專利名稱：Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構(gòu)效關(guān)系模型的構(gòu)建方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構(gòu)效關(guān)系模型的構(gòu)建方法及應(yīng)用，具體涉及以Bcl-2蛋白為靶點(diǎn)的抑制劑的三維定量構(gòu)效關(guān)系模型的建立及利用該模型進(jìn)行快速藥物篩選，屬于生物信息技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤(又稱癌癥)是目前威脅人類健康的重大疾病，其發(fā)病率和死亡率一直以來居高不下。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，目前全球每年有超過700萬人死于癌癥。為了戰(zhàn)勝癌癥，各國均投入了大量人力物力進(jìn)行研究。目前臨床上癌癥治療手段主要依靠細(xì)胞毒性藥物，而該類藥物存在著毒副作用大、選擇性差、易產(chǎn)生耐受等缺點(diǎn)，因此，開發(fā)低毒、高效、 成藥性好的新型抗腫瘤藥物已成為當(dāng)前藥物的研究熱點(diǎn)。隨著人們對對細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究，越來越多的新型抗腫瘤靶點(diǎn)被提出。從分子水平來看，腫瘤耐藥的發(fā)生與某些功能蛋白非正常性調(diào)控細(xì)胞凋亡途徑有關(guān)。調(diào)控細(xì)胞凋亡的途徑有很多，其中B-細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，以下簡稱Bcl_2)蛋白家族作為重要的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子，在線粒體凋亡通路中發(fā)揮著重要作用(參見Bcl-2 gene promotes haemopoietic cell survival and cooperates with c-myc to immortalize pre-B cells, J. Μ. , et al. Nature，1998，281，1322.)。值得一提的是，Bcl_2 蛋白往往僅在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，這對于發(fā)現(xiàn)無毒或低毒的新型抗腫瘤藥物有著重要意義。迄今為止，人們在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了約25個Bcl-2蛋白家族成員，可分為三大類即抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-W等)、促凋亡蛋白(Bax、Bak等)以及只含BH3 結(jié)構(gòu)域的促凋亡蛋白(Bid、Bad)(參見 Solution structure of the antiapoptotic protein bcl-2, Petros, A.M. , et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 2001,98, 3012) 研究發(fā)現(xiàn)，抗凋亡蛋白Bcl-2在腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)，導(dǎo)致癌癥治療手段無法有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而影響腫瘤化療和放療的效果(參見The role of Bcl-2 family members intumorigenesis, Kirkin, V.，et al. BBA-Mol. Cell. Res.，2004，1644，229)。結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2蛋白表現(xiàn)有一個細(xì)長的疏水口袋，是其與促凋亡蛋白BH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)(參見 Antimycin A mimics a cell-death-inducing Bcl-2 homology domain 3, Tzung，S. P.，et al. Nat. Cell. Biol.，2001，3，183)。從 BH3 結(jié)構(gòu)域的模擬物出發(fā)，研究抑制 Bcl-2蛋白的藥物分子，將有利于阻斷促凋亡蛋白與Bcl-2蛋白的結(jié)合，解決臨床相關(guān)腫瘤治療的耐藥性問題。目前，對于抑制抗凋亡Bcl-2蛋白的研究主要有三種策略基因沉默技術(shù)(如使用反義寡核苷酸或RNAi技術(shù))、BH3結(jié)構(gòu)域模擬肽類和化學(xué)小分子抑制劑。但是研究發(fā)現(xiàn)， 反義寡核苷酸分子在抑制Bcl-2蛋白表達(dá)的同時，由于缺乏靶向性而易產(chǎn)生副作用。同時， BH3結(jié)構(gòu)域模擬肽親和力較差，難以滲透進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，且對腫瘤細(xì)胞的選擇性不佳。