ乙酰 丁香酮的LB液體培養(yǎng)基中，25~30°C過夜培養(yǎng);25°C，4500rpm離心菌體，將菌體重懸在含有 10mM MgCl2，10mM 2-(N-嗎啉）乙磺酸，200μΜ乙酰丁香酮的MS液體培養(yǎng)基中，調(diào)整OD6〇〇 = 1.5，22~28°C，暗處理2.5~3h，制得農(nóng)桿菌侵染液。7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中表面活性劑為Silwet L-77。8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中共培養(yǎng)為在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中 于22~28 °C暗培養(yǎng)2~3天;共培養(yǎng)培養(yǎng)基為含有200μΜ乙酰丁香酮的MS液體培養(yǎng)基。9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述含有200μΜ乙酰丁香酮的MS液體培養(yǎng)基 為將200μΜ乙酰丁香酮的MS液體培養(yǎng)基浸潤4~7層濾紙制得。10. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中營養(yǎng)土培養(yǎng)為將生根后的幼 苗在22~25°C，14h光照/10h黑暗的條件下，與營養(yǎng)土中培養(yǎng)，即可。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種以棉花幼胚為受體接種TRV病毒誘導(dǎo)內(nèi)源基因沉默的方法，步驟如下：(1)將目的基因插入TRV病毒載體中，制備重組載體，然后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，制得轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌；(2)取棉花種子，經(jīng)脫絨、滅菌后，經(jīng)萌發(fā)后去除萌發(fā)種子的內(nèi)、外皮，幼胚放入含有赤霉素的MS液體培養(yǎng)基中，制得待侵染胚；(3)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌，制得農(nóng)桿菌侵染液，制得侵染液，將待侵染胚浸入侵染液中，暗培養(yǎng)，經(jīng)共培養(yǎng)后，栽種到滅菌的營養(yǎng)土中，進(jìn)行營養(yǎng)土培養(yǎng)，即可。本發(fā)明首次以棉花幼胚作為受體接種TRV病毒，不對幼胚進(jìn)行破壞性處理，不產(chǎn)生任何損傷，克服了接種病毒時對棉苗造成機(jī)械損傷的缺點(diǎn)。
【IPC分類】C12N15/83
【公開號】CN105647966
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】張景霞, 張軍, 王芙蓉, 陳煜 , 張傳云, 劉國棟
【申請人】山東棉花研究中心
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月17日