一種葉面鋅肥肥效的原位評價方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及葉面肥肥效評價技術，具體涉及一種葉面鋅肥肥效的原位評價方法。
【背景技術】
[0002]鋅是動植物和人體必需的微量營養(yǎng)元素，直接或間接參與生命體內(nèi)的代謝過程，在生命活動中起著極其重要的作用，被譽為“生命之花”、“智慧元素”。然而，我國缺鋅狀況十分嚴重，土壤缺鋅面積高達40%，嚴重影響了作物產(chǎn)量與品質(zhì)，直接或間接導致了人體對鋅的攝入不足，成為威脅人類健康尤其是兒童智力發(fā)育的重要限制因子。在解決人類對微量元素需求的途徑中，糧食作物微量元素的生物強化被認為是最有前景的途徑之一，因此，通過農(nóng)藝措施改善作物鋅營養(yǎng)狀況，對提高作物生產(chǎn)力和保障人體健康均具有非常重要的現(xiàn)實意義。
[0003]葉面施肥是公認的實現(xiàn)微量元素生物強化目標最直接、高效的農(nóng)藝措施之一，葉面鋅肥可以有效彌補土壤施鋅肥存在的易被土壤吸附固定、淋失、施用不均等局限性，補充作物鋅素營養(yǎng)、矯正作物缺鋅癥，提高作物產(chǎn)量品質(zhì)。作為土壤施肥的輔助措施，葉面肥已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中施用微量元素肥料的主導技術，顯示出明顯的效能優(yōu)勢和應用前景。
[0004]然而，葉面施鋅普遍存在著吸收難、轉運慢的問題，嚴重影響了葉面施鋅的作用效果和施用效率。葉面噴施的養(yǎng)分從葉表面滲透到葉片內(nèi)部后，其營養(yǎng)功效和生理有效性不僅取決于植物葉片細胞對養(yǎng)分的吸收利用，還與養(yǎng)分向其他部位的轉運與再利用能力相關。但是，迄今關于葉面噴施的鋅在植物葉片內(nèi)部如何被吸收利用、儲存與再轉運等關鍵機理仍知之甚少，如何促進鋅從葉片噴施部位向其他部位的轉運仍然是葉面鋅肥及其施用技術研發(fā)中的瓶頸。
[0005]可見，全面了解和闡明葉面鋅肥作用機理，不僅能為研發(fā)新型葉面鋅肥及其促效技術提供理論依據(jù)，而且是提高葉面鋅肥施用效率的關鍵所在。然而，長期以來，葉面噴施的鋅在植物體內(nèi)的追蹤和定位技術未能突破。傳統(tǒng)評價葉面肥的肥效技術，通常采用長期定位試驗方法，結合破壞性采樣等分析測試手段，費時長、見效慢，且由于易產(chǎn)生污染而常導致評價結果出現(xiàn)較大的偏差。同位素標記技術，雖可在一定程度上追蹤葉面噴施后鋅在植物中的吸收和轉運特征，但難以對進入到植物組織內(nèi)部的鋅進行細胞與亞細胞定位，不能原位解析鋅在植物體內(nèi)的吸收、運輸與再轉運機制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種葉面鋅肥肥效的原位評價方法，利用該方法能夠簡便高效地追蹤葉面噴施后，鋅在植物中的吸收和轉運特征，實現(xiàn)葉面鋅肥肥效的快速原位評價。
[0007]本發(fā)明所提供的技術方案為:
[0008]—種葉面鋅肥肥效的原位評價方法，包括如下步驟:
[0009]I)配制同位素68Zn標記液；
[0010]2)選取實驗植株中的待標記葉片，對待標記葉片的特定部位標記同位素68Zn標記液；
[0011]3)選定步驟2)中實驗植株的待測部位，所述的待測部位與特定部位沒有重合區(qū)域，對待測部位進行前置處理；
[0012]4)對步驟3)中經(jīng)過前置處理的待測部位進行μ-XRF原位分析、LA-1CPMS驗證分析、ICP-MS定量分析中的兩種或三種。
[0013]作為改進，所述的待標記葉片優(yōu)選成熟葉片;所述的待標記葉片的特定部位標記同位素68Zn標記液前，用去離子水清洗待標記葉片的上表皮和下表皮。
