一種魚油產(chǎn)品中脂肪酸的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于成份檢測技術領域，涉及一種魚油產(chǎn)品中脂肪酸的檢測方法，檢測流程包括樣液配置、皂化反應、甲酯化反應、脫水處理和定容測試五個步驟，將脫水溶液在旋轉蒸發(fā)儀上進行濃縮并定容，然后使用氣相色譜?質譜聯(lián)用儀進行測定得出二十碳五烯酸甲酯和二十二碳六烯酸甲酯的色譜峰譜圖，分別進行二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸含量的定性分析和定量測定，通過比較樣液色譜峰的保留時間與標準樣品溶液的色譜峰保留時間是否一致，選擇的離子是否均出現(xiàn)，來判斷樣品中是否存在二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸；減少消耗、降低成本，減輕對實驗人員產(chǎn)生的職業(yè)危害，反應溫和、迅速、高效，檢測精密度高，檢測原理科學，操作步驟簡便，應用環(huán)境友好。
【專利說明】
一種魚油產(chǎn)品中脂肪酸的檢測方法
技術領域：
[0001] 本發(fā)明屬于成份檢測技術領域，涉及一種魚油產(chǎn)品中脂肪酸的檢測方法，特別是 一種采用皂化-甲酯化衍生方法制備待測溶液，使用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀進行定性、定量 分析魚油產(chǎn)品中脂肪酸的檢測方法。
【背景技術】：
[0002] 二十碳五烯酸(EPA)能夠降低膽固醇和甘油三酯的含量，促進體內飽和脂肪酸代 謝，防止脂肪在血管壁的沉積，降低血液粘稠度，預防動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展，預防腦 血栓、腦溢血、高血壓等心血管疾病;二十二碳六烯酸(DHA)作為一種必需脂肪酸，對增強記 憶與思維能力、提高智力等具有顯著作用；魚油產(chǎn)品中含有較高的EPA和DHA等多種不飽和 脂肪酸，具有較高的營養(yǎng)價值，可以作為人類飲食中多種不飽和脂肪酸的重要來源，因此， 營養(yǎng)學分析中常常將EPA和DHA作為重要的評估指標。
[0003] 目前常見的EPA和DHA檢測方法有:①直接提取法，此法原理和操作簡單，但需要使 用大量的有機試劑進行長時間的提取，成本較高;②三氟化硼-甲醇溶液甲酯化法，該方法 雖然前處理時間較短，但三氟化硼有毒，對人身體有所傷害，存在安全隱患;③氫氧化鉀-甲 醇溶液甲酯化法，該方法使用的有機試劑少，提取和反應迅速，但采用的檢測儀器為氣相色 譜-氫火焰離子化檢測器，屬于通用型檢測器，定性分析的準確度不高，容易受到干擾物質 的影響，造成檢測結果失真。因此，尋求設計一種用于檢測魚油產(chǎn)品中兩種脂肪酸的方法， 先采用鹽酸-甲醇溶液皂化，后采用氫氧化鈉-甲醇溶液甲酯化的衍生方法，采用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀進行定性、定量分析，具有溶劑使用少、反應時間短、操作步驟簡便、重現(xiàn)性和再 現(xiàn)性良好、精密度高等優(yōu)點，可以廣泛應用于各種魚油產(chǎn)品中兩種脂肪酸的分析檢測，結果 準確可靠，這種檢測方法至今尚未見有報道。

【發(fā)明內容】
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[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術存在的缺點，設計提出一種用于檢測魚油產(chǎn)品中 兩種脂肪酸的方法，以解決目前的檢測方法存在溶劑使用量大、反應時間長、所用試劑存在 有毒有害的安全隱患，以及分析檢測儀器定性分析的準確度差等問題。
