專利名稱：檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。
背景技術(shù)：
豇豆胰蛋白酶抑制劑(CpTI)屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族中的Bowman-Birk類型的雙頭蛋白酶抑制劑，即一個(gè)抑制劑分子可以抑劑兩個(gè)胰蛋白酶分子的催化活性。自上世紀(jì)80年代，CpTI基因作為一種抗蟲基因成為轉(zhuǎn)基因植物的備選基因，并在表達(dá)后與非轉(zhuǎn)基因植物相比表現(xiàn)出優(yōu)良的抗蟲特性，目前已成為我國(guó)眾多轉(zhuǎn)基因棉花品種中所攜帶的基因。準(zhǔn)確評(píng)價(jià)CpTI轉(zhuǎn)基因作物的生態(tài)和食品安全性、進(jìn)行轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的強(qiáng)制標(biāo)識(shí)，檢驗(yàn)和監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)基因作物種子的純度等，必須建立起一套具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的快速、準(zhǔn)確的外源基因表達(dá)蛋白的檢測(cè)方法。目前檢驗(yàn)CpTI轉(zhuǎn)基因植物常用的方法是基因?qū)用娴姆肿訖z測(cè)方法。由于酶聯(lián)免疫測(cè)定技術(shù)具有高通量、快速及靈敏度高等特點(diǎn)，在轉(zhuǎn)基因植物鑒定等方面已經(jīng)獲得了廣泛的應(yīng)用，但CpTI的雙抗夾心酶免疫檢測(cè)方法還未見報(bào)道，所以建立一種精確的CpTI免疫檢測(cè)方法具有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體。本發(fā)明所提供的豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體，是由保藏編號(hào)為CGMCC No. 4617的豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株CpTI 3D6分泌產(chǎn)生的。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供保藏編號(hào)為CGMCC No. 4617的豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株CpTI 3D6。所述豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體在制備檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的酶聯(lián)免疫試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明所提供的檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的酶聯(lián)免疫試劑盒，含有所述豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體、豇豆胰蛋白酶抑制劑的多克隆抗體、豇豆胰蛋白酶抑制劑標(biāo)準(zhǔn)品； 所述豇豆胰蛋白酶抑制劑標(biāo)準(zhǔn)品為豇豆胰蛋白酶抑制劑。所述豇豆胰蛋白酶抑制劑標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12. 5ng/ mL、6. 25ng/mL、3. lng/mL、l. 56ng/mL、0. 78ng/mL 禾口 0. 39ng/mL。所述豇豆胰蛋白酶抑制劑標(biāo)準(zhǔn)品按照包括如下步驟的方法制備得到的(1)將豇豆種子粉浸泡于質(zhì)量百分比為0. 3%的氯化鈉水溶液中，得到浸泡后的混合物；將所述浸泡后的混合物離心，取上清液，即得到提取液；將所述提取液用飽和硫酸銨溶液進(jìn)行鹽析粗純化，取30% -60%鹽溶度間的蛋白溶液，即得到粗純化的豇豆胰蛋白酶抑制劑溶液；所述浸泡的溫度為4°C和浸泡時(shí)間為16h ；所述粗純化的溫度為4°C和粗純化時(shí)間為4h ；(2)將步驟⑴得到的粗純化的豇豆胰蛋白酶抑制劑溶液在以下條件下進(jìn)行凝膠過濾葡聚糖G-50填料，16mmxl00cm層析柱，0. IM pH7. OPBS緩沖液洗脫，流速0. 3ml/h, 1. 