因此非肽類小分子Bcl-2抑制劑，其分子質(zhì)量較低，通常具有較高的細(xì)胞滲透性，有利于提高其在體內(nèi)的生物利用度，且對癌細(xì)胞具有較高的特異性。因此研究非肽類Bcl-2小分子藥物已成為Bcl-2蛋白抑制劑的研究熱點(diǎn)。其中以ABT-737為代表的一系列小分子Bcl_2蛋白抑制劑具有較高的生物活性及良好的選擇性，ABT-737目前已進(jìn)入II期臨床研究(參見 Studies Leading to Potent, Dual Inhibitors of Bcl-2 and Bcl-xL, Bruncko, M. ， et al. J. Med. Chem.，2007，50，641)。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)在現(xiàn)代新藥研發(fā)中發(fā)揮著越來越重要的作用。其中，三維定量構(gòu)效關(guān)系模型(3D-QSAR)是一種借助分子的理化性質(zhì)參數(shù)或結(jié)構(gòu)參數(shù)，以數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)手段定量研究有機(jī)小分子與生物大分子相互作用、有機(jī)小分子在生物體內(nèi)吸收、分布、代謝、排泄等生理相關(guān)性質(zhì)的方法。這種方法廣泛應(yīng)用于藥物、農(nóng)藥、 化學(xué)毒劑等生物活性分子的合理設(shè)計(jì)，在藥學(xué)研究中發(fā)揮著非常重要的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構(gòu)效關(guān)系模型的構(gòu)建方法及應(yīng)用。本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是傳統(tǒng)藥物研究主要依靠高通量篩選進(jìn)行先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)，但是，隨著組合化學(xué)的發(fā)展，已有的化合物庫非常龐大，對每一種化合物進(jìn)行生物學(xué)活性篩選需要耗費(fèi)大量的人力、物力、財(cái)力。是本發(fā)明的目的是建立一種Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構(gòu)效關(guān)系模型， 可以快速、經(jīng)濟(jì)的預(yù)測化合物與Bcl-2蛋白的結(jié)合能力。本發(fā)明技術(shù)方案如下本發(fā)明根據(jù)現(xiàn)有已知的小分子抑制劑，利用三維定量構(gòu)效關(guān)系技術(shù)，建立Bcl-2 蛋白抑制劑三維定量構(gòu)效關(guān)系模型。該方法采用分子相似性分析、分子構(gòu)象優(yōu)化、參數(shù)優(yōu)化等技術(shù)進(jìn)一步增加模型的準(zhǔn)確性。一種Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構(gòu)效關(guān)系模型的構(gòu)建方法，包括如下步驟(1)根據(jù)與Bcl-2蛋白的結(jié)合能力的大小，將已知的小分子抑制劑根據(jù)生物學(xué)活性指標(biāo)分為三類；每類隨機(jī)選取一到兩個抑制劑作為測試集，其余的組成訓(xùn)練集；生物學(xué)活性指標(biāo)采用結(jié)合常數(shù)Ki的負(fù)對數(shù)PKi (PKi = log Ki)，其中PKi < 7，7 < PKi < 8，PKi > 8，分別代表與Bcl-2蛋白結(jié)合結(jié)合能力弱、結(jié)合能力中等、結(jié)合能力強(qiáng)；(2)根據(jù)已知Bcl-2蛋白與陽性化合物結(jié)合后的三維結(jié)構(gòu)，利用分析軟件獲得陽性化合物的空間三維結(jié)構(gòu)；將訓(xùn)練集和測試集中已知的小分子抑制劑的二維結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換為三維結(jié)構(gòu)，并利用陽性化合物的空間三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子相似性分析，得到初步三維空間結(jié)構(gòu)模型；經(jīng)構(gòu)象優(yōu)化獲得優(yōu)化的三維空間結(jié)構(gòu)模型。(3)以步驟⑵制得的優(yōu)化的三維空間結(jié)構(gòu)模型的公共剛性骨架為模板進(jìn)行分子疊合；用小分子探針?biāo)褜くB合后化合物周圍的力場信息；力場信息包括立體場與靜電場；(4)對步驟C3)獲得的力場信息進(jìn)行優(yōu)化后，與訓(xùn)練集中的小分子抑制劑的生物學(xué)活性值進(jìn)行偏最小二乘法回歸，獲得Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構(gòu)效關(guān)系模型。所述步驟(2)中已知Bcl-2蛋白與陽性化合物結(jié)合后的三維結(jié)構(gòu)從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫 http://www. pdb. org/下載，該三維結(jié)構(gòu)通過核磁共振解析獲得；所述步驟⑵中利用分析軟件獲得陽性化合物的空間三維結(jié)構(gòu)是指使用