[0014]作為進一步改進，在所述的待標記葉片的特定部位標記同位素68Zn標記液前，在所述的待測部位用羊毛脂(Lanolin)涂抹并用Teflon膜包裹，避免待測部位受到同位素68Zn標記液的污染。
[0015]作為改進，所述的特定部位的同位素68Zn標記液的標記是通過粘貼含同位素68Zn標記液的濾紙或浸泡在同位素68Zn標記液中的兩種方式對特定部位進行標記。
[0016]作為優(yōu)選，所述的步驟2)中特定部位為待標記葉片的整個葉面，所述的步驟3)中待測部位為待標記葉片的葉柄以及實驗植株新生的新葉。
[0017]作為進一步優(yōu)選，所述的步驟3)中待測部位進行前置處理是指:將所述的待標記葉片的葉柄進行冷凍切片，然后冷凍干燥；另外分別將待標記葉片的葉柄和實驗植株新生的新葉烘干磨碎，進行三酸消煮。
[0018]作為優(yōu)選，所述的烘干磨碎，烘干溫度為60?70°C，時間為60?80h。
[0019]作為優(yōu)選，所述的步驟2)中特定部位為待標記葉片的局部葉面，所述的步驟3)中待測部位為待標記葉片的剩余葉面。
[0020]作為進一步優(yōu)選，所述的步驟3)中待測部位進行前置處理是指:將所述的待標記葉片的剩余葉面進行冷凍干燥。所述的冷凍干燥的溫度為-85?-75°C，時間為60?80h。[0021 ]作為優(yōu)選，所述的步驟I)中同位素68Zn標記液包括150?250mg L—1的ZnSO4水溶液，所述的ZnSO4水溶液中68Zn的摩爾比為5?15 %。作為改進，所述的同位素68Zn標記液還包括0.05?0.15%1%的表面活性劑5丨1?的L-77。表面活性劑用于降低同位素68Zn標記液的表面張力，提高同位素68Zn標記液在葉片表面的吸附量，增強葉面噴施效果。
[0022]作為優(yōu)選，所述的三酸消煮是指:將烘干磨碎后的樣品分散于三酸消煮液中，先進行常溫消煮，消煮溫度為20?28°C，時間為1.5?2.5h，再進行高溫消煮，消煮溫度為120?1400C，時間為4?6h;所述的三酸消煮液組成為:體積比為4.5?5.5:0.5?1.5:1的濃硝酸、高氯酸和氫氟酸的混合液。
[0023]作為優(yōu)選，所述的冷凍切片的溫度為-16?-20 °C，切片厚度為60?ΙΟΟμπι。溫度依據(jù)樣品的性質(zhì)可作適當調(diào)整，過低容易使樣品組織破碎，過高則組織冷凍硬度不夠，易導致切片不成型或出現(xiàn)褶皺。
[0024]作為優(yōu)選，所述的冷凍切片是指:將葉柄用OCT包埋劑包埋固定，置于冷凍切片機中進行切片。
[0025]作為優(yōu)選，所述的步驟4)中的μ-XRF原位分析、LA-1CPMS驗證分析和ICP-MS定量分析是指:將冷凍干燥后的樣品通過同步輻射熒光探針μ-XRF技術對樣品中鋅元素進行定位，同時利用激光刻蝕-電感耦合等離子體質(zhì)譜LA-1CPMS技術進一步定量分析樣品中68Zn的原位分布特征；利用電感耦合等離子體質(zhì)譜ICP-MS技術測定三酸消煮后液體樣品中的鋅含量。
[0026]上述同步輻射微熒光探針μ-XRF技術可原位無損分析生命體內(nèi)各金屬元素的分布特征和形態(tài)信息。新一代XRF技術檢測限可達ppm量級，空間分辨率為微米乃至納米級(Nano-XRF，Nano-XRF-CT)，可表征生命體中元素在亞細胞水平上的定位信息。
[0027]上述μ-XRF實驗條件優(yōu)選為:利用帶有諧波抑制的Si(220)雙晶單色儀使得入射光為單色光，利用Kirkpatrick-Baez顯微鏡聚集光斑，光斑大小為2μηι，樣品打點角度為45°，利用單通道渦流Si檢測儀檢測熒光信號；光斑步長及掃描時間依據(jù)樣品性質(zhì)可作適當調(diào)整。
[0028]上述激光燒蝕電感耦合等離子體質(zhì)譜LA-1CPMS技術是近幾年發(fā)展起來的生物組織樣品中元素成像技術，其可分析元素的同位素豐度，檢測限為亞ppm級，分辨率為ΙΟμπι。相較于XRF，LA-1CPMS優(yōu)勢在于靈敏度高，在分析低豐度樣品時有一定優(yōu)勢，但分辨率不如前者。