5mL/管進(jìn)行分步收集，取活性高部分濃縮，得到濃縮液；(3)將步驟( 得到的濃縮液在以下條件下進(jìn)行親和層析CNBr-Sepher0Se4B 填料，以豬胰蛋白酶作為配基，上樣緩沖液為0. IM pH7. OPBS緩沖液，洗脫液為0. 1ΜρΗ3. 0 甘氨酸-HCL緩沖液，流速lmL/min，每ImL進(jìn)行分步收集，取濃度高收集液合并，0. IM PH7. OPBS緩沖液透析凍干，用體積比為1 1的水甘油混合液進(jìn)行溶解，即豇豆胰蛋白酶抑制劑。所述試劑盒中含有用于標(biāo)記所述豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體的標(biāo)記酶。所述試劑盒中包括包被緩沖液、洗滌液、底物緩沖液、終止緩沖液和封閉液；所述包被緩沖液由Na2C03、NaHCO3和水組成；以上各成分在包被緩沖液中的濃度分別為=Na2CO3O. OlM和NaHCO3O. 04M ；所述洗滌液由Nei2HPO4、KH2PO4、NaCl、吐溫-20和水組成；以上各成分在洗滌液中的濃度分別為Νει2ΗΡ040. 02Μ、KH2PO4O. 0015Μ、NaClO. 14M 和吐溫-20的體積百分比濃度為0. ；所述底物緩沖液由檸檬酸三鈉、Na2HPO4和水組成；以上各成分在底物緩沖液中的濃度分別為檸檬酸三鈉0. OlM和Na2HPO4O. 03M。所述終止緩沖液由硫酸和水組成；所述硫酸在所述終止緩沖液中的濃度為2M ；所述封閉液由Na2HPCV KH2PO4、NaCl、脫脂牛奶和水組成；以上各成分在封閉液中的濃度分別為Νει2ΗΡ040. 02Μ、KH2PO4O. 0015Μ、NaClO. 14M 和脫脂牛奶的質(zhì)量百分比濃度為3%。所述標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的方法。本發(fā)明所提供的檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的方法，包括如下步驟將待測(cè)樣品進(jìn)行前處理，得到樣品檢測(cè)液；再用所述試劑盒對(duì)樣品檢測(cè)液進(jìn)行檢測(cè)；所述前處理的方法包括如下步驟將所述待測(cè)樣品研磨后，用PBS緩沖液進(jìn)行浸泡，得到浸泡后的混合物；將所述混合物進(jìn)行離心，取上清，即得到樣品檢測(cè)液；所述浸泡的時(shí)間為12小時(shí)；所述離心的轉(zhuǎn)速為8000r/min和離心的溫度為4°C ；所述PBS緩沖液由Νει2ΗΡ04、KH2PO4, NaCl和水組成；以上各成分在PBS緩沖液中濃度分別為Νει2ΗΡ04 0 . 02Μ、KH2PO4 0. 0015Μ和NaCl 0. 14Μ。所述豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體、所述試劑盒或所述方法在鑒別轉(zhuǎn)CpTI基因植物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種輔助鑒別轉(zhuǎn)CpTI基因植物的方法。本發(fā)明所提供的輔助鑒別轉(zhuǎn)CpTI基因植物的方法，包括如下步驟用所述試劑盒對(duì)待測(cè)植物進(jìn)行檢測(cè)，以已知的非轉(zhuǎn)基因植物作為對(duì)照，若對(duì)待測(cè)植物進(jìn)行檢測(cè)時(shí)檢測(cè)孔的吸光值大于所述對(duì)照的3倍，則確認(rèn)所述待測(cè)植物為候選的轉(zhuǎn)CpTI基因植物。本發(fā)明應(yīng)用抗CpTI多克隆抗體及酶標(biāo)記抗CpTI單克隆抗體，采用雙抗夾心ELISA 方法進(jìn)行試劑盒制備，并應(yīng)用制備的試劑盒鑒定轉(zhuǎn)基因作物真?zhèn)危哂锌焖?、靈敏的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明所提供的檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒將有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)CpTI蛋白濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、制備檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的酶聯(lián)免疫試劑盒一、試劑盒的制備 (一)CpTI免疫原和CpTI標(biāo)準(zhǔn)品的制備CpTI免疫原和CpTI標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)由豇豆蛋白提取、鹽析、凝膠過濾和親和層析步驟獲得，具體方法如下(I)CpTI蛋白提取和粗純化以高鹽溶液進(jìn)行豇豆總蛋白提取，具體方法為取80克黑梅一號(hào)豇豆種子(購(gòu)白益農(nóng)蔬菜種子商行)研磨成粉用400ml 0. 