檢測五種氨基糖苷類抗生素的同步檢測卡的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本專利涉及一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的檢測方法，利用免疫層析技術(shù)一次檢測五種 氨基糖苷類抗生素。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，由于畜牧業(yè)盲目濫用抗生素現(xiàn)象日益嚴(yán)重，造成畜產(chǎn)品中抗生素殘留增 加，影響人類食品安全，所以抗生素殘留問題已經(jīng)引起社會的高度重視。
[0003] 動物性食品中氨基糖苷類抗生素殘留的危害：1.對公共衛(wèi)生和人體健康的危害。 長期攝入氨基糖苷類抗生素嚴(yán)重超標(biāo)的動物性食品可導(dǎo)致腎毒性和耳毒性，同時損害腦神 經(jīng)；2.引起過敏反應(yīng)。氨基糖苷類抗生素具有抗原性，能刺激機體形成抗體，當(dāng)被致敏人體 再接受這些抗生素治療時，該抗生素就會與抗體結(jié)合，生成抗原抗體復(fù)合物而發(fā)生過敏反 應(yīng)；3.病原菌耐藥性增加?？股卦谛螽a(chǎn)品中的殘留可能使動物病原菌產(chǎn)生耐藥性，耐藥 基因細(xì)菌之間傳播，由此導(dǎo)致致病菌的耐藥性增加而引起人類和動物感染性疾病的治療失 ??；4.破壞人體胃腸道微生物菌群的動態(tài)平衡。如果長期食用有抗生素殘留的畜產(chǎn)品，對 人類胃腸道的正常菌群平衡產(chǎn)生不良影響：a.破壞腸道菌群的屏障作用。b.腸道細(xì)菌耐藥 性增加。c.腸道菌群代謝活性改變。d.腸道細(xì)菌數(shù)目和相對比例改變，部分敏感菌群受到 抑制或殺死，條件性致病菌大量繁殖或體外病原菌侵入。
[0004] 新霉素（NE0)、鏈霉素（SM)、慶大霉素（GM)、大觀霉素（SPE)、卡那霉素（KAN)是幾 種獸藥中常用的氨基糖苷類抗生素。2002年農(nóng)業(yè)部組織修訂了《動物性食品中獸藥最高殘 留限量》，并予以發(fā)布，新霉素、鏈霉素、慶大霉素、大觀霉素屬于"附錄2:已批準(zhǔn)的動物性 食品中最高殘留限量規(guī)定"，卡那霉素被國際食品法典獸藥殘留委員會列入"有關(guān)需要評估 及再評估獸藥的優(yōu)先名單"。目前氨基糖苷類抗生素檢測的主要方法為微生物檢測法、色譜 分析法和免疫分析法。微生物檢測法的主要原理是根據(jù)抗微生物藥對特異微生物的抑制作 用，來檢測受檢樣品中殘留的抗生素。微生物檢測法測定時間長，特異性低，靈敏度低，操作 復(fù)雜。色譜分析法需要專門的色譜儀進(jìn)行檢驗，價格昂貴且檢測時間較長。免疫分析法主 要包括放射免疫分析（RIA)、酶聯(lián)免疫分析法（ELISA)和免疫層析技術(shù)。免疫分析法普遍具 有高靈敏度高特異性的優(yōu)點，但各個方法又具有自己的特點。放射免疫分析樣品回收率高， 但易造成放射污染，不易操作，以及同位素半衰期短；酶聯(lián)免疫分析法可以經(jīng)行批量檢測， 但操作步驟較為繁瑣，耗時較長；免疫層析技術(shù)和上述兩種免疫分析方法一樣具有高特異 性高靈敏度的優(yōu)點，同時簡化了操作步驟，縮短檢測時間，不會造成二次污染。
[0005] 免疫層析技術(shù)是以抗原與抗體的特異性、可逆性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析技術(shù)，其 最大特點是具有高度選擇性。待測物、抗體和標(biāo)記物是免疫分析中的三個基本要素。它往往 以條狀纖維層析材料為固相，通過毛細(xì)管作用使樣品溶液在層析條上涌動，并同時使樣品 中的待測物與層析材料上針對待測物的抗體發(fā)生高特異性和高親和性的免疫反應(yīng)，層析過 程中免疫復(fù)合物被富集或截留在層析材料的一定區(qū)域(檢測帶)，通過可目測的標(biāo)記物(膠 體金或膠體硒）而達(dá)到直觀的實驗現(xiàn)象，而游離的標(biāo)記物則越過檢測帶，達(dá)到與結(jié)合標(biāo)記物 自動分離之目的。
