利用單個發(fā)光粒子檢測的光分析裝置、光分析方法以及光分析用計算機(jī)程序的制作方法
【專利說明】利用單個發(fā)光粒子檢測的光分析裝置、光分析方法以及光分析用計算機(jī)程序
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種光分析技術(shù)，能夠使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)等能夠檢測來自溶液中的微小區(qū)域的光的光學(xué)系統(tǒng)，檢測來自分散或溶解在溶液中的原子、分子或它們的聚合體(以下將它們稱為“粒子”)、例如蛋白質(zhì)、肽、核酸、脂質(zhì)、糖鏈、氨基酸或它們的聚合體等生物體分子、病毒、細(xì)胞等粒子狀的對象物、或非生物學(xué)粒子的光，來獲取在分析或解析它們的狀態(tài)(相互作用、結(jié)合/離解狀態(tài)等)時有用的信息，更詳細(xì)地說，涉及一種能夠使用如上所述的光學(xué)系統(tǒng)逐個檢測來自單個發(fā)光的粒子的光并進(jìn)行各種光分析的光分析裝置、光分析方法以及光分析用計算機(jī)程序。此外，在本說明書中，發(fā)光的粒子(以下稱為“發(fā)光粒子”)可以是其自身發(fā)光的粒子、或附加了任意的發(fā)光標(biāo)識或發(fā)光探針的粒子，從發(fā)光粒子發(fā)出的光可以是熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、散射光等。
【背景技術(shù)】
[0002]由于近年來的光測量技術(shù)的發(fā)展，使用共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和還能夠進(jìn)行光子計數(shù)(單光子檢測)的超高靈敏度的光檢測技術(shù)，能夠檢測/測定單光子或熒光單分子水平的微弱光。因此，提出了各種使用這樣的微弱光的測量技術(shù)對生物體分子等的特性、分子間相互作用、或結(jié)合/離解反應(yīng)進(jìn)行檢測的光分析技術(shù)。作為這樣的光分析技術(shù)，例如已知有焚光相關(guān)光譜分析(Fluorescence Correlat1n Spectroscopy:FCS。例如參照專利文獻(xiàn)1_
3)、焚光強(qiáng)度分布分析(Fluorescence-1ntensity Distribut1n Analysis:FIDA。例如專利文獻(xiàn)4)、光子計數(shù)直方圖(Photon Counting Histogram:PCH。例如專利文獻(xiàn)5)等。另外，在專利文獻(xiàn)6?8中，提出了根據(jù)利用共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)測量出的樣本溶液的熒光信號的時間經(jīng)過來檢測熒光性物質(zhì)的方法。
[0003]并且，本申請的申請人在專利文獻(xiàn)9?12中提出了一種利用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)等能夠檢測來自溶液中的微小區(qū)域的光的光學(xué)系統(tǒng)的光分析技術(shù)，是基于與FCS、FIDA等光分析技術(shù)不同的原理的新的光分析技術(shù)。在所述新的光分析技術(shù)(以下稱為“掃描分子計數(shù)法”。)中，一邊使作為光的檢測區(qū)域的微小區(qū)域(以下稱為“光檢測區(qū)±或”。在使用激勵光的情況下，與激勵光的聚光區(qū)域大致一致。)的位置在樣本溶液內(nèi)移動、即一邊利用光檢測區(qū)域掃描樣本溶液內(nèi)，一邊逐個檢測在光檢測區(qū)域包含在樣本溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動的發(fā)光粒子時從該發(fā)光粒子發(fā)出的光，由此能夠?qū)颖救芤褐械陌l(fā)光粒子逐一進(jìn)行檢測，來獲取與發(fā)光粒子的計數(shù)、樣本溶液中的發(fā)光粒子的濃度或數(shù)密度有關(guān)的信息。
[0004]專利文獻(xiàn)I:日本特開2005-098876
[0005]專利文獻(xiàn)2:日本特開2008-292371
[0006]專利文獻(xiàn)3:日本特開2009-281831
[0007]專利文獻(xiàn)4:日本特許第4023523號
[0008]專利文獻(xiàn)5:國際公開2008-080417
[0009]專利文獻(xiàn)6:日本特開2007-20565
[0010]專利文獻(xiàn)7:日本特開2008-116440
[0011 ]專利文獻(xiàn)8:日本特開平4-337446號公報
[0012]專利文獻(xiàn)9:國際公開第2011/108369
[0013]專利文獻(xiàn)10:國際公開第2011/108370
[0014]專利文獻(xiàn)11:國際公開第2011/108371
[0015]專利文獻(xiàn)12:國際公開第2012/099234

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016]發(fā)明要解決的問題