4SYBYL7. 3 (Tripos Inc.)分析Bcl_2蛋白活性位點(diǎn)，并抽出與陽性化合物結(jié)合的活性域的
三維結(jié)構(gòu)。所述步驟( 中的構(gòu)象優(yōu)化是指使用Tripos力場進(jìn)行優(yōu)化，加Gasteiger-HUckel 電荷，能量收斂限為0. 05kcal/mol，最大迭代次數(shù)為1000次。所述步驟(4)中對力場信息進(jìn)行優(yōu)化后是指對率柱濾值和閾值進(jìn)行調(diào)整，以交叉驗(yàn)證系數(shù)q2為表征模型的合理性，Q2 > 0. 5即表示該模型具有較好的合理性，Q2值越高表示分析活性的能力越強(qiáng)。該步驟可增加模型的合理性、消除噪聲、提高分析速度。所述構(gòu)建方法還包括利用步驟(4)制得的Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構(gòu)效關(guān)系模型對測試集中小分子抑制劑活性進(jìn)行分析，得到模型分析活性值，建立模型分析活性值與實(shí)際活性值的線性回歸曲線，對Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構(gòu)效關(guān)系模型進(jìn)行評價，同時以r2pred衡量模型的篩選能力，r2pred= (SD-PRESS)，其中其中SD代表測試集生物活性值與訓(xùn)練集平均生物活性值的平方差的和；PRESS代表測試集生物活性分析值與實(shí)驗(yàn)值的平方差的和。該步驟可檢驗(yàn)構(gòu)建模型的準(zhǔn)確性。利用上述Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構(gòu)效關(guān)系模型的構(gòu)建方法在藥物快速篩選中的應(yīng)用。有益效果本發(fā)明利用已知生物活性的Bcl-2蛋白抑制劑，采用三維定量構(gòu)效關(guān)系技術(shù)，構(gòu)建了合理的生物活性預(yù)測模型，可以快速預(yù)測活性未知化合物的Bcl-2蛋白結(jié)合常數(shù)，在短時間內(nèi)獲取活性化合物線索，相比傳統(tǒng)的高通量篩選技術(shù)大大提高了篩選效率，降低了成本。


圖1、已知Bcl-2蛋白與陽性化合物結(jié)合后的三維結(jié)構(gòu)示意圖；其中，結(jié)合位點(diǎn)用斷線圓圈標(biāo)出；圖2、已知的小分子抑制劑與陽性化合物的分子相似性分析；圖3、初步Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構(gòu)效關(guān)系模型示意圖；圖4、模型分析活性值與實(shí)際活性值的線性回歸曲線；圖5、實(shí)施例2中札-276與Bcl_2蛋白結(jié)合后的三維結(jié)構(gòu)示意圖；圖6、利用模型分析獲得的WL-276的三維構(gòu)象示意圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1本發(fā)明涉及利用已知的小分子抑制劑(參見Mudies Leading to Potent, Dual Inhibitors of Bcl-2 and Bcl—xL，Bruncko, M.，et al. J. Med. Chem.，2007，50，641)構(gòu)建 Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構(gòu)效關(guān)系模型的方法。該方法包括如下步驟(1)根據(jù)論文報道中涉及的已知的小分子抑制劑共31個，其生物學(xué)活性以結(jié)合常數(shù)Ki表示。用結(jié)合常數(shù)Ki的負(fù)對數(shù)PKi (PKi = Iog Ki),將該類抑制劑分為三類，其中PKi < 7，7 < PKi < 8,PKi > 8，分別代表與Bcl-2蛋白結(jié)合結(jié)合能力弱、結(jié)合能力中等、結(jié)合能力強(qiáng)。從三類中抽取沈個已知的小分子抑制劑作為訓(xùn)練集建立預(yù)測模型，其余5個已知的小分子抑制劑作為測試集進(jìn)行驗(yàn)證。(2)目前已有Bcl-2蛋白與陽性化合物復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)報道。從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫 (http://www. pdb. org/)下載編號為202F的PDB文件(Bcl_2蛋白與陽性化合物的復(fù)合三維結(jié)構(gòu))，使用3 (Tripos Inc.)分析蛋白活性位點(diǎn)，選擇陽性化合物的三維結(jié)構(gòu)并將其抽出(見附圖1)。已知的小分子抑制劑的二維結(jié)構(gòu)使用Accelrys Draw 4.0(Accelrys Inc.)構(gòu)建，并運(yùn)用Concord(STO17· 3，Tripos Inc.)