3%氯化鈉水溶液進(jìn)行浸泡，浸泡條件為溫度為 4°C，時(shí)間為16h，期間進(jìn)行搖動(dòng)，離心，取上清液，即得到提取液。將得到的提取液以飽和硫酸銨溶液進(jìn)行鹽析粗純化，粗純化條件為溫度為4°C， 時(shí)間為4h，靜置，取30% -60%鹽溶度間的蛋白溶液，即得到粗純化CpTI蛋白溶液。(2)凝膠過濾取步驟(1)所得粗純化的CpTI蛋白溶液進(jìn)行凝膠過濾，凝膠過濾的條件為葡聚糖 G-50填料，16mmxl00cm層析柱，0. IM pH7. OPBS緩沖液洗脫，流速0. 3ml/h, 1. 5mL/管進(jìn)行分部收集，監(jiān)測(cè)各管收集液蛋白濃度及抑制活性，取活性高部分濃縮，得到濃縮液。(3)親和層析取步驟( 得到的濃縮液進(jìn)行親和層析，此步驟的條件為CNBr-Sepher0Se4B填料，以豬胰蛋白酶(購(gòu)自Sigma公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為9002-07-7)作為其配基，上樣緩沖液為 0. IM pH7. OPBS緩沖液，洗脫液為0. IM ρΗ3· 0甘氨酸-HCL緩沖液，流速lmL/min,每ImL進(jìn)行分部收集，檢測(cè)各管蛋白濃度及抑制活性，取濃度高收集液合并，0. IM PH7. OPBS緩沖液透析凍干，得到CpTI蛋白，-20°C保存。以超純水溶解得到的CpTI蛋白，使其終濃度為Img/ mL，作為CpTI免疫原溶液；以水甘油(1 1)溶解得到的CpTI蛋白，使其終濃度為Img/ mL，作為CpTI蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液。上述步驟⑵和步驟(3)中所述蛋白抑制活性實(shí)驗(yàn)的具體方法為以N-苯甲酰-DL-精氨酸對(duì)硝基苯酰胺鹽酸鹽BAPNA為底物，取待測(cè)液0. Iml加入IOml試管中，加 50mg/L的豬胰蛋白酶0. 5mL。最后體積均用pH8. 0,0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液補(bǔ)至lmL， 37°C保溫 5min，加 ΒΑΡΝΑ 溶液 2. 5mL(l X lO^nol/L)，37°C反應(yīng) 5min，立即加入 0. 4ml 60% 醋酸溶液終止反應(yīng)，以不加待測(cè)液的試樣做對(duì)照，410nm處測(cè)定OD值。計(jì)算各分部收集液抑制活性，即對(duì)照吸光值與收集液吸光值的差值，再與對(duì)照吸光值的比值。該比值越高說明抑制活性越強(qiáng)，反之則弱。當(dāng)分部收集液的抑制活性出現(xiàn)快速持續(xù)增長(zhǎng)時(shí)，合并收集液，直至抑制活性下降至平緩水平。(二)抗CpTI的多克隆抗體的制備CpTI多克隆抗體為免疫原免疫家兔，經(jīng)過血清提取及抗體純化步驟得到，具體方法如下(1)取3月兔齡的新西蘭大耳白兔(購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，體重 ^gW上，作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。(2)基礎(chǔ)免疫將實(shí)驗(yàn)(一)得到的CpTI免疫原溶液(lmg/mL)經(jīng)無菌過濾器過濾后加入等體積弗氏完全佐劑(購(gòu)自Sigma公司，商品目錄號(hào)為F5881)，用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢枞榛?，直到滴入水中不擴(kuò)散。用乳化好的免疫原采用后腳趾間隙注射白兔，注射劑量為 Img抗原/只。(3)加強(qiáng)免疫基礎(chǔ)免疫一個(gè)月后，取ImL實(shí)驗(yàn)(一)得到的CpTI免疫原溶液，加入ImL弗氏不完全佐劑(購(gòu)自Sigma公司，商品目錄號(hào)為F5506)，用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢枞榛?，直到滴入水中不擴(kuò)散。將乳化好的免疫原采用后腿股淋巴結(jié)或背部、頸部皮下多點(diǎn)注射白兔，每只白兔的注射劑量為lmg。加強(qiáng)免疫每隔20天免疫一次，第五次免疫后第7天，在頸動(dòng)脈采全血，置4°C冰箱過夜，以3000r/min離心，分離血清，用辛酸-飽和硫酸銨法將得到的血清進(jìn)行純化，得到多克隆抗體，_20°C保存。