[0005] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明涉及的魚油產(chǎn)品中脂肪酸的檢測方法包括樣液配 置、皂化反應、甲酯化反應、脫水處理和定容測試五個步驟，其具體檢測流程為：
[0006] (1)樣液配置:先在圖1所示的30-100ml的具塞容量瓶中稱取魚油樣品0.5-3g，再 加入5-50mL正己烷充分振蕩使其完全溶解得樣液，并記下正己烷定容的樣液刻度值；
[0007] (2)皂化反應：取步驟（1)制得的樣液0.5-5mL轉移至圖2所示的10mL具塞比色管 中，然后再向具塞比色管中加入濃度為l_3mol/L的氫氧化鈉的甲醇溶液0.5-5mL，充分振蕩 5-20min，再將溶液置于圖3所示的40-80°C的恒溫攪拌水浴鍋中加熱l_2min，進行皂化反應 后得皂化反應溶液；
[0008] (3)甲酯化反應:待步驟(2)制得的皂化反應溶液冷卻至室溫后，再向皂化反應溶 液中加入濃度為l_3mol/L的鹽酸的甲醇溶液l-5mL，充分振蕩5-20min，然后再置于40-60°C 的恒溫攪拌水浴鍋中加熱l_5min，進行甲酯化反應后得甲酯化反應溶液；
[0009] (4)脫水處理:將步驟(3)制得的甲酯化反應溶液的下層水溶液去掉，將上層正己 烷層轉移至裝有無水硫酸鈉的如圖4所示的漏斗裝置中進行脫水處理后得脫水溶液；
[0010] (5)定容測試:再將步驟(4)制得的脫水溶液在圖5所示的旋轉蒸發(fā)儀上進行濃縮 并定容至〇.5-3mL，然后使用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀進行測定得出二十碳五烯酸甲酯和二十 二碳六烯酸甲酯的色譜峰譜圖，分別進行二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸含量的定性分析 和定量測定：
[0011] a.定性分析:如果檢測出的二十碳五烯酸甲酯或二十二碳六烯酸甲酯的色譜峰的 保留時間與標準樣品溶液測得的色譜峰保留時間相一致，且選擇的離子均出現(xiàn)，并且所選 擇的離子豐度比與標準樣品的離子豐度比相一致，則可判斷樣品中存在二十碳五烯酸和二 十二碳六烯酸。其中二十碳五烯酸甲酯標準樣品的色譜峰保留時間為16.16min，定量離子 為227.00，參考離子為87.00、143.00、74.00;二十二碳六烯酸甲酯標準樣品的色譜峰保留 時間為16.16min，定量離子為264.00,參考離子為265.00、180.00、222.00。其中氣相色譜-質譜聯(lián)用儀的使用條件為:色譜柱為VF-5ms(30mX25mmX25ym)石英毛細管柱;色譜柱升溫 程序:先以60°C保持2min，然后以15°C/min的速率升溫至200°C并保持2min，再以2°C/min的 速率升溫至220°C，再以10°C/min的速率升溫至280°C并保持5min，再以10°C/min的速率升 溫至300°C并保持5min;載氣采用純度2 99.999 %的氦氣，載氣流速為1.2mL/min;進樣口溫 度保持在260°C;進樣量為UiL;進樣方式:不分流進樣，2min后打開分流閥和隔墊吹掃閥；電 子轟擊源的電子能量為70eV;離子源溫度為200°C;氣相色譜-質譜聯(lián)用儀的接口溫度為280 Γ。
[0012] b.定量測定:采用外標法單離子定量測定，計算公式：
[0014] 式中：
[0015] Xi 樣品中被測物i的殘留量，g/kg;
[0016] Ai-樣品中被測物i的色譜峰面積；
[0017] As-標準溶液中被測物i的色譜峰面積；
[0018] Cs-標準溶液中被測物i的濃度，mg/L;
[0019] V-樣品最終定容體積，mL;
[0020] m-樣品稱樣量，g;
