一種抑制大豆細(xì)菌性斑疹病的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)病害防治技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抑制大豆細(xì)菌性斑疹病的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 大豆原產(chǎn)于我國，是重要的糧食、油料作物，在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有相當(dāng)重要的地 位。20世紀(jì)90年代以來，隨著人們對大豆保健功能的不斷認(rèn)識，菜用大豆(俗稱毛豆)迅速發(fā) 展，成為部分地區(qū)出口創(chuàng)匯農(nóng)產(chǎn)品和區(qū)域特色優(yōu)勢農(nóng)作物。在大豆整個(gè)生育期，其生長不斷 受到各種病原物(如細(xì)菌）的攻擊。在局部地區(qū)，高溫、多雨、濕潤的氣候?yàn)榇蠖拱哒畈【?侵染和繁殖提供了適宜的環(huán)境，病害日漸嚴(yán)重，嚴(yán)重影響著大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)，成為制約部 分地區(qū)（如浙江)菜用大豆產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一。
[0003] 大豆細(xì)菌性斑疹病菌，屬于黃單胞屬，該屬病原菌能侵染絕大多數(shù)蔬菜、經(jīng)濟(jì)作物 和農(nóng)作物，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失。目前，對大豆斑疹病害的治理主要是選育、栽培抗性 品種，使用化學(xué)農(nóng)藥。選育、栽培抗性品種受抗源不足或病原物快速變異使品種抗性喪失； 化學(xué)農(nóng)藥的廣泛使用造成環(huán)境污染，并激增病原菌的抗藥性。為阻止細(xì)菌抗藥性快速發(fā)展 趨勢，采用區(qū)別于傳統(tǒng)殺菌劑作用模式的新型抗菌劑勢在必行。傳統(tǒng)藥物一般只具有殺菌 或抑菌作用，限制病原菌的生長繁殖，從而導(dǎo)致抗藥性的加速發(fā)展。因此，研究開發(fā)或探索 對病原細(xì)菌生長繁殖非必須的，而對其發(fā)揮關(guān)鍵毒性功能的致病系統(tǒng)（如III型分泌系統(tǒng) (T3SS))起破壞或抑制作用的新型抗菌劑，或許是一個(gè)新思路、新領(lǐng)域。
[0004] 植物黃單胞屬細(xì)菌通過T3SS向寄主植物分泌效應(yīng)蛋白，III型效應(yīng)蛋白進(jìn)入寄主 植物體內(nèi)，干擾寄主防御反應(yīng);抑制植物細(xì)胞壁修復(fù);促進(jìn)細(xì)胞程序性死亡。分泌效應(yīng)蛋白 的T3SS裝置由二十幾種蛋白組成，是所有分泌系統(tǒng)中最復(fù)雜、最重要的。當(dāng)T3SS核心裝置組 分缺失時(shí)，病原細(xì)菌的致病性一般會喪失。研究表明，盡管效應(yīng)蛋白的功能因病原菌不同而 異，而T3SS核心裝置在不同病原菌中卻具有高度同源性、進(jìn)化保守性，暗示同類分子信號或 許能作用于多種病原細(xì)菌的T3SS。基于這些發(fā)現(xiàn)，探索或開發(fā)特異性針對于T3SS毒性裝置 革巴點(diǎn)的新型抗菌劑，或許是一個(gè)新探索、新策略。