將二維結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換為三維結(jié)構(gòu)。以陽性化合物的三維結(jié)構(gòu)為模板，使用Surflex-sim(STO17. 3，Tripos Inc.)搜尋已知的小分子抑制劑與陽性化合物三維結(jié)構(gòu)最為相似的構(gòu)象。(見附圖2)搜尋獲得的構(gòu)象使用Tripos力場進(jìn)行優(yōu)化，加feisteiger-HUckel電荷，能量收斂限為0. 05kcal/mol，最大迭代次數(shù)為1000次，得到優(yōu)化的三維空間結(jié)構(gòu)模型。(3)以步驟(2)得到的優(yōu)化的三維空間結(jié)構(gòu)模型的公共剛性骨架為模板進(jìn)行分子疊合；利用CoMFA (STO17. 3, Tripos Inc.)進(jìn)行分子力場(分子力場包括立體場和靜電場) 的搜尋，獲得力場信息。(4)對步驟C3)獲得的力場信息通過調(diào)整柱濾值和閾值進(jìn)行優(yōu)化，最終選擇柱濾值=2.2kCal/mol，閾值(立體場和靜電場)=7^al/mol，將力場信息與訓(xùn)練集中的小分子抑制劑的生物學(xué)活性值進(jìn)行偏最小二乘法回歸，獲得q2 = 0. 568的三維定量構(gòu)效關(guān)系模型(見附圖3)。(5)利用步驟(4)制得的Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構(gòu)效關(guān)系模型對測試集中小分子抑制劑活性進(jìn)行分析，得到模型分析活性值，建立模型分析活性值與實(shí)際活性值的線性回歸曲線，對Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構(gòu)效關(guān)系模型進(jìn)行評價，同時以r2p,ed衡量模型的篩選能力，r2p,ed = (SD-PRESS)，其中其中SD代表測試集生物活性值與訓(xùn)練集平均生物活性值的平方差的和；PRESS代表測試集生物活性分析值與實(shí)驗(yàn)值的平方差的和，預(yù)測相關(guān)系數(shù)r2pral = 0. 568，活性預(yù)測值與實(shí)際值的線性回歸(見附圖4)。實(shí)施例2采用實(shí)施例1所述的一種構(gòu)建Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構(gòu)效關(guān)系模型的方法對母核不同的Bcl-2蛋白抑制劑進(jìn)行活性分析。1. WL-276為目前新近報道的已知的小分子抑制劑，它可以有效地抑制Bcl_2蛋白，其母核結(jié)構(gòu)為2-硫代-4-噻唑烷酮，與實(shí)施例1中建立模型所采用的已知的小分子抑制劑母核結(jié)構(gòu)不同；2.采用 Accelrys Draw 4. 0(Accelrys Inc.)構(gòu)建 WL-276 的二維結(jié)構(gòu)，并運(yùn)用 Concord (SYBYL7. 3，Tripos Inc.)將二維結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換為三維結(jié)構(gòu)；3.因?yàn)閃L-276與已有三維結(jié)構(gòu)的陽性化合物結(jié)構(gòu)差異較大，為了獲得與真實(shí)值更為接近的WL-276三維結(jié)構(gòu)，采用分子對接程序Surflex-Dock (STO17. 3，Tripos Inc.) 模擬WL-276與Bcl-2蛋白的結(jié)合模式(見附圖5)，采用理論結(jié)合值最高的構(gòu)象作為WL-276 的最終構(gòu)象；4.使用實(shí)施例1中的模型對步驟3獲得的WL-276三維構(gòu)象進(jìn)行分析(見附圖6)，分析活性值PKi = 8. 027(目前已報道生物活性最好的ABT-737的PKi = 9，15)，分析結(jié)果顯示該化合物具有較好的Bcl-2蛋白抑制能力；生物活性測試確認(rèn)了 WL-276對Bcl_2蛋白白勺抑制能力(#JAL WL-276, an antagonist against Bcl-2 proteins, overcomes drug resistance and suppresses prostate tumor growth, Wang, L. , et al. Cancer. Res., 2008，68，4377)。
權(quán)利要求
