人抗苗勒氏管激素膠體金免疫層析檢測試劑盒及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及膠體金免疫層析快速檢測領(lǐng)域，具體涉及一種人抗苗勒氏管激素膠體金免疫層析檢測試劑盒及方法。
【背景技術(shù)】
[0002]抗苗勒氏管激素(AMH)作為一種新型的評估女性卵巢功能的指標，相比于濾泡刺激素(FSH)水平、抑制素B(INH)水平和宼卵泡的數(shù)目等傳統(tǒng)的評價女性卵巢功能的指標，AMH在檢測者月經(jīng)周期中保持恒定，血清AMH的水平不會隨著性腺激素的波動而變化，因此AMH的檢測不受女性月經(jīng)周期的制約，可以隨時檢測，解決了目前婦產(chǎn)生殖科面臨的主要問題之一。AMH是一種由兩個相同的70KD亞基通過二硫鍵形成的二聚體糖蛋白，AMH在女性體內(nèi)由卵巢中顆粒細胞直接分泌，是女性早期卵泡的直接產(chǎn)物，濃度最高為竇腔小卵泡和竇前卵泡時期，而在大卵泡時期，AMH的表達逐漸下降。苗勒氏管作為輸卵管、子宮和大部分陰道的起源，AMH在女性中持續(xù)存在，其濃度水平可以反映整個生命周期中卵泡的活性，可明確得知卵巢的儲存量。女性隨著年齡的增加，卵巢功能下降，血清AMH水平也逐漸下降，AMH被認為是最早揭示這一生理現(xiàn)象的指標，現(xiàn)今已成為一項預(yù)測女性卵巢儲備能力的重要指標。大量研究表明，血清AMH濃度水平檢測，除了預(yù)測女性生殖能力，輔助女性規(guī)劃生殖的作用以外，還有助于提高輔助生殖技術(shù)中促排卵方案的成本效益，并與體外授精聯(lián)合胚胎移植技術(shù)中的臨床妊娠率和活產(chǎn)率息息相關(guān)。
[0003]根據(jù)上述這些優(yōu)勢，歐美國家近年來臨床上逐步開始使用AMH血清濃度水平來評估女性的卵巢功能。常規(guī)的歐美檢測方法為酶聯(lián)免疫檢測AMH試劑盒的方法，但其耗時長、靈敏度低、背景值高、易造成假陽性和假陰性結(jié)果，并且需要專業(yè)人員進行實驗操作。因此目前逐步用化學(xué)發(fā)光等方法替代，但是這類方法，譬如羅氏的ELECSYS AMH檢測儀等，仍為非開放系統(tǒng)，價格昂貴，且需要專門培訓(xùn)儀器使用人員，維修及檢測成本均高，并不適于推廣使用。上述均為歐美國家主要的檢測AMH的方法，目前我國國內(nèi)并無自主知識產(chǎn)權(quán)的檢測AMH的試劑盒，主要均依賴進口，而進口的這些試劑價格昂貴，均需要專業(yè)技術(shù)人員進行操作，檢測復(fù)雜費時，不利于AMH檢測在國內(nèi)的廣泛開展。
[0004]目前我國已開放二胎政策，且體外授精等技術(shù)在我國得到一定的推廣，因此需要判定卵巢水平并進行備孕的女性數(shù)量激增，然而我國尚無自主知識產(chǎn)權(quán)的AMH臨床診斷試劑盒，目前主流使用的AMH檢測試劑盒主要依賴于進口，并不適合于推廣使用。膠體金免疫層析法是一種對復(fù)雜樣品中目標物質(zhì)進行檢測的固相免疫分析方法，其主要原理如下:利用膠體金標記一種抗體或者抗原，與目標物質(zhì)反應(yīng)形成復(fù)合物，由于毛細管作用在固相層析膜上涌動，被檢測線上的抗體或者抗原捕獲，形成肉眼可見的T線。一定條件下，T線信號強弱與目標物質(zhì)濃度正相關(guān)，將膠體金免疫層析檢測試紙條聯(lián)合膠體金讀取儀的方法，根據(jù)反射光度法原理，可以快速、準確、簡單的對相關(guān)物質(zhì)進行定量或者半定量檢測，目前已廣泛應(yīng)用于HCG、MAU等人體代謝物的定量檢測，成為一種主流的即時檢驗(Point-of-caretest ing，P0CT)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種人抗苗勒氏管激素膠體金免疫層析檢測試劑盒及方法，由此快速即時檢測卵巢功能，通過膠體金免疫層析定量檢測的方法，檢測女性血清中AMH的濃度，從而用于評估女性卵巢中卵子的活性以及儲存量，準確，快速，靈敏度高，無需專業(yè)人員操作，成本較低，便于推廣使用。