[0017]另外，在檢測或分析溶液中的粒子的濃度或其它狀態(tài)(相互作用、結(jié)合/離解狀態(tài)等)時，粒子濃度的變化速度或粒子的相關(guān)反應(yīng)的反應(yīng)速度成為有用的信息。然而，在目前為止的掃描分子計數(shù)法中，在成為樣本溶液中的觀察對象的發(fā)光粒子的濃度隨時間變化的情況下，有時很難高精度地檢測所述發(fā)光粒子濃度或其變化速度。
[0018]如上述的文獻(xiàn)所記載的那樣，在目前為止的掃描分子計數(shù)法中，典型地，作為一個方式，在任意設(shè)定的測量時間內(nèi)一邊使光檢測區(qū)域在樣本溶液中移動一邊進(jìn)行光測量，對在所得到的按時間序列的光強(qiáng)度值的數(shù)據(jù)(時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù))中檢測出的發(fā)光粒子的信號進(jìn)行計數(shù)(專利文獻(xiàn)9?11)，或者，作為其它的方式，執(zhí)行一邊使光檢測區(qū)域在樣本溶液中移動一邊進(jìn)行的光測量以及時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的發(fā)光粒子的信號的檢測和計數(shù)，直到能夠得到任意設(shè)定的粒子的檢測數(shù)為止(專利文獻(xiàn)12)。而且，在前者的方式的情況下，基于所設(shè)定的測量時間內(nèi)的檢測數(shù)來估算發(fā)光粒子的濃度，在后者的情況下，基于檢測所設(shè)定的粒子數(shù)需要的測量時間來估算發(fā)光粒子的濃度。
[0019]然而，在成為觀察對象的發(fā)光粒子的濃度未知的情況下或隨時間變化的情況下，在固定的測量時間內(nèi)執(zhí)行光測量或執(zhí)行光測量直到固定檢測數(shù)為止的方式中，依賴于所設(shè)定的測量時間或信號檢測數(shù)，有時對于基于檢測結(jié)果估算出的濃度值或變化速度無法獲得充分的精度。
[0020]例如圖9所示，在固定的測量時間內(nèi)進(jìn)行光測量的方式中，在所設(shè)定的測量時間比較短時(Tl)，對于濃度的增加快的發(fā)光粒子(A、B、C)，由于濃度變得足夠高，因此能夠檢測，但是對于濃度的增加慢的發(fā)光粒子(D)，濃度過低而可能很難檢測。因此，如果將測量時間設(shè)定得比較長(T2)，則濃度的增加慢的發(fā)光粒子(D)的濃度增大至可檢測的水平，但是導(dǎo)致對濃度的增加快的發(fā)光粒子在超過需要的長時間內(nèi)執(zhí)行光測量。另外，在濃度的增加特別快的發(fā)光粒子(A、B)的情況下，由于濃度增加達(dá)到了飽和狀態(tài)，因此無法捕捉發(fā)光粒子濃度的時間變化。另一方面，在進(jìn)行光測量直到能夠獲得固定的檢測數(shù)為止的方式中，在所設(shè)定的檢測數(shù)比較大時(Pl)，對于濃度的增加快的發(fā)光粒子(A、B、C)，能夠以比較短的時間完成測量，但是對于濃度的增加慢的發(fā)光粒子(D)，檢測需要的測量時間可能非常長。因此，在減少所設(shè)定的檢測數(shù)時(P2)，對于濃度的增加慢的發(fā)光粒子(D)，檢測需要的測量時間非常長從而能夠獲得有意義的值，但是對于濃度的增加快的發(fā)光粒子(A、B、C)，檢測需要的測量時間過短而可能難以高精度地獲得值。另外，對于濃度的增加慢的發(fā)光粒子(D)與濃度的增加快的發(fā)光粒子(A、B、C)的濃度變化速度的差異，由于檢測需要的測量時間的差為非常大的值而能夠有意義地檢測，但是對于濃度的增加快的發(fā)光粒子(A、B、C)之間的濃度變化速度，檢測需要的測量時間過短而難以高精度地檢測其差異。
[0021]S卩，在掃描分子計數(shù)法中如上述那樣在固定的測量時間內(nèi)執(zhí)行光測量或執(zhí)行光測量直到固定檢測數(shù)為止的情況下，期望在某種程度上預(yù)測成為觀測對象的發(fā)光粒子的濃度來預(yù)先設(shè)定適當(dāng)長度的測量時間或適當(dāng)大小的信號檢測數(shù)，但是在發(fā)光粒子濃度變化的系統(tǒng)中，難以設(shè)定適當(dāng)?shù)臏y量時間或信號檢測數(shù)來進(jìn)行濃度的檢測，并且，也難以檢測濃度變化速度或反應(yīng)速度。另外，在光測量的執(zhí)行中濃度變化速度或反應(yīng)速度發(fā)生變化的發(fā)光粒子的情況下，在固定的測量時間內(nèi)執(zhí)行光測量或執(zhí)行光測量直到固定檢測數(shù)為止的方式中，更難高精度地檢測發(fā)光粒子的濃度或其變化。
[0022]這樣，本發(fā)明的主要課題在于提供一種在成為觀測對象的發(fā)光粒子的濃度隨時間變化的情況下也能夠進(jìn)行發(fā)光粒子濃度的估算或者濃度變化速度或反應(yīng)速度的檢測的基于掃描分子計數(shù)法的新的光分析技術(shù)。
[0023]用于解決問題的方案