[0021] Fi---被測物i與對應的脂肪酸的換算系數(shù)，二十碳五烯酸為0.962,二十二碳 六烯酸為0.963。
[0022]測定出二十碳五稀酸的含量為3~17g/kg，二十二碳六稀酸的含量為11~68g/kg。
[0023]本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，使用少量的有機試劑，減少消耗、降低成本，減輕對實驗 人員產(chǎn)生的職業(yè)危害;采用皂化-甲酯化衍生方法，反應溫和、迅速、高效，縮短前處理時間； 使用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀進行定性、定量分析，檢測精密度高;其檢測原理科學，操作步驟 簡便，檢測效果好，效率高，準確性強，應用環(huán)境友好。
【附圖說明】：
[0024] 圖1是本發(fā)明應用的樣品稱重的具塞容量瓶示意圖。
[0025] 圖2是本發(fā)明應用的具塞比色管示意圖。
[0026]圖3是本發(fā)明應用的恒溫攪拌水浴鍋結構原理示意圖。
[0027]圖4是本發(fā)明應用的脫水化處理的漏斗裝置組合結構原理示意圖。
[0028]圖5是本發(fā)明應用的旋轉蒸發(fā)儀組合結構原理示意圖。
【具體實施方式】：
[0029] 下面通過具體實施例并結合附圖對本發(fā)明作進一步說明。
[0030] 實施例1:
[0031] 本實施例涉及的魚油產(chǎn)品中脂肪酸的檢測方法包括樣液配置、皂化反應、甲酯化 反應、脫水處理和定容測試五個步驟，其具體檢測流程為：
[0032] (1)樣液配置:先在圖1所示的30-100ml的具塞容量瓶中稱取魚油樣品0.5-3g，再 加入5-50mL正己烷充分振蕩使其完全溶解得樣液，并記下正己烷定容的樣液刻度值；
[0033] (2)皂化反應：取步驟（1)制得的樣液0.5-5mL轉移至圖2所示的10mL具塞比色管 中，然后再向具塞比色管中加入濃度為l_3mol/L的氫氧化鈉的甲醇溶液0.5-5mL，充分振蕩 5-20min，再將溶液置于圖3所示的40-80°C的恒溫攪拌水浴鍋中加熱l_2min，進行皂化反應 后得皂化反應溶液；
[0034] (3)甲酯化反應:待步驟(2)制得的皂化反應溶液冷卻至室溫后，再向皂化反應溶 液中加入濃度為l_3mol/L的鹽酸的甲醇溶液l-5mL，充分振蕩5-20min，然后再置于40-60°C 的恒溫攪拌水浴鍋中加熱l_5min，進行甲酯化反應后得甲酯化反應溶液；
[0035] (4)脫水處理:將步驟(3)制得的甲酯化反應溶液的下層水溶液去掉，將上層正己 烷層轉移至裝有無水硫酸鈉的如圖4所示的漏斗裝置中進行脫水處理后得脫水溶液；
[0036] (5)定容測試:再將步驟(4)制得的脫水溶液在圖5所示的旋轉蒸發(fā)儀上進行濃縮 并定容至〇.5-3mL，然后使用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀進行測定得出二十碳五烯酸甲酯和二十 二碳六烯酸甲酯的色譜峰譜圖，分別進行二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸含量的定性分析 和定量測定：
[0037] a.定性分析:如果檢測出的二十碳五烯酸甲酯或二十二碳六烯酸甲酯的色譜峰的 保留時間與標準樣品溶液測得的色譜峰保留時間相一致，且選擇的離子均出現(xiàn)，并且所選 擇的離子豐度比與標準樣品的離子豐度比相一致，則可判斷樣品中存在二十碳五烯酸和二 十二碳六烯酸。其中二十碳五烯酸甲酯標準樣品的色譜峰保留時間為16.16min，定量離子 為227.00，參考離子為87.00、143.00、74.00;二十二碳六烯酸甲酯標準樣品的色譜峰保留 時間為16.16min，定量離子為264.00,參考離子為265.00、180.00、222.00。