1.一種Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構(gòu)效關(guān)系模型的構(gòu)建方法，包括如下步驟(1)根據(jù)與Bcl-2蛋白的結(jié)合能力的大小，將已知的小分子抑制劑根據(jù)生物學(xué)活性指標(biāo)分為三類；每類隨機(jī)選取一到兩個抑制劑作為測試集，其余的組成訓(xùn)練集；生物學(xué)活性指標(biāo)采用結(jié)合常數(shù)Ki的負(fù)對數(shù)PKi,其中PKi < 7，7 < PKi < 8，PKi > 8，分別代表與Bcl_2 蛋白結(jié)合結(jié)合能力弱、結(jié)合能力中等、結(jié)合能力強(qiáng)；(2)根據(jù)已知Bcl-2蛋白與陽性化合物結(jié)合后的三維結(jié)構(gòu)，利用分析軟件獲得陽性化合物的空間三維結(jié)構(gòu)；將訓(xùn)練集和測試集中已知的小分子抑制劑的二維結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換為三維結(jié)構(gòu)，并利用陽性化合物的空間三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子相似性分析，得到初步三維空間結(jié)構(gòu)模型； 經(jīng)構(gòu)象優(yōu)化獲得優(yōu)化的三維空間結(jié)構(gòu)模型；(3)以步驟(2)制得的優(yōu)化的三維空間結(jié)構(gòu)模型的公共剛性骨架為模板進(jìn)行分子疊合；用小分子探針?biāo)褜くB合后化合物周圍的力場信息；(4)對步驟C3)獲得的力場信息進(jìn)行優(yōu)化后，與訓(xùn)練集中的小分子抑制劑的生物學(xué)活性值進(jìn)行偏最小二乘法回歸，獲得Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構(gòu)效關(guān)系模型。
2.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(2)中已知Bcl-2蛋白與陽性化合物結(jié)合后的三維結(jié)構(gòu)從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫http://WWW. pdb. org/下載，該三維結(jié)構(gòu)通過核磁共振解析獲得。
3.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(2)中利用分析軟件獲得陽性化合物的空間三維結(jié)構(gòu)是指使用STOYL7. 3分析Bcl-2蛋白活性位點(diǎn)，并抽出與陽性化合物結(jié)合的活性域的三維結(jié)構(gòu)。
4.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟O)中的構(gòu)象優(yōu)化是指使用 Tripos力場進(jìn)行優(yōu)化，加feisteiger-HUckel電荷，能量收斂限為0. 05kcal/mol，最大迭代次數(shù)為1000次。
5.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(4)中對力場信息進(jìn)行優(yōu)化后是指對率柱濾值和閾值進(jìn)行調(diào)整，以交叉驗(yàn)證系數(shù)q2為表征模型的合理性，Q2 > 0. 5即表示該模型具有較好的合理性，Q2值越高表示分析活性的能力越強(qiáng)。
6.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，還包括利用步驟(4)制得的Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構(gòu)效關(guān)系模型對測試集中小分子抑制劑活性進(jìn)行分析，得到模型分析活性值，建立模型分析活性值與實(shí)際活性值的線性回歸曲線，對Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構(gòu)效關(guān)系模型進(jìn)行評價，同時以！^^衡量模型的篩選能力，r2pred= (SD-PRESS)，其中其中 SD代表測試集生物活性值與訓(xùn)練集平均生物活性值的平方差的和；PRESS代表測試集生物活性分析值與實(shí)驗(yàn)值的平方差的和。該步驟可檢驗(yàn)構(gòu)建模型的準(zhǔn)確性。
7.權(quán)利要求1所述的Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構(gòu)效關(guān)系模型的構(gòu)建方法在藥物快速篩選中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構(gòu)效關(guān)系模型的構(gòu)建方法及應(yīng)用，屬于生物信息技術(shù)領(lǐng)域。該方法根據(jù)現(xiàn)有已知的小分子抑制劑，利用三維定量構(gòu)效關(guān)系技術(shù)，建立Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構(gòu)效關(guān)系模型，采用分子相似性分析、分子構(gòu)象優(yōu)化、參數(shù)優(yōu)化等技術(shù)進(jìn)一步增加模型的準(zhǔn)確性。本發(fā)明可以快速預(yù)測活性未知化合物的Bcl-2蛋白結(jié)合常數(shù)，在短時間內(nèi)獲取活性化合物線索，相比傳統(tǒng)的高通量篩選技術(shù)大大提高了篩選效率，降低了成本。
文檔編號G06F19/10GK102262715SQ20111014639
公開日2011年11月30日 申請日期2011年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月1日
發(fā)明者侯旭奔, 方浩 申請人:山東大學(xué)