(三)抗CpTI的單克隆抗體的制備CpTI單克隆抗體為免疫原免疫小鼠經(jīng)過細(xì)胞融合、篩選、亞克隆、腹水制備及抗體純化步驟得到。免疫方法(1)取8-10周齡的Bal b/C小白鼠(購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。(2)基礎(chǔ)免疫將實(shí)驗(yàn)(一)得到的CpTI免疫原溶液(lmg/mL)經(jīng)無菌過濾器過濾后加入等體積弗氏完全佐劑，用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢枞榛?，直到滴入水中不擴(kuò)散。用乳化好的免疫原采用腹腔及背部皮下多點(diǎn)注射Bal b/C小鼠，注射劑量為0. Img抗原/只。(3)加強(qiáng)免疫基礎(chǔ)免疫2周后，取ImL實(shí)驗(yàn)(一)得到的CpTI免疫原溶液，加入 ImL弗氏不完全佐劑，用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢枞榛钡降稳胨胁粩U(kuò)散。將乳化好的免疫原采用腹腔及背部皮下多點(diǎn)注射Bal b/C小鼠，每只小鼠的注射劑量為0. Img0加強(qiáng)免疫每隔10天免疫一次，從第三次加強(qiáng)免疫開始，每次免疫后第7天，從小鼠眼眶采血，測(cè)定抗體效價(jià)，效價(jià)的定義為OD值為1時(shí)的血清稀釋倍數(shù)。待效價(jià)大于1 8000 后，選擇血清效價(jià)最佳的小鼠(效價(jià)為1 40000)進(jìn)行細(xì)胞融合篩選單克隆抗體。有限稀釋法篩選分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；采取間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法篩選分泌抗體效價(jià)高的單克隆細(xì)胞株。細(xì)胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞，按9 1(數(shù)量配比)比例與 SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選得到穩(wěn)定分泌抗CpTI的單克隆抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞株。 將此細(xì)胞株命名為CpTI 3D6，分類命名為雜交瘤細(xì)胞，該細(xì)胞株已于2011年03月01日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCCJia 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCC No. 4617。
間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法步驟如下包被在96孔酶標(biāo)板中每孔加入IOOmL實(shí)驗(yàn)(一)得到的CpTI免疫原溶液，37°C 包被3小時(shí)，用PBS緩沖液洗滌4次。封閉封閉液150 μ L/孔，在37°C濕盒中封閉lh，棄封閉液，洗滌3次。加抗體將不同稀釋倍數(shù)的增量培養(yǎng)法得到的單抗加至酶標(biāo)板中，置濕盒中37°C 條件下30min，洗板4次。加酶標(biāo)二抗將羊抗鼠酶標(biāo)二抗IgG-HRP(購(gòu)自Jackson公司，商品目錄號(hào)為 79556) (0. lmg/mL)稀釋1000倍，每孔加100 μ L，置濕盒中37°C條件下30min，洗板4次。顯色取20mg0PD溶于IOmL底物稀釋液中，加4 μ L 30% H2O2，將底物溶液加入酶標(biāo)板中，每孔100 μ L。避光顯色15min。終止每孔加入50 μ L終止液，用酶標(biāo)儀490nm處測(cè)定各孔的OD值。單克隆抗體的制備與純化增量培養(yǎng)法將雜交瘤細(xì)胞CpTI 3D6置于細(xì)胞培養(yǎng)基中，在37°C條件下于二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，用辛酸-飽和硫酸銨法將得到的培養(yǎng)液進(jìn)行純化，得到豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體，-20°C保存。所述細(xì)胞培養(yǎng)基為向DMEM培養(yǎng)基中添加小牛血清(購(gòu)自GIBC0BRL，產(chǎn)品目錄號(hào)為 26170-043)和碳酸氫鈉，使小牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)基中的終濃度為20% (質(zhì)量百分含量)， 使碳酸氫鈉在細(xì)胞培養(yǎng)基中的終濃度為0.2% (質(zhì)量百分含量)；所述細(xì)胞培養(yǎng)基的PH為 7. 