其中氣相色譜-質譜聯(lián)用儀的使用條件為:色譜柱為VF-5ms(30mX25mmX25ym)石英毛細管柱;色譜柱升溫 程序:先以60°C保持2min，然后以15°C/min的速率升溫至200°C并保持2min，再以2°C/min的 速率升溫至220°C，再以10°C/min的速率升溫至280°C并保持5min，再以10°C/min的速率升 溫至300°C并保持5min;載氣采用純度2 99.999 %的氦氣，載氣流速為1.2mL/min;進樣口溫 度保持在260°C;進樣量為UiL;進樣方式:不分流進樣，2min后打開分流閥和隔墊吹掃閥；電 子轟擊源的電子能量為70eV;離子源溫度為200°C;氣相色譜-質譜聯(lián)用儀的接口溫度為280 Γ。
[0038] b.定量測定:采用外標法單離子定量測定，計算公式：
[0040]式中：
[00411 X i-樣品中被測物i的殘留量，g/kg;
[0042] Ai-樣品中被測物i的色譜峰面積；
[0043] As-標準溶液中被測物i的色譜峰面積；
[0044] Cs-標準溶液中被測物i的濃度，mg/L;
[0045] V-樣品最終定容體積，mL;
[0046] m-樣品稱樣量，g;
[0047] Fi---被測物i與對應的脂肪酸的換算系數(shù)，二十碳五烯酸為0.962,二十二碳 六烯酸為0.963。
[0048]測定出二十碳五稀酸的含量為3~17g/kg，二十二碳六稀酸的含量為11~68g/kg。
[0049] 實施例2:
[0050] 本實施例按照實施例1的檢測步驟進行，具體檢測步驟為：
[0051] (1)樣液配置:先在圖1所示的50ml的具塞容量瓶中稱取魚油樣品lg，再加入10mL 正己烷充分振蕩使其完全溶解得樣液，并記下正己烷定容的樣液刻度值;試劑使用量少，可 以降低實驗成本、減輕環(huán)境污染、減少人體傷害；
[0052] (2)皂化反應:取步驟（1)制得的樣液lmL轉移至圖2所示的10mL具塞比色管中，然 后再向具塞比色管中加入濃度為2mol/L的氫氧化鈉的甲醇溶液lmL，充分振蕩lOmin，再將 溶液置于圖3所示的60°C的恒溫攪拌水浴鍋中加熱1.5min，進行皂化反應后得皂化反應溶 液；
[0053] (3)甲酯化反應:待步驟(2)制得的皂化反應溶液冷卻至室溫后，再向皂化反應溶 液中加入濃度為2mol/L的鹽酸的甲醇溶液2mL，充分振蕩lOmin，然后再置于50°C的恒溫攪 拌水浴鍋中加熱2min，進行甲酯化反應后得甲酯化反應溶液;其反應溫和、迅速、高效，避免 了使用高溫熱源、回流方式，可以極大縮短前處理時間，提高效率；
[0054] (4)脫水處理:將步驟(3)制得的甲酯化反應溶液的下層水溶液去掉，將上層正己 烷層轉移至裝有無水硫酸鈉的如圖4所示的漏斗裝置中進行脫水處理后得脫水溶液；
[0055] (5)定容測試:再將步驟(4)制得的脫水溶液在圖5所示的旋轉蒸發(fā)儀上進行濃縮 并定容至lmL，然后使用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀進行測定得出二十碳五烯酸甲酯和二十二碳 六烯酸甲酯的色譜峰譜圖，根據(jù)色譜峰譜圖分別進行二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸含量 的定性分析和定量測定，測定出二十碳五稀酸的含量為6g/kg，二十二碳六稀酸的含量為 23g/kg;與傳統(tǒng)的氣相色譜配備氫火焰離子化檢測器相比，可以克服其定性準確度低的缺 點，對目標物進行準確的檢測。
[0056] 實施例3:
[0057]本實施例按照與實施例1相同的檢測步驟進行，具體檢測步驟為：
[0058] (1)樣液配置:先在圖1所示的30ml的具塞容量瓶中稱取魚油樣品0.5g，再加入5mL 正己烷充分振蕩使其完全溶解得樣液，并記下正己烷定容的樣液刻度值;試劑使用量少，可 以降低實驗成本、減輕環(huán)境污染、減少人體傷害；
