二對甲苯磺酸緣生替尼原料藥中有效成分的定量檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及化學(xué)分析技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及二對甲苯磺酸緣生替尼原料藥中有效成 分的定量檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] (N- (3-氯代-4- (3-氟代芐氧基）苯基）-6- (3- (4-甲基-4-氧基-1-氮-4-磷雜 環(huán)己烷-1-基）丙-1-炔基）喹唑啉-4-胺，雙4-甲基苯磺酸鹽），又名二對甲苯磺酸緣 生替尼，是近年來研發(fā)出的I型受體蛋白激酶抑制劑的包含磷取代的新喹唑啉衍生物，可 用于治療哺乳動物中與蛋白激酶活性異常相關(guān)的疾病，如癌癥或炎癥。其結(jié)構(gòu)式如式I所 示：
[0003]
[0004] 二對甲苯磺酸緣生替尼作為一種新研發(fā)出的藥物，為了保證其質(zhì)量及用藥的安全 性，在生產(chǎn)和使用的過程中，都需要對原料藥中的有效成分含量、有關(guān)物質(zhì)種類及含量、殘 留溶劑、微生物情況進行檢測和分析。目前采用中國藥典附錄收載的通用方法對上述指標 進行檢測。然而，中國藥典中記載的方法為通用方法，其專屬性不強，容易造成精密度和靈 敏性的降低。因此，進一步開發(fā)精密度、靈敏度、專屬性強的二對甲苯磺酸緣生替尼原料藥 中二對甲苯磺酸緣生替尼的含量測定方法十分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種精密度、靈敏度、專屬性強的二 對甲苯磺酸緣生替尼原料藥中有效成分的定量檢測方法。
[0006] 本發(fā)明提供的二對甲苯磺酸緣生替尼原料藥中有效成分的定量檢測方法為，將二 對甲苯磺酸緣生替尼原料藥溶解，以甲醇水溶液為流動相，以高效液相色譜檢測獲得色譜 圖，根據(jù)色譜圖獲得二對甲苯磺酸緣生替尼原料藥中有效成分的含量。
[0007] 利用高效液相色譜（HPLC)對物質(zhì)進行定量檢測是目前常用的檢測方法，在面對 需要對二對甲苯磺酸緣生替尼原料藥中有效成分的含量進行定量分析時，采用高效液相色 譜是一種快速有效的方式。但是，現(xiàn)有技術(shù)中，并沒有報道如何采用HPLC對二對甲苯磺酸 緣生替尼進行定量檢測，而當采用HPLC對一種新的物質(zhì)進行檢測時需要對該方法進行系 統(tǒng)適用性、專屬性、精密度、耐用性等多方面的鑒定，具體標準為：
[0008] 系統(tǒng)適用性：二對甲苯磺酸緣生替尼標準溶液連續(xù)進樣6針主峰面積 RSD^ 2. 0%；
[0009] 專屬性：在酸、堿、氧化、高溫、光照降解試驗的圖譜中，主峰的純度因子應(yīng)大于閾 值。
[0010] 耐用性：主要考慮溶液穩(wěn)定性：供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定，并且要求檢測條件的微 小變化對主峰含量的測定影響不大，分離度、理論塔板數(shù)均符合要求。
[0011] 重復(fù)性：配制6個供試品溶液，每個溶液進2針，用對照品溶液計算主成份含量，要 求6個結(jié)果的RSD不得大于2. 0%。
[0012] 中間精密度：由不同分析員，使用不同的儀器，在不同日期對同一批樣品進行檢 測。要求6份樣品的測定結(jié)果RSD不得大于2.0%。
[0013] 另外，要求樣品線性及范圍回歸系數(shù)r多0.999;檢測范圍至少在進樣濃度的 80%~120%的范圍內(nèi)。
[0014] 液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質(zhì)量交換而達到分離的目的，因此要 求流動相對樣品具有一定的溶解能力且與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，其黏度要盡量小，以便得 到好的分離效果；且流動相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應(yīng)。如使用紫外檢測器，則應(yīng) 使用對紫外吸收較低的溶劑配制。其沸點不可以太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實驗無法進 行。對于二對甲苯磺酸緣生替尼而言，以甲醇水溶液作為流動相能夠保證更好的檢測效果， 優(yōu)于其他流動相的檢測結(jié)果。