[0029]上述LA-1CPMS實驗條件優(yōu)選為:LA系統(tǒng)采用Nd: YAG激光器(波長213nm，重復頻率1Hz，激光參數(shù)設置為40%)，掃描光斑直徑為5μπι;植物樣品切片固定于樣品臺上，置于樣品室內(nèi)聚焦激光束按行掃描樣品，行與行之間的間隔設置為ΙΟμπι，灼燒后的樣品物質(zhì)由載氣氦氣和氫氣混合氣體送入ICP檢測離子強度。為了校正水分流失及樣品厚度對ICP的影響，需要同時檢測13C的離子強度，將13C作為內(nèi)標元素；用Ba和Rh標準樣品最優(yōu)化ICP-MS參數(shù)，并選取美國標準與技術研究院(NIST)的標準參比物作為參比物質(zhì)。
[0030]若無特殊說明，本發(fā)明中各溶液均采用超純水配制。
[0031]同現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在:
[0032]基于同位素示蹤與金屬組分析技術(y-XRF、LA-1CPMS、ICP_MS)，創(chuàng)建并優(yōu)化了葉面鋅肥肥效的原位評價方法，突破了傳統(tǒng)葉面肥肥效評價技術存在的耗時長、見效慢等技術瓶頸，率先在細胞水平上原位表征了植物體內(nèi)鋅的分布特征及其動態(tài)變化規(guī)律。
【附圖說明】
[0033]圖1為實施例1中同位素68Zn標記液標記示意圖；
[0034]圖2為實施例1中空白對照組的Zn元素的微區(qū)分布特征示意圖；
[0035]圖3為圖1中區(qū)域B的Zn元素的微區(qū)分布特征示意圖；
[0036]圖4為圖3中區(qū)域B進一步細掃的微區(qū)分布特征示意圖；
[0037]圖5為圖4進一步細掃的微區(qū)分布特征不意圖；
[0038]圖6為實施例1中LA-1CPMS定量分析待測葉片的鋅元素分布圖；
[0039]圖7為實施例2中同位素68Zn標記液標記示意圖；
[0040]圖8為實施例2中葉柄切片樣品的顯微組織圖；
[0041]圖9為實施例2中葉柄切片樣品的Zn元素的微區(qū)分布特征示意圖，ck為對照組，Zntreatments為實驗組；
[0042]圖10為實施例2中LA-1CPMS定量分析葉柄切片樣品的鋅元素分布圖；
[0043]圖11為實施例2中ICP-MS定量分析圖，ck為對照組，Zn為實驗組，Pet1le為葉柄切片樣品，New leaf為新生的新葉。
【具體實施方式】
[0044]實施例1
[0045]1、溶液配制
[0046]同位素68Zn標記液:4mL68Zn溶液(Isotec公司，Miamisburg，Oh1)，0.8g硫酸鋅，ImL Silwet L-77，溶于超純水中并定容至1L。
[0047]2、標記同位素68Zn標記液
[0048]用兩層塑料薄膜覆蓋住土壤表面，防止噴施同位素68Zn標記液時肥料滴入土壤中，再于塑料薄膜上覆蓋兩層吸水紙，用膠紙將塑料薄膜和吸水紙封嚴實，僅留出可供安裝滴灌的開口。
[0049]選取實驗植株為Prunus dulcis(Mill.)DAWebb品種杏樹，將完全展開的成熟葉片作為待標記葉片，用去離子水清洗葉片上表皮和下表皮，再用吸水紙輕輕吸干備用。
[0050 ] 將羊毛脂(Lano lin,Si gma公司)均勾地涂抹在所選待標記葉片的葉柄表面，并用Teflon膜小心將葉柄包裹完全。
[0051 ]將配置好的穩(wěn)定性同位素68Zn標記液轉移至5mL離心管中，用方形玻璃纖維濾紙蘸取同位素68Zn標記液后，貼于所選待標記葉片的特定部位A，如圖1所示，用保鮮膜將濾紙固定于該位置上進行穩(wěn)定性同位素68Zn標記液標記處理。
[0052]3、樣品制備
[0053]上述實驗植株處理7天后，輕輕取下玻璃纖維濾紙，于