[0059] (2)皂化反應:取步驟（1)制得的樣液0.5mL轉移至圖2所示的10mL具塞比色管中， 然后再向具塞比色管中加入濃度為lmol/L的氫氧化鈉的甲醇溶液0.5mL，充分振蕩5min，再 將溶液置于圖3所示的40°C的恒溫攪拌水浴鍋中加熱lmin，進行皂化反應后得皂化反應溶 液；
[0060] (3)甲酯化反應:待步驟(2)制得的皂化反應溶液冷卻至室溫后，再向皂化反應溶 液中加入濃度為lmol/L的鹽酸的甲醇溶液lmL，充分振蕩5min，然后再置于40°C的恒溫攪拌 水浴鍋中加熱lmin，進行甲酯化反應后得甲酯化反應溶液;其反應溫和、迅速、高效，避免了 使用高溫熱源、回流方式，可以極大縮短前處理時間，提高效率；
[0061] (4)脫水處理:將步驟(3)制得的甲酯化反應溶液的下層水溶液去掉，將上層正己 烷層轉移至裝有無水硫酸鈉的如圖4所示的漏斗裝置中進行脫水處理后得脫水溶液；
[0062] (5)定容測試:再將步驟(4)制得的脫水溶液在圖5所示的旋轉蒸發(fā)儀上進行濃縮 并定容至〇.5mL，然后使用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀進行測定得出二十碳五烯酸甲酯和二十二 碳六烯酸甲酯的色譜峰譜圖，根據(jù)色譜峰譜圖分別進行二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸含 量的定性分析和定量測定，測定出二十碳五稀酸的含量為3g/kg，二十二碳六稀酸的含量為 llg/kg;與傳統(tǒng)的氣相色譜配備氫火焰離子化檢測器相比，可以克服其定性準確度低的缺 點，對目標物進行準確的檢測。
[0063] 實施例4:
[0064]本實施例按照與實施例1相同的檢測步驟進行，具體檢測步驟為：
[0065] (1)樣液配置:先在圖1所示的100ml的具塞容量瓶中稱取魚油樣品3g，再加入50mL 正己烷充分振蕩使其完全溶解得樣液，并記下正己烷定容的樣液刻度值;試劑使用量少，可 以降低實驗成本、減輕環(huán)境污染、減少人體傷害；
[0066] (2)皂化反應:取步驟（1)制得的樣液5mL轉移至圖2所示的10mL具塞比色管中，然 后再向具塞比色管中加入濃度為3mol/L的氫氧化鈉的甲醇溶液5mL，充分振蕩20min，再將 溶液置于圖3所示的80°C的恒溫攪拌水浴鍋中加熱2min，進行皂化反應后得皂化反應溶液； [0067] (3)甲酯化反應:待步驟(2)制得的皂化反應溶液冷卻至室溫后，再向皂化反應溶 液中加入濃度為3mol/L的鹽酸的甲醇溶液5mL，充分振蕩20min，然后再置于60°C的恒溫攪 拌水浴鍋中加熱5min，進行甲酯化反應后得甲酯化反應溶液;其反應溫和、迅速、高效，避免 了使用高溫熱源、回流方式，可以極大縮短前處理時間，提高效率；
[0068] (4)脫水處理:將步驟(3)制得的甲酯化反應溶液的下層水溶液去掉，將上層正己 烷層轉移至裝有無水硫酸鈉的如圖4所示的漏斗裝置中進行脫水處理后得脫水溶液；
[0069] (5)定容測試:再將步驟(4)制得的脫水溶液在圖5所示的旋轉蒸發(fā)儀上進行濃縮 并定容至3mL，然后使用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀進行測定得出二十碳五烯酸甲酯和二十二碳 六烯酸甲酯的色譜峰譜圖，根據(jù)色譜峰譜圖分別進行二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸含量 的定性分析和定量測定，測定出二十碳五稀酸的含量為17g/kg，二十二碳六稀酸的含量為 68g/kg;與傳統(tǒng)的氣相色譜配備氫火焰離子化檢測器相比，可以克服其定性準確度低的缺 點，對目標物進行準確的檢測。
