同時檢測7種睡眠類化學(xué)藥品的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種改善睡眠類保健食品或中成藥中非法添加卡馬西平、鹽酸氯丙嗪、奧氮平、鹽酸多塞平、富馬酸喹硫平、奧卡西平、舒必利等7種化學(xué)藥品的補充檢驗方法。樣品用甲醇超聲提取后，色譜柱分離，流動相洗脫，DAD檢測器檢測。利用已建立的檢測方法，進(jìn)行方法學(xué)的驗證，其結(jié)果各參數(shù)見正文，經(jīng)驗證，本法快速、專屬性強，適用于對改善睡眠類保健食品或中成藥中添加的化學(xué)藥物的檢測。
【專利說明】
同時檢測7種睡眠類化學(xué)藥品的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體為針對改善睡眠類保健食品或中成藥中非法添加 的卡馬西平、鹽酸氯丙嗪、奧氮平、鹽酸多塞平、富馬酸喹硫平、奧卡西平、舒必利等7種化學(xué) 藥品的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 由于生活節(jié)奏加快，工作壓力加大，社會中失眠患者日益增多，借助藥物來改善睡 眠的人群也在不斷增加。許多人認(rèn)為保健食品的副作用小，作用緩和，愿意購買保健食品來 提高睡眠質(zhì)量。但是，不法分子為了達(dá)到快速治療失眠的效果，在保健食品或中成藥中非法 添加鎮(zhèn)靜催眠類化學(xué)藥物。
[0003] 此類藥物往往會造成相當(dāng)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，而且具有耐藥性和依賴性，大多被列 為國家二類精神藥品，必須在醫(yī)師指導(dǎo)下用藥。如卡馬西平具有嗜睡作用，但其為抗驚厥、 三叉神經(jīng)痛藥，并有抗抑郁及抗心律失常的作用；氯丙嗪為抗精神病藥，具有神經(jīng)安定作 用，長期使用會產(chǎn)生耐藥性。因此，測定保健食品或中成藥中非法添加的化學(xué)藥物對保障公 民的身體健康有重要意義。
[0004] 現(xiàn)有的藥品及保健食品補充檢驗方法中收錄的改善睡眠類非法添加的化學(xué)藥物 有22種，根據(jù)近年來我所檢測近500批次的結(jié)果，未發(fā)現(xiàn)有添加上述藥物。除上述22種藥物 之外，還有一些具有睡眠作用的精神類藥物也可能添加到保健食品或中成藥中，如氯丙嗪、 卡馬西平，具有嗜睡作用。因此有必要對改善睡眠類保健食品或中成藥中非法添加的其他 精神類藥品進(jìn)行檢測方法的研究。
[0005] 目前，國家局已經(jīng)批準(zhǔn)的用于改善睡眠類保健食品或中成藥非法添加化學(xué)藥品的 補充檢驗方法有3個，分別為國家食品藥品監(jiān)管局藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目批準(zhǔn) 件2012004、2009024和2013002,其中包括22種非法添加的化學(xué)藥品的檢測，如氯氮卓、馬來 酸咪達(dá)唑侖、硝西泮、艾司唑侖、奧沙西泮、阿普唑侖、勞拉西泮、氯硝西泮、三唑侖、地西泮、 巴比妥、苯巴比妥、司可巴比妥、異戊巴比妥、氯美扎酮、褪黑素、佐匹克隆、氯苯那敏、扎來 普隆、文拉法辛、青藤堿、羅通定，但根據(jù)我所及外省檢驗結(jié)果，以及文獻(xiàn)報道，鮮有檢出上 述化學(xué)藥品。對于輔助睡眠保健食品尤其是不含褪黑素的保健食品是否還有其他化學(xué)藥品 的添加，用已有的補充檢驗方法不能夠解決這個問題，文獻(xiàn)報道也沒有上述化學(xué)藥品非法 添加的檢測方法，因此
【申請人】建立了新的7種具有睡眠功能的化學(xué)藥品的補充檢驗方法，供 非法添加篩選工作應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 由于HPLC-DAD法在保健食品非法添加的化學(xué)藥物檢測中初篩快速、成本低、應(yīng)用 廣，因此，本發(fā)明的目的是建立HPLC-DAD法檢測睡眠類保健食品或中成藥中卡馬西平等7種 精神類藥品的方法并進(jìn)行方法學(xué)驗證。