[0015] 在一些實施例中，甲醇水溶液中甲醇的體積分數(shù)為69 %~76 %。
[0016] 在一些實施例中，甲醇水溶液中甲醇的體積分數(shù)為72 %~76 %。
[0017] 在一些實施例中，甲醇水溶液中甲醇的體積分數(shù)為72 %。
[0018] 流動相的流速過高會降低塔板數(shù)，而塔板數(shù)的降低會導(dǎo)致樣品分離度的降低。
[0019] 在一些實施例中，流動相的流速為0·8mL/min~1. 2mL/min。
[0020] 在一些實施例中，流動相的流速為lmL/min。
[0021] 對本發(fā)明提供的方法而言，二對甲苯磺酸緣生替尼的極性，選擇C18色譜柱。色譜 柱的尺寸會對分離結(jié)果產(chǎn)生影響，其內(nèi)徑會對流動相的流速產(chǎn)生影響，長度較短的色譜柱 運行時間短，柱壓較低；長度較長的色譜柱分辨率稿，但運行時間增長。
[0022] 在一些實施例中，高效液相色譜檢測的色譜柱為WatersSymmetryC18柱。
[0023] 在一些實施例中，色譜柱的尺寸為250mmX4. 6mm，5μm。
[0024] 對柱溫的選擇需考慮待分離物質(zhì)本身的特性，柱溫影響流動相對待測物質(zhì)的溶解 度也會影響柱壓。一般情況下，提高柱溫有利于提高分離度，但溫度過高會導(dǎo)致柱壓過低， 不利于物質(zhì)的檢出。
[0025] 在一些實施例中，高效液相色譜檢測的柱溫為35°C~45°C。
[0026] 在一些實施例中，高效液相色譜檢測的柱溫為40°C。
[0027] 在一些實施例中，溶解的溶劑為體積分數(shù)為70%的甲醇水溶液。
[0028] 在一些實施例中，高效液相色譜檢測的運行時間為25min。
[0029] 在一些實施例中，溶解至二對甲苯磺酸緣生替尼原藥的濃度為100μg/mL。
[0030] 根據(jù)二對甲苯磺酸緣生替尼的紫外吸收圖譜，設(shè)置高效液相色譜檢測的波長為 240nm〇
[0031] 在一些實施例中，高效液相色譜檢測的進樣量為10μL。
[0032] 在一些實施例中，獲得二對甲苯磺酸緣生替尼原料藥中有效成分的含量的方法 為：根據(jù)二對甲苯磺酸緣生替尼樣品濃度與高效液相色譜檢測所得峰面積繪制標準曲線， 根據(jù)標準曲線獲得二對甲苯磺酸緣生替尼原料藥中有效成分的含量。
[0033] 在一些實施例中，標準曲線的繪制方法為：以二對甲苯磺酸緣生替尼樣品的濃度 為橫坐標，以HPLC檢測色譜圖中二對甲苯磺酸緣生替尼的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。
[0034] 本發(fā)明提供了二對甲苯磺酸緣生替尼原料藥中有效成分的定量檢測方法，該方法 將二對甲苯磺酸緣生替尼原料藥溶解，以甲醇水溶液為流動相，以高效液相色譜檢測獲得 色譜圖，根據(jù)色譜圖獲得二對甲苯磺酸緣生替尼原料藥中有效成分的含量。采用本發(fā)明提 供的方法，二對甲苯磺酸緣生替尼標準溶液連續(xù)進樣6針主峰面積RSD為0. 22%;二對甲苯 磺酸緣生替尼雜質(zhì)峰不影響二對甲苯磺酸緣生替尼原料的檢查，在酸、堿、氧化、高溫、光照 降解試驗的圖譜中，主峰的純度因子均大于閾值；主要考慮溶液穩(wěn)定性：供試品溶液在24h 內(nèi)穩(wěn)定，并且流速范圍在0. 8ml/min~1. 2ml/min之內(nèi)、柱溫范圍在35°C~45°C之內(nèi)、流動 相中甲醇的質(zhì)量分數(shù)在72%~76%范圍內(nèi)皆可獲得良好的分離度。并且，檢測結(jié)果表明， 采用本發(fā)明提供的方法重復(fù)性RSD為0. 96%，中間精密度RSD為1. 23%，原料藥線性及范 圍回歸系數(shù)為r= 0.9997。
【附圖說明】
[0035] 圖1示本發(fā)明提供方法檢測二對甲苯磺酸緣生替尼標品的標準曲線。
【具體實施方式】