[0005] 自2002年以來，研究者開始著手篩選病原細(xì)菌T3SS的抑制劑，并陸續(xù)建立起各種 高通量篩選體系，如細(xì)菌熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)、酶聯(lián)免疫吸附法、磷脂酶報(bào)告系統(tǒng)、GFP和RFP 蛋白報(bào)告系統(tǒng)等。篩選、并報(bào)道了一批特異性作用于T3SS的抑制劑(金屬離子化合物）。在鼠 血清型沙門氏菌（Salmonella enterica serovar typhimurium)中，Layton等人提出鄰輕 亞芐基酰胼在一定程度上是通過限制鐵離子的利用而起作用，并且這種抑制作用可通過添 加外源鐵離子而被逆轉(zhuǎn)。鐵離子在鄰羥亞芐基酰胼介導(dǎo)中所展示的T3SS抑制作用，暗示人 們:金屬離子或許能扮演T3SS抑制劑的作用。然而，在T3SS抑制劑方面的研究，主要偏向于 動物病原細(xì)菌，在植物病原細(xì)菌中的研究，還鮮有報(bào)道。
[0006] 目前研究認(rèn)為，金屬離子不僅與細(xì)菌的蛋白質(zhì)互作、調(diào)節(jié)蛋白的三維結(jié)構(gòu)與功能， 而且還能維持菌體內(nèi)離子平衡、增強(qiáng)病原菌的毒性。此外，細(xì)菌對金屬離子的耐受性以及金 屬離子通道的調(diào)控機(jī)制等方面也有頗多研究。然而，有關(guān)金屬離子影響植物病原細(xì)菌重要 毒性系統(tǒng)的研究還鮮有報(bào)道?；谙惹暗难芯浚畼返仁状翁骄苛私饘匐x子對野油菜黃 單胞病菌(植物黃單胞屬細(xì)菌)不同毒性系統(tǒng)的影響。發(fā)現(xiàn)Zn 2+和Mn2+同時(shí)對T2SS和T3SS有 抑制作用；Ca2+特異性抑制T3SS;Fe 2+同時(shí)抑制T2SS、T3SS和T4SS裝置基因的表達(dá)。然而，據(jù) 初步研究，大豆斑疹病菌(地毯黃單胞菌大豆致病變種)T3SS與其它植物黃單胞菌T3SS存在 一定的差異，諸如大豆斑疹病菌激發(fā)HR能力顯著減弱、并嚴(yán)重延遲，其部分hrc基因突變并 不影響病原菌的HR激發(fā)能力;大豆斑疹病菌的對碳水化合物利用能力顯著強(qiáng)于其他植物黃 單胞菌(如稻黃單胞菌)等。因此，金屬離子是否對大豆斑疹病菌T3SS具有抑制作用，哪種金 屬離子或組合物抑制效果顯著，以及能否成為防治大豆細(xì)菌性斑疹病的新型抗菌劑，還一 無所知。
[0007] 基于以上分析及國內(nèi)外研究進(jìn)展，本發(fā)明以大豆細(xì)菌性斑疹病的病原菌一地毯黃 單胞菌大豆致病變種(Xanthomonas axonopodis pv·glycines)為研究對象，篩選得到金屬 離子化合物組合物抑制劑，其在大豆細(xì)菌性斑疹病上具有顯著生防效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提出一種抑制大豆細(xì)菌性斑疹病的方法，對大豆細(xì)菌性斑疹病的 病原菌一地毯黃單胞菌大豆致病變種(Xanthomonas axonopodis pv.glycines)具有顯著 抑制效果。
[0009] 為達(dá)到本發(fā)明的目的所采取的技術(shù)方案如下：
[0010] -種抑制大豆細(xì)菌性斑疹病的方法，其特征在于:使大豆細(xì)菌性斑疹病的病原菌 接觸抑制劑組合物，所述的大豆細(xì)菌性斑疹病的病原菌為地毯黃單胞菌大豆致病變種 (Xanthomonas axonopodis pv.glycines)，所述的抑制劑組合物由NiCh，NaCl，ZnCl2組成；
[0011] 優(yōu)選地，所述的抑制劑組合物由 0.01ymol/L-100ymol/L 的 NiCl2,0.01ymol/L-100 ymol/L的NaCl，0 · 01ymol/L-100ymol/L的ZnCl2組成；
[0012] 優(yōu)選地，所述的抑制劑組合物由 0.05ymol/L-50ymol/L 的 NiCl2,0.1ymol/L-100y mol/L的NaCl，0 · 01ymol/L_5ymol/L的ZnCl2組成；
[0013] 優(yōu)選地，所述的抑制劑組合物由 0.05ymol/L-5ymol/L 的 NiCl2,0.5ymol/L-3.5y mol/L的NaCl，0 · Olymol/L-O · 5ymol/L的ZnCl2組成；