[0006]為達到上述目的，本發(fā)明采用第一技術(shù)方案:一種人抗苗勒氏管激素膠體金免疫層析檢測試劑盒，其包括:試劑卡殼、設(shè)置在試劑卡殼內(nèi)的底板、設(shè)置在底板一端的樣本墊、一端與樣本墊抵靠接觸的膠金墊、一端與膠金墊另一端抵靠接觸的檢測墊、以及與檢測墊另一端接觸的吸收墊，其中膠金墊上包含膠體金納米顆粒以及結(jié)合了鼠抗人AMH的第一抗體，而檢測墊上分布了不重合的檢測線和質(zhì)控線，其中檢測線上包含了鼠抗人AMH的第二抗體，質(zhì)控線上包含了抗第一抗體的第三抗體。
[0007]在第一技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，進一步包括如下附屬技術(shù)方案:
[0008]所述第二抗體為只有在有AMH存在的情況下才和AMH及第一抗體特異性結(jié)合，而第三抗體在任何情況下都能和第一抗體結(jié)合。
[0009]所述樣本墊和膠金墊至少部分重疊，而膠金墊和檢測墊至少部分重合。
[0010]所述膠體金粒徑為lO-lOOnm，且膠體金顆粒的制備使用恒溫回流加熱法，優(yōu)選采用油浴恒溫回流加熱的制備方法，粒徑均一穩(wěn)定，大小可控。
[0011 ]其還包含膠體金讀取儀，且膠體金讀取儀的光密度掃描波長在450-550nm之間。
[0012]所述檢測線靠近膠金墊一端，所述質(zhì)控線靠近吸收墊一端，所述檢測線和質(zhì)控線相隔距離在0.5-1.5cm之間。
[0013]所述卡殼包括相互匹配并扣合的上下半卡殼，所述卡殼具有加樣孔和觀察孔，加樣孔位于膠金墊和樣本墊處并局部裸露樣本墊，而觀察孔位于檢測墊上方并裸露檢測線和質(zhì)控線。即加樣孔在卡殼上方有一定開口可以暴露出樣本墊，而卡殼的觀察孔位于檢測墊上方有一定開口可暴露出檢測線和質(zhì)控線。
[0014]進一步的，女性血清樣本加樣15min后，膠體金免疫層析試劑盒結(jié)合膠體金讀取儀檢測血清樣本中含有的AMH的濃度水平。
[0015]進一步的，所述膠體金讀取儀采用膠體金免疫層析定量讀取儀，屬于一種由光、機、電組成的精密儀器，掃描讀取檢測線和質(zhì)控線的信號強度值，將信號強度值通過光電及模/數(shù)轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)為數(shù)字信號，內(nèi)置優(yōu)化好的AMH光度-濃度標準曲線，數(shù)字信號在標準曲線中計算后，獲得所檢測得到的濃度值。所述膠體金讀取儀掃描檢測線與質(zhì)控線時，吸收光掃描范圍根據(jù)膠體金粒徑大小，光密度掃描波長在450-550nm之間。
[0016]進一步的，所述AMH濃度-光度標準曲線，采用60歲以上婦女血清做陰性血清，人AMH抗原標準品購買自可溯源的商業(yè)化抗原，使用陰性血清做稀釋液混合AMH標準品測定膠體金免疫層析試紙條檢測線信號值，并根據(jù)信號值與濃度關(guān)系繪制光度-濃度標準曲線。
[0017]進一步的，分別調(diào)整反應(yīng)中所述的第一抗體標記到ImL膠體金上的方法，pH值6-9之間、第一抗體蛋白量位5_15yg、BSA添加量為l-10mg、PEG添加量為l-10mg，分別調(diào)整了檢測線上第二抗體的濃度，質(zhì)控線上第三抗體的濃度，并調(diào)整金標第一抗體在膠金墊上的用量。
[0018]進一步的，其還包括抗體稀釋液:0.0lM的磷酸緩沖溶液;膠金墊處理緩沖溶液:pH8.5,0.1M且含I % BSA (牛血清白蛋白)，0.5 %的Tween-20 (吐溫20)的Tris-HCl (三氨基甲烷-鹽酸)緩沖溶液;AMH標準品稀釋液:65歲以上女性陰性血清樣品。
[0019]為達到上述目的，本發(fā)明采用第二技術(shù)方案:一種人抗苗勒氏管激素膠體金免疫層析檢測試劑盒的方法，其包括:
[°02°] S1、制備膠體金納米顆粒步驟；
[0021 ] S2、膠體金標記抗人AMH抗體的制備步驟；
[0022]S3、膠金墊的處理步驟；
[0023]S4、樣本墊的制備步驟；
[0024]S5、檢測墊上檢測線及質(zhì)控線的包被步驟；
[0025]S6、人AMH膠體金免疫層析定量檢測試劑盒的組裝步驟。
[0026]在第二技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，進一步包括如下附屬技術(shù)方案:
[0027]S1、制備膠體金納米顆粒步驟:將氯金酸溶液還原成粒