一種lc-ms/ms檢測唾液中尼古丁及其代謝物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種LC-MS/MS檢測唾液中尼古丁及其代謝物的方法，屬于分析檢測技 術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 尼古丁是煙草中的重要成分，主動(dòng)吸煙和被動(dòng)吸煙都會(huì)對身體產(chǎn)生不利影響，如 心血管疾病、慢性阻塞性肺病甚至癌癥，吸煙上癮已成為當(dāng)今社會(huì)危害公眾健康的一大突 出現(xiàn)狀。尼古丁在人體內(nèi)的主要代謝物有可替寧和3-羥基可替寧等多種物質(zhì)，其中可替寧 就占所有代謝物的70 %-80 %。據(jù)報(bào)道，尼古丁及其代謝物在不同體液(血液、尿液和唾液） 中的濃度水平與煙氣暴露量密切相關(guān)，其含量水平可評估吸煙、戒煙行為以及環(huán)境煙氣暴 露程度。因此，建立一種快速準(zhǔn)確的方法同時(shí)檢測尼古丁及其代謝物至關(guān)重要。
[0003] 同樣，標(biāo)本的選擇也很關(guān)鍵。目前已有方法用于血漿、尿液、唾液等樣本的尼古丁 代謝物的分析。尿液的采集較血液無創(chuàng)傷性，且尿液中的可替寧比血液中的含量高，但是尿 樣會(huì)受尿量的影響造成測定誤差。研究數(shù)據(jù)顯示，唾液可替寧和血液可替寧的相關(guān)性很高。 因此，選擇唾液標(biāo)本作為尼古丁代謝物的測定是最簡單可行的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種LC-MS/MS檢測唾液中尼古丁及其代謝物 的方法。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0006] -種LC-MS/MS檢測唾液中尼古丁及其代謝物的方法，其中，所述的代謝物為可替 寧和3-羥基可替寧；
[0007] 利用LC-MS/MS分別檢測標(biāo)準(zhǔn)品溶液和經(jīng)過預(yù)處理的唾液樣品，利用同位素內(nèi)標(biāo)定 量法，以標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物的濃度比為X軸，標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物峰面積比為Y軸，建立校準(zhǔn)曲線， 并計(jì)算出唾液中尼古丁及其代謝物的濃度，具體色譜條件為：
[0008] (1)色譜條件：
[0009] 流動(dòng)相A: 0.1 %v/v甲酸水溶液；
[0010] 流動(dòng)相B: 0.1 %v/v甲酸的甲醇溶液；
[0011] 色譜柱型號：UltimateSi02,2.IX100mm，3ym;
[0012] 流速為 0.2mL/min;
[0013] 柱溫為 35°C;
[0014] 進(jìn)樣體積為10yL;
[0015] 采用梯度洗脫的方式，見表1;
[0016] 表1流動(dòng)相梯度洗脫參數(shù)
[0017]
[0018] (2)質(zhì)譜條件：
[0019] 在電噴霧電離正離子檢測模式下，采用多反應(yīng)監(jiān)測的質(zhì)譜掃描模式;噴霧電壓為 5500V;碰撞氣為Medium;氣簾氣為40kPa;離子源霧化氣和加熱輔助氣均為60kPa;去溶劑溫 度為550°C。
[0020]其中，所述的標(biāo)準(zhǔn)品溶液按照如下方法制備得到：
[0021]分別準(zhǔn)確稱取10.〇mg尼古丁、可替寧和3-羥基可替寧，分別加入lmL甲醇溶解，配 制成濃度均為10.Omg/mL標(biāo)準(zhǔn)品母液；分別從以上標(biāo)準(zhǔn)品母液中移取100yL用甲醇定容至 1mL，稀釋到濃度為1.Omg/mL，然后再用甲醇將這3種標(biāo)準(zhǔn)品的濃度由1.Omg/mL逐級稀釋至 10yg/mL;接著分別取lmL濃度為10yg/mL的尼古丁、可替寧和3-羥基可替寧加入到15mL離心 管中，再加去離子水定容到10mL，得到尼古丁、可替寧和3-羥基可替寧的濃度均為1.0yg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)液A;
[0022] 準(zhǔn)確稱取10 .Omg氘代可替寧內(nèi)標(biāo)品，加入10mL甲醇溶解，得到濃度為1.Omg/mL的 內(nèi)標(biāo)溶液;然后再用甲醇將內(nèi)標(biāo)溶液的濃度由1.Omg/mL稀釋至1.Oyg/mL，得到內(nèi)標(biāo)液B; [0023] 移取100yL混合標(biāo)準(zhǔn)液A于1.5mL離心管中，向其中加入100yL空白唾液基質(zhì)作為 第一個(gè)高值濃度點(diǎn)；移取20此混合標(biāo)準(zhǔn)液A用空白唾液基質(zhì)定容至200yL得到第二個(gè)濃度 點(diǎn);接著，移取l〇yL混合標(biāo)準(zhǔn)液A用空白唾液基質(zhì)定容至500yL，取200yL作為第三個(gè)濃度點(diǎn)； 分別取50、25、5yL的第三個(gè)濃度點(diǎn)分別定容至200yL，得到其它3個(gè)校準(zhǔn)濃度點(diǎn)，這六個(gè)濃度 點(diǎn)體積均為200yL;接著向其中各加入10yLlyg/mL同位素內(nèi)標(biāo)液B，再加入400yL乙腈，然后 禍旋數(shù)秒后振蕩lOmin，14000r/min離心5min后取50yL上清液，再加入50yL去離子水，混勾 后即得標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
