042] 實施例1
[0043] 棉花GhCLAl基因 （cloroplastos alterados 1 gene)編碼l_deoxyxylulose5-phosphate合成酶，參與葉綠體發(fā)育過程。GhCLAl基因沉默產(chǎn)生明顯的白化表型，在VIGS體 系中被廣泛用作基因沉默的標記性狀。本實施例中，以幼胚為受體接種TRV病毒誘導棉花 GhCLAl基因沉默，具體方法如下：
[0044] (1)將目的基因插入病毒載體TRV2中，制備重組載體，然后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，制得轉(zhuǎn)化 后的農(nóng)桿菌：
[0045] 目的基因的制備:提取棉花葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA，用GhCLAl基因特異引 物（FI:5，-GCGGAATTCCACAACATCGATGATTTAG-3'；R1:5 '-CGGGGTACCATGATGAGTAGATTGCAC-3'）擴增GhCLAl基因中約400bp的片段。
[0046] 所述PCR擴增體系為(總體積50μ1): TaKaRa Ex Taq (5 U/μ 1) 0* 25 μ 1
[0047] ΙΟΧΕχ Taq Buffer (Μ：β2+Ρ1υδ) 5 μL dNTP Mixture (各 2· 5 πΜ) 4： μL cDNA 1 μ 1 FI primer 1 μ 1
[0048] R1 primer 1 μ 1 DDW 37. 75 μ 1;
[0049] 所述PCR擴增程序如下：
[0050] 95°C 預變性 3min;95°C 變性 3〇8,59°(：退火3〇8,72°(：延伸4〇8,32個循環(huán)；72°(：延伸 10min〇
[0051 ] 病毒載體TRV2-GhCLAl的構(gòu)建與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化:將棉花GhCLAl基因中的400bp左右片 段用EcoRI和ΚρηΙ限制性內(nèi)切酶酶切后，連入同樣酶切的病毒載體TRV2中，構(gòu)建了1^2-G h C L A1重組載體，利用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌G V 3101; T R V1載體利用同樣方法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 GV3101〇
[0052] (2)無菌幼胚的制備與預培養(yǎng)：
[0053]選取飽滿、種子活力高的棉種用濃硫酸脫絨，大量流水沖洗干凈，直至沒有酸味。 用15 %的雙氧水浸泡棉種lh，期間晃動5次。滅菌水沖洗6次，浸泡在無菌水中2h，再用滅菌 水沖洗3次，28°C浸泡18h。種子萌發(fā)后，無菌環(huán)境下將棉種的內(nèi)、外種皮剝?nèi)?，注意不要損傷 子葉和胚根，放入含有3mg/L GA3的MS液體培養(yǎng)基中，28°C，120rpm/min暗培養(yǎng)8h。
[0054] (3)接種病毒及培養(yǎng)：
[0055] 培養(yǎng)步驟(1)制得的轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌，制備農(nóng)桿菌侵染液，然后加入農(nóng)桿菌侵染液 質(zhì)量百分比0.2%的表面活性劑Silwet L-77,制得侵染液，將步驟(2)制得的待侵染胚浸入 侵染液中，28°C，120rpm/min，暗培養(yǎng)20分鐘，去除多余侵染液，經(jīng)共培養(yǎng)后，栽種到滅菌的 營養(yǎng)土中，進行營養(yǎng)土培養(yǎng)，即可。
[0056] 侵染液的制備與接種:將步驟(1)中經(jīng)TRV2-GhCLAl和TRV1轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌菌種涂 布在含50mg/L卡那霉素、50m g//L慶大霉素、50mg//L利福平的LB固體培養(yǎng)基上，28 °C暗培養(yǎng)2 天。挑取單克隆，接種到5mL含有相同抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，28°C，180rpm振蕩培養(yǎng)過 夜。取lmL液體培養(yǎng)物擴繁至100mL含有上述抗生素，且另外附加了 lOmMMES和20μΜ乙酰丁香 酮的LB液體培養(yǎng)基中，28°C，180rpm振蕩培養(yǎng)過夜。25°C，5000rpm轉(zhuǎn)速，離心收集菌體，將菌 體重懸在含有100mM MES、10mM MgCl2、200yM乙酰丁香酮的MS液體培養(yǎng)基中。利用分光光度 計調(diào)整濃度為〇D6QQ = 1.5，在黑暗處放置3h。TRV1農(nóng)桿菌侵染液的制備與TRV2-GhCLA 1相同。 將制備好的TRV1和TRV2-GhCLAl農(nóng)桿菌侵染液等體積混勻，加入0.2wt%的表面活性劑 Silwet L-77。將用GA3預培養(yǎng)后的棉花幼胚浸入上述制備好的農(nóng)桿菌侵染液中，25°C， 120rpm/min，暗培養(yǎng)30分鐘，對棉花幼胚進行接種。