[0007] 本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)的： 一種同時檢測7種睡眠類化學(xué)藥品的檢測方法 實驗材料:磷酸二氫鉀，分析純；甲醇，分析純(提?。⑸V純(流動相）;鹽酸，分析純。
[0008] 對照品：卡馬西平，鹽酸氯丙嗪，奧氮平，鹽酸多塞平，富馬酸喹硫平，奧卡西平，舒 必利，購自中國食品藥品檢定研究院。
[0009] 儀器和設(shè)備:超聲提取儀，電子天平(萬分之一，十萬分之一），高效液相色譜儀。
[0010] 具體步驟如下： (1)、樣品預(yù)處理 固體樣品：精密稱取一次服用量至50ml容量瓶中，加甲醇40ml，超聲提取15min，放至室 溫，用甲醇定容至刻度。〇. 45μπι膜過濾，取續(xù)濾液，作為樣品待測液備用。
[0011] 液體試樣：精密量取l〇ml于50ml容量瓶中，加甲醇30ml，超聲提取15min，放至室 溫，用甲醇定容至刻度。〇. 45μπι膜過濾，取續(xù)濾液，作為樣品待測備用。
[0012] ⑵、測定 2.1、色譜參考條件 色譜柱：C18柱，4.6 X 250mm，5μπι; 柱溫:室溫35 °C; 流動相：甲醇-〇. 〇2mol/L磷酸二氫鉀溶液。
[0013] 梯度洗脫： 0-55min:甲醇5%-95%，磷酸二氫鉀95%-5%; 55-64min:甲醇95%-95%，磷酸二氫鉀5%-5%; 65-75min:甲醇5%-5%，磷酸二氫鉀95%-95%。
[0014] 檢測波長：250nm; 流速：1 .OmL/min。
[0015] 2.2、校準(zhǔn)曲線的制備 精密稱定上述7種對照品約12mg分別至9個25mL容量瓶中，卡馬西平，富馬酸喹硫平和 鹽酸多塞平等3種對照品用約20mL的甲醇溶解，奧卡西平、舒必利、奧氮平和鹽酸氯丙嗪等4 種對照品用約20mL的乙腈溶解。用溶媒定容后，搖勻，作為儲備液備用(約500yg/mL)。
[0016] 精密量取對照品儲備液各l.OmL至同一個10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻， 制成每lmL含對照品約50yg的對照品溶液。然后取5. OmL定容至10.0 mL，搖勾，以此類推，配 制成不同濃度的對照品溶液作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0017] 2.3、樣品測定 取上述樣品、不同濃度對照品續(xù)濾液各l〇yL進(jìn)樣，進(jìn)行測定。記錄色譜圖及樣品溶液中 與對照品保留時間相同的色譜峰的光譜圖。
[0018] 2.4、計算 供試品溶液中不得出現(xiàn)與對照品溶液保留時間一致的色譜峰，如果出現(xiàn)保留時間一致 的色譜峰，則其光譜圖應(yīng)不一致，如果一致，則質(zhì)譜圖應(yīng)不一致。
[0019] 對供試品溶液中出現(xiàn)與對照品溶液保留時間，光譜，質(zhì)譜均一致的色譜峰，則判定 為有非法添加，用以上方法進(jìn)行定量。
[0020] 以峰面積為縱坐標(biāo)，以不同進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，做標(biāo)曲曲線，將樣品峰面積帶入， 計算樣品待測液濃度。
[0021 ]計算非法添加物的含量，含量=濃度X定容體積X稀釋倍數(shù)/稱樣量。
[0022] 還可以進(jìn)行干擾排除，如色譜保留時間、光譜圖均與對照品一致，則用液質(zhì)聯(lián)用儀 測定，進(jìn)行干擾排除。
[0023] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案建立了使用同一種色譜條件同時測定輔助睡眠類保健食 品或中成藥中可能添加的7種化學(xué)藥物的高效液相色譜法，在75min內(nèi)完成了對各化合物的 分析測定，在保證分離度的情況下，實現(xiàn)了快速高效的高通量分析，經(jīng)驗證，本方法準(zhǔn)確度、 重復(fù)性高，精密度、重復(fù)性好，可用于睡眠類保健食品或中成藥中7種化學(xué)藥品的定性篩查 和定量檢測。
