度點；分別取50、25、5yL的第三個濃度點分別定容至200yL，得到其它3個校 準(zhǔn)濃度點，這六個濃度點體積均為200yL。接著向其中各加入10yLlyg/mL同位素內(nèi)標(biāo)液B， 再加入400yL乙腈，然后禍旋數(shù)秒后振蕩lOmin，14000r/min離心5min后取50yL上清液，再加 入50yL去離子水，混勻后移入色譜瓶中上樣進(jìn)行LC-MS/MS分析。
[0050] 2)唾液樣品前處理:取200yL唾液于1.5mL離心管中，向其中加入10yLlyg/mL內(nèi)標(biāo) 液B，再加入400yL乙腈，然后禍旋數(shù)秒后振蕩lOmin，14000r/min離心5min后取50yL上清液， 再加入50yL去離子水，混勻后移入色譜瓶中上樣進(jìn)行LC-MS/MS分析。
[0051]3)質(zhì)控品前處理:分別取質(zhì)控品溶液QC(L)，QC(M)，QC(Η)各200yL于1.5mL離心管 中，然后跟唾液樣品前處理方法一致，此處不再贅述。
[0052]分析試劑盒中各組分見表3。
[0053]表3尼古丁及其代謝物分析試劑盒組分的制備
[0054]
[0055]注:本發(fā)明所述的非吸煙者唾液是非主動吸煙者且非被動吸煙者的唾液，該非吸 煙者唾液未經(jīng)前處理，購買試劑盒后可自行按照說明與待測唾液樣本同步進(jìn)行前處理。 [0056] 3、方法的建立與優(yōu)化
[0057]為了達(dá)到更高的穩(wěn)定性和靈敏度，實驗采用MRM模式同時監(jiān)測尼古丁、可替寧、3-羥基可替寧以及d3-可替寧的離子對（Q1/Q3)，使用"Ramp"對不同離子對的去簇電壓 (declusteringpotential，DP)、碰撞電壓（collisionenergy，CE)和碰撞池出 口電壓 (collisioncellexitpotential，CXP)等條件進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化，從優(yōu)化色譜圖中即可得到 離子最高信號強(qiáng)度所對應(yīng)的最佳結(jié)果，記錄優(yōu)化結(jié)果見表4。此外，其它一些參數(shù)如IS、CAD、 CUR、GS1和GS2等根據(jù)儀器提供的參考值范圍選擇合適的數(shù)值，以保證穩(wěn)定的信號強(qiáng)度。
[0058]表4尼古丁及其代謝物質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化結(jié)果
[0061] 4、方法驗證
[0059]
[0060]
[0062]a.選擇離子流圖：尼古丁及其代謝物的標(biāo)準(zhǔn)品和吸煙者唾液樣品的選擇離子流色 譜圖(XIC)如下圖所示，圖1中尼古丁、可替寧和3-0H可替寧的濃度均為5.0ng/mL，完全無雜 峰干擾，說明在此條件下能夠得到良好的檢測。圖2和圖3分別為非吸煙者和吸煙者唾液中 尼古丁、可替寧和3-0H可替寧的XIC譜圖，由于吸煙者唾液復(fù)雜基質(zhì)的干擾，使得譜圖中的 峰型對稱性不佳，但不會影響LC-MS/MS的檢測。
[0063]b.校準(zhǔn)曲線:采用同位素內(nèi)標(biāo)定量法，利用Analyst軟件以標(biāo)準(zhǔn)物與內(nèi)標(biāo)物的濃度 比為X軸，標(biāo)準(zhǔn)物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比為Y軸，建立校準(zhǔn)曲線，并計算出唾液中待測物的濃度。3 種分析物在各自濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)在〇. 998以上，滿足定量要求，見表5。同時， 試劑盒也考察了這3種分析物在信噪比S/N2 10時的最低定量限（LL0Q)，可低至0.5ng/mL， 完全可以滿足吸煙者唾液樣本中尼古丁及其代謝物的檢測需求。
[0064]表5尼古丁及其代謝物線性系數(shù)和最低定量限
[0065]
[0066] c.精密度試驗:取正常人唾液樣品一天內(nèi)重復(fù)處理6次，以同位素內(nèi)標(biāo)法定量測定 3種物質(zhì)的濃度，得出批內(nèi)精密度為5.0%~8.41 % (見表6) ;6個標(biāo)本分3日按照相同的方法 處理并測定，計算得到批間精密度為6.16%~10.65% (見表7)。