4。(四)酶標(biāo)抗體的制備(I)HRP的活化將IOmg辣根過氧化物酶(HRP)(購(gòu)自Sigma公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為 P6782)溶于ImL水中，加入0. 2mL IOOmM NaIO4水溶液，25°C攪拌反應(yīng)20min，將得到的溶液記作溶液I ；HRP與NaIO4的投料配比為IOmgHRP :0. 02molNaI04 ；此步驟的目的是使HRP 糖基上的鄰二羥基被氧化成活性醛基，生成的醛基與抗體蛋白的氨基共價(jià)鍵結(jié)合，避免了因酶分子上的氨基或羧基參與偶聯(lián)反應(yīng)而使酶的活性產(chǎn)生較大損失。(2)向所述溶液I中加入20μ 1的IM的乙二醇水溶液，25°C攪拌反應(yīng)lOmin，將反應(yīng)溶液置于透析袋中與PH7. 5的PBS緩沖液中4°C透析4小時(shí)。將得到的溶液記作溶液II ； 乙二醇與NaIO4的投料摩爾比為1 1。加入乙二醇的目的是使其與過量的NaIO4反應(yīng)，終止NaIO4氧化反應(yīng)并去除其對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干擾。(3)將7mg上述實(shí)驗(yàn)(三)得到的豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體溶于ImL PH值為9. 5的碳酸鹽緩沖液中，再加入所述溶液II，調(diào)節(jié)PH值至8. 0，25 V反應(yīng)2小時(shí)，將得到的溶液記作溶液III ;HRP與單克隆抗體的投料摩爾比為2 1。(4)向所述溶液III中加入0. ImL濃度為0. IM的NaBH4水溶液，4°C攪拌反應(yīng)2小時(shí)，得到溶液IV。此步驟的目的是還原過碘酸鈉氧化法產(chǎn)生的不穩(wěn)定的醛基與氨基形成的 C = N雙鍵(C = N雙鍵指酶與抗體蛋白之間的連接鍵)。(5)將步驟(4)的得到的溶液IV置于PBS中透析完全，得到抗體蛋白與HRP的偶聯(lián)物，即得到辣根過氧化物酶標(biāo)記的豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體。二、檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的酶聯(lián)免疫試劑盒1、包被原上述實(shí)驗(yàn)(二)制備得到的抗CpTI的兔多克隆抗體。
2、酶標(biāo)抗體上述實(shí)驗(yàn)(四)制備得到的辣根過氧化物酶標(biāo)記的豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體。3、包被緩沖液由Na2C03、NaHCO3和水緩沖液組成；以上各成分在包被緩沖液中的濃度分別為=Na2CO3O. OlM和NaHCO3O. 04M ；所述包被緩沖液的pH值為9. 6。4、洗滌液由 Νει2ΗΡ04、KH2PO4, NaCl、吐溫-20 和水組成；以上各成分在洗滌液中的濃度分別為Νει2ΗΡ040. 02Μ、KH2PO4O. 0015Μ、NaClO. 14M 和吐溫-20的體積百分比濃度為0. ；所述洗滌液的pH值為7. 5。5、標(biāo)準(zhǔn)品溶液用PBS緩沖液將上述實(shí)驗(yàn)(一)制備得到的CpTI蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液 (lmg/mL)稀釋至以下濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液中CpTI 蛋白濃度分別為 100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12. 5ng/mL、 6. 25ng/mL、3. lng/mL、l. 56ng/mL、0. 78ng/mL 禾口 0. 39ng/mL。所述PBS緩沖液由Νει2ΗΡ04、KH2PO4, NaCl和水組成；以上各成分在PBS緩沖液中濃度分別為Νει2ΗΡ040· 02Μ、KH2PO4O. 0015Μ和NaCl 0. 14Μ。6、底物緩沖液所述底物緩沖液由檸檬酸三鈉、Na2HPO4和水組成；以上各成分在底物緩沖液中的濃度分別為檸檬酸三鈉0. OlM和Na2HPO4O. 03Μ ；所述底物緩沖液的PH值為5.5。7、終止緩沖液2. OM的硫酸水溶液。8、封閉液由Νει2ΗΡ04、KH2PO4, NaCl、脫脂牛奶和水組成；以上各成分在封閉液中的濃度分別為Νει2ΗΡ040. 