[0036] 本發(fā)明提供了二對甲苯磺酸緣生替尼原料藥中有效成分的定量檢測方法，本領(lǐng)域 技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換 和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法 及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范 圍內(nèi)對本文的方法和應(yīng)用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0037] 本發(fā)明采用的儀器皆為普通市售品，皆可于市場購得。
[0038] 其中，二對甲苯磺酸緣生替尼原料藥的制備方法為：
[0039] 將301g3-氯代-4- (3-氟代-芐氧基）-苯胺和3. 28g4-氯代-6-碘代-喹唑啉 溶解在50mL異丙醇中，將反應(yīng)混合物回流12小時，通過過濾手機固體產(chǎn)物，用10mL冷異丙 醇和20mL乙醚洗滌，晾干得到3. 8g[3-氯代-4- (3-氟代-芐氧基）-苯基]-(6-碘代-喹 唑啉-4-基）-胺鹽酸鹽；
[0040] 在parr振蕩器中在60psi下將1-芐基-4-甲基-1，4-氮雜膦-4-氧化物（5g) 的甲醇溶液（5〇mL)和3mol/LHC1 (10mL)與碳載鈀（10%，1.Og) -起氫化24小時，混合物 經(jīng)硅藻土過濾，在減壓下去除所有溶劑以得到白色晶體固體4-甲基-1，4-氮雜膦-4-氧化 物鹽酸鹽，其使用無需進一步純化；
[0041]向Cs2C03 (1. 3g，4.Ommol)、丙酮（5.OmL)和 4-甲基-1，4-氮雜膦-4-氧化物鹽酸 鹽（0. 338mg，2.Ommol)的混合物中添加炔丙基氯（150mg，2.Ommol)。在50°C下攪拌混合物 過夜，過濾并濃縮，得到淺棕色固體：4-甲基-1-(丙-2-炔基）-1，4-氮雜膦，4-氧化物， 進行下一步驟無需進一步純化；
[0042] 在隊氣氛下將胺、4-甲基-1-(丙-2-炔基）-1，4_氮雜膦，4-氧化物（205mg， 1. 2mmol)、碘、[3-氯代-4- (3-氟代-芐氧基）-苯基]-(6-碘代-喹唑啉-4-基）-胺鹽 酸鹽（505mg，1.Ommol)、PdCl2 (PPh3) 2 (35mg，5%mol)、Et3N(l.OmL)和Cul(64mg，20%mol) 在lOmLDMF中的混合物加熱過夜。濃縮并通過硅膠上的快速柱層析（5%MeOH，DCM中）純 化，得到作為棕色粉末的期望產(chǎn)物，即N- (3-氯代-4- (3-氟代芐氧基）苯基）-6- (3- (4-甲 基-1，4-氮雜膦-1-基）丙-1-炔基）喹唑啉-4-胺。LCMSESI⑴m/z:550(M+1)。
[0043] 蟲匪1?(0)3(? 300MHz)δ7. 96(d，J= 2. 4Hz，1H)，7· 83(dd，Jl= 3. 6Hz，J2 = 8. 1Hz，1H)，7. 71 (d，J= 8. 4Hz，1H)，7. 60 (dd，J1 = 2. 7Hz，J2 = 9. 3Hz，1H)，7. 39 (td，J1 =0· 7Hz，J2 = 7. 5Hz，1H)，7. 29(d，J= 7. 5Hz，1H)，7. 24(d，J= 9. 9Hz，1H)，7. 13(d，J= 9. 0Hz，1H)，7. 05 (td，J1 = 1. 8Hz，J2 = 8. 1Hz，1H)，5. 21 (s，2H)，3. 73 (s，2H)，3. 35 (s，1H)， 3. 20(m，2H)，3. 00(m，2H)，2. 00(m，4H)，1. 62(d，J= 13. 2Hz，3H)。
[0044] 將得到的N- (3-氯代-4- (3-氟代芐氧基）苯基）-6- (3- (4-甲基-1，4-氮雜 膦-1-基）丙-1-炔基）喹唑啉-4-胺（即緣生替尼）和對甲苯磺酸溶于溶劑（異丙醇： 水=10:1)，其中，緣生替尼和對甲苯磺酸的摩爾比為1:2。加熱回流反應(yīng)10小時后冷卻結(jié) 晶，以甲醇打漿lh抽濾得到得到二對甲苯磺酸緣生替尼原料藥，作為樣品。
[0045] 下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明：
[0046] 實施例1