[0067]表6批內(nèi)精密度試驗結(jié)果
[0068]
[0069]
[0070] 表7批間精密度試驗結(jié)果
[0071]
[0072] 本試劑盒采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(HPLC-MS/MS)可同時測定人體唾液尼 古丁及其代謝物可替寧和3-羥基可替寧。目前，用于測定尼古丁及其代謝物的方法較多，如 免疫法、比色法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，大多用于研究尿 液或血液中的尼古丁及其代謝物，而唾液檢測相對較少，而且免疫法可能存在交叉反應(yīng)的 干擾。其中GC-MS準(zhǔn)確性較高，但該方法基本都需要對樣品進(jìn)行衍生化處理，操作過于繁瑣， 而且靈敏度較低。而LC-MS/MS是同時針對目標(biāo)物的出峰時間和離子對進(jìn)行檢測，靈敏度高， 極大的避免了交叉反應(yīng)的干擾。本試劑盒采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量，選擇氘代可替寧作為3種 物質(zhì)共用的內(nèi)標(biāo)，不但節(jié)省了成本，而且可減少基體的干擾，不受預(yù)處理過程、上樣體積和 流動相等條件的影響，能夠達(dá)到準(zhǔn)確定量。而且靈敏度高，最低定量限可達(dá)到〇.5ng/mL，完 全可以滿足吸煙者唾液樣本中尼古丁及其代謝物的檢測需求。
[0073]本試劑盒還考察了方法的精密度，日內(nèi)精密度為5.0%~8.41%，日間精密度為 6.16%~10.65%(可接受標(biāo)準(zhǔn)為CV< 15 % )，因此該試劑盒穩(wěn)定性良好。
[0074]總之，該試劑盒靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確且前處理過程簡單，5min之內(nèi)可完成分 離和檢測，精密度和穩(wěn)定性滿足要求，而且唾液樣本采集方便且無創(chuàng)傷性，可用于評估吸 煙、戒煙行為以及環(huán)境煙氣暴露程度研究。
【主權(quán)項】
1. 一種LC-MS/MS檢測唾液中尼古丁及其代謝物的方法，其特征在于， 所述的代謝物為可替寧和3-羥基可替寧； 利用LC-MS/MS分別檢測標(biāo)準(zhǔn)品溶液和經(jīng)過預(yù)處理的唾液樣品，利用同位素內(nèi)標(biāo)定量 法，以標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物的濃度比為X軸，標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物峰面積比為Y軸，建立校準(zhǔn)曲線，并 計算出唾液中尼古丁及其代謝物的濃度，具體色譜條件為： (1) 色譜條件： 流動相A: 0.1 % v/v甲酸水溶液； 流動相Β:0.1%v/v甲酸的甲醇溶液； 色譜柱型號:Ultimate Si02,2.1 X 100mm，3ym; 流速為 〇.2mL/min; 柱溫為35°C; 進(jìn)樣體積為I OyL; 采用梯度洗脫的方式，見表1; 表1流動相梯度洗脫參數(shù)(2) 質(zhì)譜條件： 在電噴霧電離正離子檢測模式下，采用多反應(yīng)監(jiān)測的質(zhì)譜掃描模式；噴霧電壓為 5500V;碰撞氣為Medium;氣簾氣為40kPa;離子源霧化氣和加熱輔助氣均為60kPa;去溶劑溫 度為550°C。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的LC-MS/MS檢測唾液中尼古丁及其代謝物的方法，其特征在于， 所述的標(biāo)準(zhǔn)品溶液按照如下方法制備得到： 分別準(zhǔn)確稱取10.0 mg尼古丁、可替寧和3-羥基可替寧，分別加入ImL甲醇溶解，配制成 濃度均為10.