02Μ、KH2PO4O. 0015Μ、NaClO. 14M 和脫脂牛奶的質(zhì)量百分比濃度為3%。9、樣品稀釋液與洗滌液的成分相同。實(shí)施例2、試劑盒的應(yīng)用一、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(1)多克隆抗體的包被將lmg/mL抗CpTI的兔多克隆抗體用包被緩沖液進(jìn)行稀釋，按照抗CpTI的兔多克隆抗體與包被緩沖液的體積比為1 1000的比例稀釋后加入到酶標(biāo)板中，每孔ΙΟΟμ 1，37°C溫育3小時(shí)；倒去酶標(biāo)板中的溶液，用PBS緩沖液洗板4次，甩干。(2)在步驟(1)的酶標(biāo)板中分別加入不同濃度的CpTI蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液(實(shí)驗(yàn)孔)， 每孔100 μ 1，對(duì)照孔中不添加標(biāo)準(zhǔn)品溶液而加入100 μ 1 PBS緩沖液；37°C溫育30min ；倒掉酶標(biāo)板中的溶液，用PBS緩沖液洗板4次，甩干；所述不同濃度的CpTI蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液中CpTI蛋白濃度分別為100ng/mL、50ng/ mL、25ng/mL、12. 5ng/mL、6. 25ng/mL、3. lng/mL、l. 56ng/mL、0. 78ng/mL 禾口 0. 39ng/mL。(3)將lmg/mL的辣根過氧化物酶標(biāo)記的豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體(酶標(biāo)記抗體)用PBS緩沖液進(jìn)行稀釋，按照酶標(biāo)記抗體與PBS緩沖液的體積比為1 500稀釋后， 分別向上述步驟O)的酶標(biāo)板中加入100 μ 1稀釋后的酶標(biāo)記抗體；37°C溫育30min ；倒掉酶標(biāo)板中的溶液，用PBS緩沖液洗板4次，甩干。
(4)向步驟(3)的酶標(biāo)板中分別加入100 μ 1底物緩沖液，室溫反應(yīng)15min后，再向每孔中加入50 μ 1 2. OM的硫酸水溶液終止反應(yīng)。(5)在492nm下測(cè)定吸光值。(6)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線以不同濃度的CpTI蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度(ng/mL)的對(duì)數(shù)值作為X軸，以吸光度值B作為Y軸，運(yùn)用0rigin7. 0繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，取三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖如圖1所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y = 0. 2875x+0. 165 (R2 = 0. 9932)。二、轉(zhuǎn)基因作物真?zhèn)蔚蔫b定(1)將轉(zhuǎn)基因棉花SGK321(公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得，記載過該材料的非專利文獻(xiàn)是眭書祥，趙國(guó)忠，李愛國(guó)等.轉(zhuǎn)Bt+CpTI基因抗蟲棉品種SGK321性狀分析和種質(zhì)利用.科技導(dǎo)報(bào).2008,26(9) 42 45)的葉片于研缽中研磨，用PBS緩沖液于4°C浸泡12 小時(shí)，8000r/min 4°C離心取上清，得到轉(zhuǎn)基因作物樣本溶液。用同樣的方法得到非轉(zhuǎn)基因棉花石遠(yuǎn)321(公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得，記載過該材料的非專利文獻(xiàn)是眭書祥，趙國(guó)忠，李愛國(guó)等.轉(zhuǎn)Bt+CpTI基因抗蟲棉品種SGK321性狀分析和種質(zhì)利用.科技導(dǎo)報(bào).2008， 26(9) 42 45)葉片的樣本溶液。所述PBS緩沖液由Na2HPO4, KH2PO4, NaCl和水組成；以上各成分在PBS緩沖液中濃度分別為Νει2ΗΡ040 . 02Μ、KH2PO4O. 0015Μ和NaCl 0. 14Μ。(2)多克隆抗體的包被與上述實(shí)驗(yàn)一(即制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)驗(yàn))中步驟(1)相同。