【附圖說明】
[0024] 圖1表示樣品中各組分分離效果色譜圖。
[0025] 圖2表示樣品測定圖譜。
【具體實施方式】
[0026] 下面對本發(fā)明的具體實施例進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0027] -種同時檢測7種睡眠類化學(xué)藥品的檢測方法 1、材料 1.1、儀器 戴安U3000高效液相色譜儀，MS-204S萬分之一電子天平，DV215⑶十萬分之一電子天 平，超聲波提取儀。
[0028] 1.2、試劑 磷酸二氫鉀，分析純；甲醇，分析純(提?。?、色譜純(流動相）;鹽酸，分析純。
[0029] 對照品： 卡馬西平，批號：100142-20110S，規(guī)格：100mg，含量99.8%。來源：中國食品藥品檢定研 究院。
[0030] 富馬酸喹硫平，批號：100815-201202，規(guī)格：100mg，含量99.9%。來源：中國食品藥 品檢定研究院。
[0031] 鹽酸氯丙嗪，批號：100460-201302，規(guī)格：100mg，含量99.7%，來源：中國食品藥品 檢定研究院。
[0032] 奧氮平，批號：100948-200801，規(guī)格：100mg，含量99.9%，來源：中國食品藥品檢定 研究院。
[0033] 鹽酸多塞平，批號：100069-201103，規(guī)格：100mg，含量99.5%，來源：中國食品藥品 檢定研究院。
[0034] 奧卡西平，批號：100657-201102,規(guī)格：100mg，含量99.8%，來源：中國食品藥品檢 定研究院。
[0035] 舒必利，批號：100203-200503,規(guī)格：100mg，含量100%，來源：中國食品藥品檢定研 究院。
[0036] 米氮平，批號：1.1，含量100%，來源:歐洲藥典參考標(biāo)準(zhǔn)品。
[0037]鹽酸西普肽蘭，批號：1.0，含量100%，來源:歐洲藥典參考標(biāo)準(zhǔn)品。
[0038]因穩(wěn)定性問題，本方法實施例中舍棄后兩種物質(zhì)的方法學(xué)驗證。
[0039] 1.3、具體檢測方法 1.3.1、 色譜條件 色譜柱：C18柱，4.6 X 250mm，5μπι; 柱溫:室溫35 °C; 流動相：甲醇-〇. 〇2mol/L磷酸二氫鉀溶液。
[0040]梯度洗脫： 0-55min:甲醇5%-95%，磷酸二氫鉀95%-5%; 55-64min:甲醇95%-95%，磷酸二氫鉀5%-5%; 65-75min:甲醇5%-5%，磷酸二氫鉀95%-95%。
[0041 ]檢測波長：250nm; 流速：1 .OmL/min。
[0042] 1.3.2、校準(zhǔn)曲線的制備 精密稱定上述9種對照品約12mg分別至9個25mL容量瓶中，卡馬西平，富馬酸喹硫平，鹽 酸多塞平3種對照品用約20mL的甲醇溶解，奧卡西平，舒必利，奧氮平，鹽酸氯丙嗪等4種對 照品用約20mL的乙腈溶解，鹽酸西普肽蘭用0.1 moL/L的鹽酸溶液20mL溶解。用溶媒定容后， 搖勻，作為儲備液備用。
[0043] 精密量取對照品儲備液各l.OmL至同一個10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻， 制成每lmL含對照品約50yg的對照品溶液。然后取5. OmL定容至10.0 mL，搖勾，以此類推，配 制成不同濃度的對照品溶液作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0044] 1.3.3、樣品預(yù)處理 固體樣品：精密稱取次服用量至50mL容量瓶中，加甲醇40mL，超聲提取15min，放至室 溫，用甲醇定容至刻度。〇. 45μπι膜過濾，取續(xù)濾液，作為樣品待測液備用。
[0045] 液體試樣：精密量取10mL于50mL容量瓶中，加甲醇30mL，超聲提取15min，放至室 溫，用甲醇定容至刻度。〇. 45μπι膜過濾，取續(xù)濾液，作為樣品待測備用。
[0046] 1.3.4、計算 供試品溶液中不得出現(xiàn)與對照品溶液保留時間一致的色譜峰，如果出現(xiàn)保留時間一致 的色譜峰，則其光譜圖應(yīng)不一致，如果一致，則質(zhì)譜圖應(yīng)不一致。