【主權項】
1. 一種魚油產(chǎn)品中脂肪酸的檢測方法，其特征在于檢測方法包括樣液配置、皂化反應、 甲酯化反應、脫水處理和定容測試五個步驟，其具體檢測流程為： (1) 樣液配置:先在30-100ml的具塞容量瓶中稱取魚油樣品0.5-3g，再加入5-50mL正己 烷充分振蕩使其完全溶解得樣液，并記下正己烷定容的樣液刻度值； (2) 皂化反應:取樣液0.5-5mL轉移至10mL具塞比色管中，然后再向具塞比色管中加入 濃度為l_3mol/L的氫氧化鈉的甲醇溶液0.5-5mL，充分振蕩5-20min，再將溶液置于40-80°C 的恒溫攪拌水浴鍋中加熱l_2min，進行皂化反應后得皂化反應溶液； (3) 甲酯化反應：待皂化反應溶液冷卻至室溫后，再向皂化反應溶液中加入濃度為1-3mol/L的鹽酸的甲醇溶液l-5mL，充分振蕩5-20min，然后再置于40-60°C的恒溫攪拌水浴鍋 中加熱l_5min，進行甲酯化反應后得甲酯化反應溶液； (4) 脫水處理:將甲酯化反應溶液的下層水溶液去掉，將上層正己烷層轉移至裝有無水 硫酸鈉的漏斗裝置中進行脫水處理后得脫水溶液； (5) 定容測試:再將脫水溶液在旋轉蒸發(fā)儀上進行濃縮并定容至0.5-3mL，然后使用氣 相色譜-質譜聯(lián)用儀進行測定得出二十碳五烯酸甲酯和二十二碳六烯酸甲酯的色譜峰譜 圖，分別進行二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸含量的定性分析和定量測定： a. 定性分析:如果檢測出的二十碳五烯酸甲酯或二十二碳六烯酸甲酯的色譜峰的保留 時間與標準樣品溶液測得的色譜峰保留時間相一致，且選擇的離子均出現(xiàn)，并且所選擇的 離子豐度比與標準樣品的離子豐度比相一致，則可判斷樣品中存在二十碳五烯酸和二十二 碳六烯酸。其中二十碳五烯酸甲酯標準樣品的色譜峰保留時間為16.16min，定量離子為 227.00，參考離子為87.00、143.00、74.00;二十二碳六烯酸甲酯標準樣品的色譜峰保留時 間為16.16min，定量離子為264.00,參考離子為265.00、180.00、222.00。其中氣相色譜-質 譜聯(lián)用儀的使用條件為:色譜柱為VF-5ms (30m X 25mm X 25μπι)石英毛細管柱;色譜柱升溫程 序:先以60°C保持2min，然后以15°C/min的速率升溫至200°C并保持2min，再以2°C/min的速 率升溫至220°C，再以10°C/min的速率升溫至280°C并保持5min，再以10°C/min的速率升溫 至300 °C并保持5min;載氣采用純度2 99.999 %的氦氣，載氣流速為1.2mL/min;進樣口溫度 保持在260°C;進樣量為ΙμΜ進樣方式:不分流進樣，2min后打開分流閥和隔墊吹掃閥；電子 轟擊源的電子能量為70eV;離子源溫度為200°C;氣相色譜-質譜聯(lián)用儀的接口溫度為280 Γ。 b. 定量測定:采用外標法單離子定量測定，計算公式：式中： Xi-樣品中被測物i的殘留量，g/kg; Ai-樣品中被測物i的色譜峰面積； As-標準溶液中被測物i的色譜峰面積； Cs-標準溶液中被測物i的濃度，mg/L; V-樣品最終定容體積，mL; m-樣品稱樣量，g; Fi---被測物i與對應的脂肪酸的換算系數(shù)，二十碳五烯酸為0.962,二十二碳六烯 酸為0.963。 測定出二十碳五稀酸的含量為3~17g/kg，二十二碳六稀酸的含量為11~68g/kg。
【文檔編號】G01N30/06GK105866269SQ201610188814
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年3月29日
【發(fā)明人】趙健
【申請人】青島正方元信公共衛(wèi)生檢測有限公司