[0006] 檢測五種氨基糖苷類抗生素的同步檢測卡在市場上尚未有商品化的產(chǎn)品，市場上 已有的產(chǎn)品均為對氨基糖苷類抗生素中某一種抗生素進(jìn)行單一檢測，多進(jìn)行重復(fù)性操作， 增加工作量，浪費時間。 【實用新型內(nèi)容】
[0007] 本實用新型的目的是設(shè)計開發(fā)出一種高靈敏度、高特異性的檢測氨基糖苷類抗生 素的檢測卡，能夠同時檢測新霉素、鏈霉素、慶大霉素、大觀霉素和卡那霉素，簡化檢測過 程，使得檢測更簡單、省時、高效。
[0008] 本實用新型檢測卡由卡殼和試紙條組成，其中卡殼分為卡底和卡蓋，卡蓋上有項 目名稱顯示窗、結(jié)果顯示窗和加樣槽，加樣槽只有一個，且下方用無紡布覆蓋，加樣槽能夠 覆蓋每個待檢測試紙條，試紙條由PVC板、樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸水紙、保護(hù) 膜以及標(biāo)簽?zāi)そM成。
[0009] 膠體金墊是用膠體金分別標(biāo)記新霉素、鏈霉素、慶大霉素、大觀霉素和卡那霉素單 克隆抗體，凍干到玻璃纖維素膜上制成的。硝酸纖維素膜上分別包被上述五種氨基糖苷類 抗生素半抗原-卵清蛋白偶聯(lián)物，作為檢測線，包被羊抗鼠抗體作為質(zhì)控線。樣品墊為處理 過的無紡布，保護(hù)膜為lcm寬透明膠帶，標(biāo)簽?zāi)ど嫌∮袡z測項目名稱英文縮寫(新霉素NE0、 鏈霉素SM、慶大霉素GM、大觀霉素SPE、卡那霉素KAN)。每個卡殼中并列放入5種試紙條各 一個，分別檢測新霉素、鏈霉素、慶大霉素、大觀霉素和卡那霉素。
[0010] 為了方便使用，檢測卡配有滴管，滴管上有取液刻度，方便使用者吸取以及快速滴 加樣本。
[0011] 本實用新型的有益效果：
[0012] 1.檢測效率高。無需重復(fù)點樣，一次點樣即可同時完成5個項目的檢測；
[0013] 2.檢測時間短。與抗生素的其他檢測方法相比，大大縮短檢測時間，而且需要檢測 多個樣本時，無需進(jìn)行浸樣等待，可連續(xù)檢測多個樣本，也無需與試劑盒中的其它試劑進(jìn)行 混勻等操作，只需將可檢測樣品直接點入加樣槽計時5min即可進(jìn)行結(jié)果判定；
[0014] 3.檢測工具簡單。無需配備其他移液工具，使用滴管直接滴加樣本即可，無需再用 其他精確計量器具量取樣本量；
[0015] 4.靈敏度高、特異型好。本實用新型應(yīng)用免疫層析技術(shù)，具有高靈敏度、高特異 性的特點，本檢測卡的最低檢出限為：新霉素200yg/kg、鏈霉素100yg/kg、慶大霉素 5〇1^/1^、大觀霉素5〇1^/1^、卡那霉素2〇1^/1^。
【附圖說明】
[0016] 圖1為本實用新型試紙條結(jié)構(gòu)示意圖
[0017] 圖2為本實用新型試紙條俯視圖
[0018] 圖3為本實用新型檢測卡示意圖
[0019] 圖4為本實用新型檢測結(jié)果示意圖，a表示檢測結(jié)果為陽性，b表示檢測結(jié)果為陰 性，c、d表示檢測結(jié)果無效
[0020] 圖5為本實用新型滴管示意圖
【具體實施方式】
[0021] 一、檢測五種氨基糖苷類抗生素的同步檢測卡的制備
[0022] 1?膠體金墊的制備
[0023] 將0. 02%氯金酸溶液攪拌煮沸，加入2%檸檬酸三鈉1%體積，使檸檬酸三鈉終濃度 為0.02%，持續(xù)加熱攪拌，溶液由藍(lán)色逐漸變?yōu)榫萍t色即可，停止加熱，攪拌冷卻至室溫。
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