[0047] 對供試品溶液中出現(xiàn)與對照品溶液保留時間，光譜，質(zhì)譜均一致的色譜峰，則判定 為有非法添加，用以下方法進(jìn)行定量。
[0048] 以峰面積為縱坐標(biāo)，以不同進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，做標(biāo)曲曲線，將樣品峰面積帶入， 計算樣品待測液濃度。
[0049] 計算非法添加物的含量，含量=濃度X定容體積X稀釋倍數(shù)/稱樣量。
[0050] 2、方法學(xué)研究 2.1、 溶液的保存及穩(wěn)定性試驗 對照品儲備液配置后冰箱冷藏保存，測試溶液在配制后不同時間測定其峰面積，計算 其RSD，對對照品測試溶液進(jìn)行穩(wěn)定性考察。結(jié)果如下表1所示： 表1穩(wěn)定性實驗結(jié)果
表1表明，32小時內(nèi)測定同一份測試溶液，峰面積變化RSD%在0.73-4.4%之間。
[0051 ] 2.2、流動相 甲醇-磷酸二氫鉀、乙腈-磷酸二氫鉀為流動相進(jìn)行不同梯度洗脫考察，發(fā)現(xiàn)以甲醇-磷 酸二酸鉀梯度洗脫時，色譜峰分離度好，實驗效果最好，如圖1所示。
[0052] 2.3、檢測波長 考慮到不同化學(xué)藥品最大吸收波長不同，選擇250nm為其大多數(shù)物質(zhì)吸收值較高的波 長。
[0053] 2.4、線性范圍 將對照品溶液1和2注入液相色譜儀中，對照品溶液1進(jìn)樣2μ?、5μ?、lOyL、20UL，對照品 溶液2進(jìn)樣SnUlOuL，測定色譜峰面積，以進(jìn)樣量(ng)為橫坐標(biāo)，積分面積為縱坐標(biāo)求得回 歸方程，結(jié)果見表2。
[0054] 表2各組分線性范圍
表2中各組分線性范圍表示，線性范圍在20-600ug/mL之間。
[0055] 2.5、精密度 選擇標(biāo)曲中間濃度的對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，計算RSD，結(jié)果如表3所示，所有對照品 溶液的精密度RSD小于5%。
[0056] 表3精密度試驗
表3中同一份溶液連續(xù)測定，其精密度RSD在0.22-2.8%之間。
[0057] 2.6、重復(fù)性 因為暫找不到含7種物質(zhì)的樣品，用加標(biāo)樣替代樣品進(jìn)行重復(fù)性試驗。分別取lmL對照 品溶液1于5個已稱樣品的10mL容量瓶，甲醇定容至刻度。進(jìn)樣lOyL，測定樣品中各組分的含 量。測定結(jié)果表明：重復(fù)性試驗符合要求。結(jié)果見表4。
[0058] 表4重復(fù)性試驗(ng)
表4中以樣品加標(biāo)溶液作為陽性樣品溶液，制備同一水平5份樣品，測定5次樣品測定的 重復(fù)性，RSD在0.1 -3.6%之間。
[0059] 2.7、準(zhǔn)確度 采用加樣回收法測定。精密量取某口服液1 .〇 mL分別至9個10mL容量瓶中，精密加入對 照品溶液(0.4695mg/mL) lmL、0.8mL、0.4mL各3份，加甲醇至大約8mL，超聲15分鐘提取，定容 至1 OmL。取續(xù)濾液，進(jìn)樣1 Ομ L，計算回收率。結(jié)果見表5。
[0060] 表5平均回收率(％)
表5中高中低三個水平的平均回收率表明，回收率在95-102%之間。
[0061] 2.8、檢出限、定量限 將加標(biāo)樣品溶液逐級稀釋，過濾后進(jìn)樣，以峰高信噪比10:1的對照品濃度為定量濃度， 帶入稱樣量及稀釋體積后折算定量限(見下表6);同法以峰高信噪比3:1的對照品濃度為檢 出濃度，折算檢出限（見下表6)。
[0062] 表6檢出限與定量限（脫）
表6中系列稀釋加標(biāo)溶液測定檢出限及定量限結(jié)果表明，檢出限在0.4-2.5ng之間，定 量限在2.5-5.0之間。
[0063] 2.9、專屬性 本實施例方法為非法添加初篩方法，供試品溶液中如出現(xiàn)與對照品保留時間一致的色 譜峰，則用光譜圖比對其專屬性，光譜圖應(yīng)不一致，如果一致，用液質(zhì)聯(lián)用儀的質(zhì)譜圖比對， 質(zhì)譜圖應(yīng)不一致。