[0014] -種抑制大豆細(xì)菌性斑疹病的抑制劑組合物，其特征在于：抑制劑組合物由 NiCl2，NaCl，ZnCl2組成，所述的大豆細(xì)菌性斑疹病的病原菌為地毯黃單胞菌大豆致病變種 (Xanthomonas axonopodis pv.glycines)；
[0015] 優(yōu)選地，所述的抑制劑組合物由 0.05ymol/L-50ymol/L 的 NiCl2,0.1ymol/L-100y mol/L的NaCl，0 · 01ymol/L_5ymol/L的ZnCl2組成；
[0016] 優(yōu)選地，所述的抑制劑組合物由 0.05ymol/L-5ymol/L 的 NiCl2,0.5ymol/L-3.5y mol/L的NaCl，0 · Olymol/L-O · 5ymol/L的ZnCl2組成；
[0017] 上述任一項(xiàng)的抑制劑組合物用于抑制大豆細(xì)菌性斑疹病的用途，所述的大豆細(xì)菌 性斑疹病的病原菌為地毯黃單胞菌大豆致病變種（Xanthomonas axonopodis pv.glycines)〇
[0018] 本發(fā)明的有益效果：
[0019] 1、本發(fā)明的抑制劑組合物對大豆細(xì)菌性斑疹病的病原菌一地毯黃單胞菌大豆致 病變種(Xanthomonas axonopodis pv.glycines)具有特異性的抑制作用，抑制效果顯著。
[0020] 2、本發(fā)明的抑制劑組合物對環(huán)境無污染，綠色環(huán)保。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明并不局限于此，實(shí)施例中的百 分比均為重量比。
[0022] 實(shí)施例1
[0023]本實(shí)施例的抑制劑組合物包含0.05ymol/L的NiCl2，0.5ymol/L的NaCl，0.Ο?μπιο?/ L的ZnCl2，將上述組分充分混合攪拌均勻，得到本發(fā)明的抑制劑組合物。
[0024] 實(shí)施例2
[0025] 本實(shí)施例的抑制劑組合物包含0.5ymol/L的NiCl2，0.8ymol/L的NaCl，0.25ymol/L 的ZnCl2，將上述組分充分混合攪拌均勻，得到本發(fā)明的抑制劑組合物。
[0026] 實(shí)施例3
[0027] 本實(shí)施例的抑制劑組合物包含3.5ymol/L的NiCl2,2ymol/L的NaCl，0.3ymol/L的 ZnCl2，將上述組分充分混合攪拌均勻，得到本發(fā)明的抑制劑組合物。
[0028] 實(shí)施例4
[0029] 本實(shí)施例的抑制劑組合物包含0.09ymol/L的NiCl2，0.5ymol/L的NaCl，0.08ymol/ L的ZnCl2，將上述組分充分混合攪拌均勻，得到本發(fā)明的抑制劑組合物。
[0030] 比較試驗(yàn)A
[0031 ] 實(shí)驗(yàn)材料：地毯黃單胞菌大豆致病變種（Xanthomonas axonopodis pv.glycines)、NB液體培養(yǎng)基、附(：12、似(：1、211(：12、2%大豆汁液(大豆新鮮葉片在液氮中研 磨成粉末，然后溶于去離子水中，〇.22um過濾滅菌）。
[0032]試驗(yàn)方法：
[0033] 1、菌體生長測定
[0034] (1)挑選地毯黃單胞菌大豆致病變種（Xanthomonas axonopodis pv.glycines)菌 落接種于20ml NB液體培養(yǎng)基中，于28°C、200rpm搖床上振蕩培養(yǎng)20h(0D6(x) ? 1.0);
[0035] (2)用移液器吸取上述菌液200ul，重新接種于新鮮的NB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)振蕩 培養(yǎng)直到0D6QQ達(dá)到約1.0為止；
[0036] (3)將步驟（2