(3)除將CpTI蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液替換為上述步驟(2)得到樣本溶液以外，其余方法均與上述實(shí)驗(yàn)一(即制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)驗(yàn))中步驟(2)相同。(4)與上述實(shí)驗(yàn)一(即制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)驗(yàn))中步驟⑶相同。(5)與上述實(shí)驗(yàn)一(即制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)驗(yàn))中步驟⑷相同。(6)與上述實(shí)驗(yàn)一(即制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)驗(yàn))中步驟(5)相同。(7)含有轉(zhuǎn)基因樣品提取液的孔與含有非轉(zhuǎn)基因樣品提取液的孔顏色有明顯不同，含有轉(zhuǎn)基因樣品提取液的孔顏色深，含有非轉(zhuǎn)基因樣品提取液的孔顏色淺。以非轉(zhuǎn)基因樣品為對(duì)照，待肉眼觀測(cè)到鑒定樣品的顏色明顯深于非轉(zhuǎn)基因樣品時(shí)，認(rèn)為其為轉(zhuǎn)基因樣品，顏色沒有差別時(shí)，認(rèn)為所鑒定樣品為非轉(zhuǎn)基因樣品。由此可初步鑒定轉(zhuǎn)基因作物的真?zhèn)?。同時(shí)，以步驟(6)所得到吸光值鑒別轉(zhuǎn)基因作物真?zhèn)?，即所鑒定樣品吸光值大于對(duì)照樣品吸光值三倍時(shí)，認(rèn)為所鑒定樣品為轉(zhuǎn)基因樣品，否則為非轉(zhuǎn)基因樣品。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果取平均值。在本實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)基因棉花SGK321樣品測(cè)得的吸光值為0. 355，非轉(zhuǎn)基因棉花石遠(yuǎn) 321樣品測(cè)得吸光值為0. 113，轉(zhuǎn)基因棉花SGK321樣品的吸光值大于非轉(zhuǎn)基因棉花石遠(yuǎn)321 樣品吸光值三倍，說明該方法準(zhǔn)確、可靠。對(duì)轉(zhuǎn)基因樣品進(jìn)行半定量檢測(cè)將所得鑒定樣品的OD值代入上述實(shí)驗(yàn)一得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，即可得到鑒定樣品溶液中CpTI的蛋白含量。由該方法得到的轉(zhuǎn)基因棉花 SGK321樣品溶液中CpTI的蛋白含量為1. 939ng/mL。
權(quán)利要求
1.一種豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體，是由保藏編號(hào)為CGMCC No. 4617的豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株CpTI 3D6分泌產(chǎn)生的。
2.保藏編號(hào)為CGMCCNo. 4617的豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株CpTI3D6。
3.權(quán)利要求1中所述的豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體在制備檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的酶聯(lián)免疫試劑盒中的應(yīng)用。
4.一種檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的酶聯(lián)免疫試劑盒，含有權(quán)利要求1所述豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體、豇豆胰蛋白酶抑制劑的多克隆抗體、豇豆胰蛋白酶抑制劑標(biāo)準(zhǔn)品；所述豇豆胰蛋白酶抑制劑標(biāo)準(zhǔn)品為豇豆胰蛋白酶抑制劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述豇豆胰蛋白酶抑制劑標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為 100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12. 