[0064] 2.10、樣品測定 根據(jù)驗證的方法，對實施例中對實際工作中收集的31批次不含褪黑素（均為藥食同源 原料)的保健食品進(jìn)行檢測，結(jié)果為均未檢出有非法添加。
[0065] 2.11、驗證結(jié)果評價 利用上述已建立的檢測方法，進(jìn)行方法學(xué)的驗證，其結(jié)果各參數(shù)見正文，經(jīng)驗證，本法 快速、專屬性強，適用于對改善睡眠類保健食品或中成藥中添加的化學(xué)藥物進(jìn)行檢測。
[0066]最后所應(yīng)說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參 照本發(fā)明實施例進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，對本發(fā)明的技術(shù)方案 進(jìn)行修改或者等同替換，都不脫離本發(fā)明的技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋本發(fā)明的 權(quán)利要求保護(hù)范圍中。
【主權(quán)項】
1. 一種同時檢測7種睡眠類化學(xué)藥品的檢測方法，其特征在于:包括如下步驟： (1)、樣品預(yù)處理 固體樣品：精密稱取一次服用量至容量瓶中，加甲醇，超聲提取15min，放至室溫，用甲 醇定容至刻度;0.45μπι膜過濾，取續(xù)濾液，作為樣品待測液備用； 液體試樣：精密量取一次服用量于容量瓶中，加甲醇，超聲提取15min，放至室溫，用甲 醇定容至刻度;0.45μηι膜過濾，取續(xù)濾液，作為樣品待測備用； ⑵、測定 2.1、 色譜條件 色譜柱：C18柱，4.6X250mm，5ym; 柱溫:室溫35 °C; 流動相：甲醇-〇 . 〇2mol/L磷酸二氫鉀溶液;梯度洗脫:0-55min:甲醇5%-95%，磷酸二氫 鉀95%-5%; 55-64min:甲醇95%-95%，磷酸二氫鉀5%-5%; 65-75min:甲醇5%-5%，磷酸二氫鉀 95%-95%； 檢測波長：250nm; 流速：1 .OmL/min; 2.2、 校準(zhǔn)曲線的制備 精密稱定卡馬西平、鹽酸氯丙嗪、奧氮平、鹽酸多塞平、富馬酸喹硫平、奧卡西平、舒必 利7種對照品，分別至7個容量瓶中，卡馬西平、富馬酸喹硫平和鹽酸多塞平3種對照品用甲 醇溶解，奧卡西平，舒必利、奧氮平和鹽酸氯丙嗪4種對照品用乙腈溶解;分別用溶媒定容 后，搖勻，作為儲備液備用； 精密量取對照品儲備液各l.OmL至同一個10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成 每lmL含對照品50-55yg的對照品溶液;然后取5. OmL定容至10.0 mL，搖勻，以此類推，配制成 不同濃度的對照品溶液作為標(biāo)準(zhǔn)曲線； 2.3、 樣品測定 取上述樣品、不同濃度對照品續(xù)濾液分別進(jìn)樣，進(jìn)行測定;記錄色譜圖及樣品溶液中與 對照品保留時間相同的色譜峰的光譜圖； (3)、計算 供試品溶液中不得出現(xiàn)與對照品溶液保留時間一致的色譜峰，如果出現(xiàn)保留時間一致 的色譜峰，則其光譜圖應(yīng)不一致，如果一致，則質(zhì)譜圖應(yīng)不一致； 對供試品溶液中出現(xiàn)與對照品溶液保留時間、光譜、質(zhì)譜均一致的色譜峰，則判定為有 非法添加； 以峰面積為縱坐標(biāo)，以不同進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，做標(biāo)曲曲線，將樣品峰面積帶入，計算 樣品待測液濃度； 計算非法添加物的含量，含量=濃度X定容體積X稀釋倍數(shù)/稱樣量。
【文檔編號】G01N30/02GK106018586SQ201610315824
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月12日
【發(fā)明人】董培智, 郭景文, 申國華, 施懷生, 王子龍
【申請人】山西省食品藥品檢驗所