[0057] 接種后的培養(yǎng):接種后，將幼胚放在滅菌濾紙上，吸去多余侵染液。在培養(yǎng)皿中鋪 放5層滅菌濾紙，用含有200μΜ乙酰丁香酮的MS液體培養(yǎng)基浸濕濾紙，將幼胚平鋪在培養(yǎng)皿 中，25°C暗培養(yǎng)2天。將長出胚根的幼胚移栽到經(jīng)過高溫滅菌的培養(yǎng)土里，23°C，光照時間為 14/10h光暗周期的氣候室中培養(yǎng)。培養(yǎng)期間，需保持環(huán)境溫度不超過24°C。
[0058] (4)沉默株的表型觀察與分子檢測：
[0059]培養(yǎng)18天，棉株剛長出的真葉和莖即可出現(xiàn)明顯的白化表型，該表型可持續(xù)4~5 個月（如圖1所示）。分別提取白化植株的子葉、真葉、莖和根的總RNA，利用TRV2載體中的特 異性序列設計引物 02:5'-TGGAGTTGAAG ACTTATTACCGAAGG-S' 42:5^ CCGGAATTCGAAACTCAAATGCTACCAA-3'），進行一步法RT-PCR，檢測接種后病毒RNA的累積情 況。
[0060] RT-PCR結(jié)果顯示，在子葉、真葉、莖和根組織提取的RNA樣品中，均能擴增出明亮的 特異性條帶，而在未接種的對照株中沒有任何擴增產(chǎn)物。RT-PCR的結(jié)果說明，對棉花幼胚進 行接種后，病毒RNA可在棉苗不同部位擴散累積(如圖2所示）。
[0061 ] 實施例2
[0062] (1)將目的基因 CrylAb/Ac插入病毒載體TRV2中，制備重組載體，然后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌， 制得轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌：
[0063] 目的基因的制備:利用CrylAb/Ac基因特異引物PCR擴增轉(zhuǎn)基因抗蟲棉（魯棉研37 號）中的CrylAb/CrylAc基因（基因序列如SEQ ID勵.2所示）中的44(^?左右的片段。所用引 物為 F3(5,-CCGGAATTCAACAGCGCCTTGACCACAGC-3,)和 1^3(5^ CGGGGTACCGGGCAGAACCACGGAAGC-3'）。
[0064] 所述PCR擴增體系如下（總體系50μ1): TaKaRa Ex Taq (5 U/ μ 1 )： Θ. 25 μ 1 ΙΟΧΕχ Taq Buffer (Mg2+Plus) 5 μL dNTP Mixture (各 2. 5 ηιΜ) 4 μ ?
[0065] cDNA 1 μL F2 primer 1 μ 1 R2 primer 1 μ 1 DDf 37.75 μ 1
[0066] 所述PCR擴增程序如下：
[0067] 95 °C 預變性 3min; 95 °C 變性 30s，60 °C 退火 30s，72 °C 延伸 40s，32 個循環(huán)；72 °C 延伸 10min〇
[0068] 載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化:將制備的CrylAb/CrylAc基因片段經(jīng)EcoRI和Kpnl雙酶切后連 入同樣雙酶切的病毒載體TRV2中，制備重組載體TRV2-CrylAb/Ac，利用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 GV3101，制得轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌。未經(jīng)改造的TRV1載體同樣利用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，作 為陽性對照；
[0069] (2)無菌幼胚的制備與預培養(yǎng)：
[0070] 選取飽滿、種子活力高的棉種用濃硫酸脫絨，大量流水沖洗干凈。用15%的雙氧水 浸泡棉種lh，期間晃動4次。滅菌水沖洗6次，浸泡在無菌水中2h，再用滅菌水沖洗5次，在滅 菌水中28°C浸泡18h。種子萌發(fā)后，無菌環(huán)境下將棉種的內(nèi)、外種皮剝?nèi)?，注意不要損傷子葉 和胚根，放入含有3mg/L GA3植物激素的MS液體培養(yǎng)基中，28°C，120rpm/min暗培養(yǎng)8h。
[0071] (3)接種病毒及培養(yǎng)：
[0072] 培養(yǎng)步驟(1)制得的轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌，制備農(nóng)桿菌侵染液，然后加入農(nóng)桿菌侵染液 質(zhì)量百分比0.2%的表面活性劑，制得侵染液，將步驟(2)制得的待侵染胚浸入侵染液中，25 °C，120rpm/min，暗培養(yǎng)30分鐘，去除多余侵染液，經(jīng)共培養(yǎng)后，栽種到滅菌的營養(yǎng)土中，按 常規(guī)方法培養(yǎng)即可。
[0073] 侵染液的制備與接種:將步驟(1)中經(jīng)TRV2_GhCLAl和TRV1轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌菌種涂 布在含50mg/L卡那霉素、50m g//L慶大霉素、50mg//L利福平的LB固體培養(yǎng)基上，28 °C暗培養(yǎng)2 天。挑取單克隆，接種到5mL含有相同抗生素的LB液體