5ng/mL、6. 25ng/mL、3. lng/mL、l. 56ng/mL、0. 78ng/mL 和 0.39ng/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中含有用于標(biāo)記所述豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體的標(biāo)記酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中包括包被緩沖液、洗滌液、底物緩沖液、終止緩沖液和封閉液；所述包被緩沖液由Na2C03、NaHCO3和水組成；以上各成分在包被緩沖液中的濃度分別為=Na2CO3O. OlM和NaHCO3O. 04M ；所述洗滌液由Na2HP04、KH2PO4, NaCl、吐溫-20和水組成；以上各成分在洗滌液中的濃度分別為Νει2ΗΡ040. 02Μ、KH2PO4O. 0015Μ、NaClO. 14M和吐溫-20的體積百分比濃度為0. ；所述底物緩沖液由檸檬酸三鈉、Na2HPO4和水組成；以上各成分在底物緩沖液中的濃度分別為檸檬酸三鈉0. OlM和Na2HPO4O. 03M。所述終止緩沖液由硫酸和水組成；所述硫酸在所述終止緩沖液中的濃度為2M ；所述封閉液由Na2HPCV KH2P04、NaCl、脫脂牛奶和水組成；以上各成分在封閉液中的濃度分別為Νει2ΗΡ040. 02Μ、KH2PO4O. 0015Μ、NaClO. 14M和脫脂牛奶的質(zhì)量百分比濃度為3%。所述標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶。
8.—種檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的方法，包括如下步驟將待測(cè)樣品進(jìn)行前處理，得到樣品檢測(cè)液；再用權(quán)利要求4-7中任一所述的試劑盒對(duì)樣品檢測(cè)液進(jìn)行檢測(cè)；所述前處理的方法包括如下步驟將所述待測(cè)樣品研磨后，用PBS緩沖液進(jìn)行浸泡，得到浸泡后的混合物；將所述混合物進(jìn)行離心，取上清，即得到樣品檢測(cè)液；所述浸泡的時(shí)間為12小時(shí)；所述離心的轉(zhuǎn)速為8000r/min和離心的溫度為4°C。
9.權(quán)利要求1中所述豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體、權(quán)利要求4-7中任一所述試劑盒或權(quán)利要求8所述方法在鑒別轉(zhuǎn)CpTI基因植物中的應(yīng)用。
10.一種輔助鑒別轉(zhuǎn)CpTI基因植物的方法，包括如下步驟用權(quán)利要求4-7中任一所述試劑盒對(duì)待測(cè)植物進(jìn)行檢測(cè)，以已知的非轉(zhuǎn)基因植物作為對(duì)照，若對(duì)待測(cè)植物進(jìn)行檢測(cè)時(shí)檢測(cè)孔的吸光值大于所述對(duì)照的3倍，則確認(rèn)所述待測(cè)植物為候選的轉(zhuǎn)CpTI基因植物。
全文摘要
本發(fā)明公開了檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明所提供的酶聯(lián)免疫試劑盒含有豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體；所述豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體，是由保藏編號(hào)為CGMCC No.4617的豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株CpTI 3D6分泌產(chǎn)生的。本發(fā)明應(yīng)用抗CpTI多克隆抗體及酶標(biāo)記抗CpTI單克隆抗體，采用雙抗夾心ELISA方法進(jìn)行試劑盒制備，并應(yīng)用制備的試劑盒鑒定轉(zhuǎn)基因作物真?zhèn)危哂锌焖?、靈敏的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N21/31GK102199211SQ201110090869
公開日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2011年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月12日
發(fā)明者南鐵貴, 孫碩, 曹振, 李召虎, 王保民, 王敏, 譚桂玉, 趙洪偉, 高巍 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)