〇mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品母液;分別從以上標(biāo)準(zhǔn)品母液中移取IOOyL用甲醇定容至lmL， 稀釋到濃度為1.0 mg/mL，然后再用甲醇將這3種標(biāo)準(zhǔn)品的濃度由1.0 mg/mL逐級稀釋至IOyg/ mL;接著分別取ImL濃度為lOyg/mL的尼古丁、可替寧和3-羥基可替寧加入到15mL離心管中， 再加去離子水定容到IOmU得到尼古丁、可替寧和3-羥基可替寧的濃度均為1.0yg/mL的混 合標(biāo)準(zhǔn)液A; 準(zhǔn)確稱取I〇. Omg氘代可替寧內(nèi)標(biāo)品，加入IOmL甲醇溶解，得到濃度為1.0 mg/mL的內(nèi)標(biāo) 溶液;然后再用甲醇將內(nèi)標(biāo)溶液的濃度由1.0 mg/mL稀釋至1.0 yg/mL，得到內(nèi)標(biāo)液B; 移取IOOyL混合標(biāo)準(zhǔn)液A于1.5mL離心管中，向其中加入IOOyL空白唾液基質(zhì)作為第一個 高值濃度點；移取20yL混合標(biāo)準(zhǔn)液A用空白唾液基質(zhì)定容至200yL得到第二個濃度點;接著， 移取IOyL混合標(biāo)準(zhǔn)液A用空白唾液基質(zhì)定容至500yL，取200yL作為第三個濃度點；分別取 50、25、5yL的第三個濃度點分別定容至200yL，得到其它3個校準(zhǔn)濃度點，這六個濃度點體積 均為200yL;接著向其中各加入IOyL lyg/mL同位素內(nèi)標(biāo)液B，再加入400yL乙腈，然后渦旋數(shù) 秒后振蕩lOmin，14000r/min離心5min后取50yL上清液，再加入50yL去離子水，混勾后即得 標(biāo)準(zhǔn)品溶液。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的LC-MS/MS檢測唾液中尼古丁及其代謝物的方法，其特征在于， 所述的空白唾液基質(zhì)為非吸煙者的唾液基質(zhì)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的LC-MS/MS檢測唾液中尼古丁及其代謝物的方法，其特征在于， 所述的唾液樣品按如下方法預(yù)處理得到：取200yL唾液于1.5mL離心管中，向其中加入IOyL lyg/mL內(nèi)標(biāo)液B，再加入400yL乙腈，然后禍旋數(shù)秒后振蕩IOmin，14000r/min離心5min后取 50yL上清液，再加入50yL去離子水，混勻后即得唾液樣品。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的LC-MS/MS檢測唾液中尼古丁及其代謝物的方法，其特征在于， 所述的內(nèi)標(biāo)液B按如下方法制備得到:準(zhǔn)確稱取10.Omg氘代可替寧內(nèi)標(biāo)品，加入IOmL甲醇溶 解，得到濃度為1.0 mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液;然后再用甲醇將內(nèi)標(biāo)溶液的濃度由1.0 mg/mL稀釋至 1.0 yg/mL，得到內(nèi)標(biāo)液B。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種LC-MS/MS檢測唾液中尼古丁及其代謝物的方法，所述的代謝物為可替寧和3-羥基可替寧；利用LC-MS/MS分別檢測標(biāo)準(zhǔn)品溶液和經(jīng)過預(yù)處理的唾液樣品，利用同位素內(nèi)標(biāo)定量法，以標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物的濃度比為X軸，標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物峰面積比為Y軸，建立校準(zhǔn)曲線，并計算出唾液中尼古丁及其代謝物的濃度。本發(fā)明方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確且前處理過程簡單，5min之內(nèi)可完成分離和檢測，精密度和穩(wěn)定性滿足要求，而且唾液樣本采集方便且無創(chuàng)傷性，可用于評估吸煙、戒煙行為以及環(huán)境煙氣暴露程度研究。
【IPC分類】G01N30/06, G01N30/02
【公開號】CN105424832
【申請?zhí)枴緾N201510769512
【發(fā)明人】周亞飛, 于嘉屏
【申請人】上海迪安醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2015年11月12日