[0024]根據(jù)本發(fā)明的一個方式，通過以下的裝置來達(dá)成上述的課題，該裝置是使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)來檢測來自在樣本溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動的發(fā)光粒子的光的光分析裝置，該光分析裝置包括:光檢測區(qū)域移動部，其使顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動;光檢測部，其檢測來自光檢測區(qū)域的光；以及信號處理部，其生成一邊使光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動一邊由光檢測部檢測出的來自光檢測區(qū)域的光的按時間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，在按時間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中逐個檢測各個發(fā)光粒子的信號，其中，信號處理部沿著按時間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的時間的經(jīng)過，在按時間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中依次測量所檢測出的發(fā)光粒子的信號的產(chǎn)生時間的間隔，使用依次測量出的多個信號產(chǎn)生時間間隔來確定表示發(fā)光粒子的濃度的指標(biāo)值。
[0025]在所述結(jié)構(gòu)中，“在樣本溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動的發(fā)光粒子”是指在樣本溶液中分散或溶解的原子、分子或它們的聚合體等發(fā)出光的粒子，只要是不固定在基板等上而自由地在溶液中進(jìn)行布朗運(yùn)動的粒子，則可以是任意的粒子。所述發(fā)光粒子典型的是熒光性粒子，但也可以是通過磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、光散射等來發(fā)出光的粒子。另外，特別地，在本發(fā)明中設(shè)為觀察對象的發(fā)光粒子也可以是濃度隨著時間的經(jīng)過而發(fā)生變化的粒子。共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的“光檢測區(qū)域”是指這些顯微鏡中檢測光的微小區(qū)域，在從物鏡提供照明光的情況下，相當(dāng)于該照明光會聚到的區(qū)域(在共焦顯微鏡中，特別地根據(jù)物鏡和針孔之間的位置關(guān)系來確定。在發(fā)光粒子是沒有照明光而發(fā)光的情況下，例如通過化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光來發(fā)光的粒子的情況下，在顯微鏡中不需要照明光。)。另外，典型的是，光檢測部通過對每隔規(guī)定的測量單位時間(BIN ??ΜΕ)來到的光子數(shù)進(jìn)行計數(shù)的光子計數(shù)，檢測來自光檢測區(qū)域的光，在該情況下，按時間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)為按時間序列的光子計數(shù)數(shù)據(jù)。此外，在本說明書中，在稱為“發(fā)光粒子的信號”的情況下，只要沒有特別限定，是指表示來自發(fā)光粒子的光的信號。
[0026]如從上述理解的那樣，在作為本發(fā)明的基本結(jié)構(gòu)的掃描分子計數(shù)法中，首先，一邊使光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動、即一邊通過光檢測區(qū)域掃描樣本溶液內(nèi)，一邊依次進(jìn)行光的檢測。這樣，在樣本溶液內(nèi)移動的光檢測區(qū)域包含了隨機(jī)運(yùn)動的發(fā)光粒子時，檢測到來自發(fā)光粒子的光，由此，檢測出一個發(fā)光粒子的存在。因而，在依次檢測出的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中逐個檢測來自發(fā)光粒子的光的信號，由此逐個地逐一依次檢測粒子的存在，能夠獲取與粒子在溶液內(nèi)的狀態(tài)有關(guān)的各種信息。在所述結(jié)構(gòu)中，關(guān)于在按時間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中依次檢測出的發(fā)光粒子的信號，如在后面更詳細(xì)地說明的那樣，樣本溶液內(nèi)的發(fā)光粒子的在此時的濃度越高，依次產(chǎn)生的發(fā)光粒子的信號的產(chǎn)生時間的間隔越短。即，當(dāng)在光測量的執(zhí)行中樣本溶液內(nèi)的發(fā)光粒子的濃度發(fā)生變化時，與其對應(yīng)地，發(fā)光粒子的信號的產(chǎn)生時間的間隔發(fā)生變化。因此，在上述的本發(fā)明中，進(jìn)一步在信號處理部中，沿著按時間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的時間的經(jīng)過，在按時間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中依次測量所檢測出的發(fā)光粒子的信號的產(chǎn)生時間的間隔，使用依次測量出的多個信號產(chǎn)生時間間隔來確定表示發(fā)光粒子的濃度的指標(biāo)