[0024]其中，所述的空白唾液基質(zhì)為非吸煙者（指非主動(dòng)吸煙者且非被動(dòng)吸煙者）的唾液 基質(zhì)。
[0025] 其中，所述的唾液樣品按如下方法預(yù)處理得到:取200yL唾液于1.5mL離心管中，向 其中加入10yLlyg/mL內(nèi)標(biāo)液B，再加入400yL乙腈，然后渦旋數(shù)秒后振蕩lOmin，14000r/min 離心5min后取50yL上清液，再加入50yL去離子水，混勻后即得唾液樣品。
[0026] 其中，所述的內(nèi)標(biāo)液B按如下方法制備得到:準(zhǔn)確稱取10.Omg氘代可替寧內(nèi)標(biāo)品， 加入10mL甲醇溶解，得到濃度為1.Omg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液;然后再用甲醇將內(nèi)標(biāo)溶液的濃度由 1 ·Omg/mL稀釋至1 ·Oyg/mL，得到內(nèi)標(biāo)液B。
[0027] 有益效果:本發(fā)明方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確且前處理過程簡單，5min之內(nèi)可 完成分離和檢測，精密度和穩(wěn)定性滿足要求，而且唾液樣本采集方便且無創(chuàng)傷性，可用于評 估吸煙、戒煙行為以及環(huán)境煙氣暴露程度研究。
【附圖說明】
[0028]圖1.尼古丁及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)品的選擇離子流圖。
[0029]圖2.非吸煙者空白唾液中尼古丁及其代謝物的選擇離子流圖。
[0030]圖3.吸煙者唾液中尼古丁及其代謝物的選擇離子流圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本 發(fā)明。
[0032] 實(shí)施例1:
[0033] 1.材料
[0034]方法學(xué)研究實(shí)驗(yàn)的樣本來自于上海迪安醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所員工的唾液樣本。
[0035] (1)儀器:API4000+三重四級桿質(zhì)譜儀(ABSCIEX公司）；ekspert'ultraLC100液 相色譜系統(tǒng)(配自動(dòng)進(jìn)樣器）；醫(yī)用高速冷凍離心機(jī)(北京白洋醫(yī)療器械有限公司）；超純水 儀(成都優(yōu)普超純科技有限公司）；多管渦旋混合儀(杭州奧盛儀器有限公司）；快速混勻器 (姜堪市康泰醫(yī)療器材廠）；可調(diào)移液器(ThermoScientific0·5~10yL，10~100yL，100~ lOOOyL);玻璃儀器、燒杯、量筒等。
[0036](2)試劑耗材：色譜純甲醇、乙臆(TediaHighPuritySolventCompany.Inc);上 海月旭科技色譜柱UltimateSi02(2.1X100mm，3ym); 1.5mL離心管(AXYGEN，美國）。
[0037](3)標(biāo)準(zhǔn)品：尼古丁、可替寧、3-羥基可替寧和穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)可替寧_d3購自于加 拿大TorontoResearchChemicalInc.公司，純度均 2 98%。
[0038](4)質(zhì)控品：含有尼古丁、可替寧、3-羥基可替寧的空白唾液基質(zhì)溶液，分高中低三 個(gè)濃度分別為QC(L)、QC(M)、QC(H)，見表2所示。
[0039]表2尼古丁及其代謝物質(zhì)控品對應(yīng)濃度(單位ng/mL)
[0040]
[0041] 2.方法
[0042] (1)色譜條件：流動(dòng)相A: 0.1 %v/v甲酸水溶液;流動(dòng)相B: 0.1 %v/v甲酸的甲醇溶 液。色譜柱型號:UltimateSi02(2.1X100mm，3ym)，采用梯度洗脫的方式，詳見表1。流速為 0.2mL/min，柱溫為35°C，進(jìn)樣體積為10yL。
[0043](2)質(zhì)譜條件：在電噴霧電離（electrosprayionization，ESI)正離子檢測模式 下，采用多反應(yīng)監(jiān)測(multiplereactionmonitoring,MRM)的質(zhì)譜掃描模式。噴霧電壓 (ionspray，IS)為5500V;碰撞氣（collisiongas，CAD)為Medium;氣簾氣（curtaingas， CUR)為40kPa;離子源霧化氣（ionsourceGS1，GS1)和加熱輔助氣(GS2)均為60kPa;去溶 劑溫度為550°C。
[0044] (3)標(biāo)準(zhǔn)品配制：
[0045]分別準(zhǔn)確稱取10.Omg尼古丁、可替寧和3-羥基可替寧，分別加入lmL甲醇溶解，配 制成濃度均為10. 〇mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品母液；分別從以上標(biāo)準(zhǔn)品母液中移取100yL用甲醇定容至 1mL，稀釋到濃度為1.0mg/mL，然后再用甲醇將這3種標(biāo)準(zhǔn)品的濃度由1.0mg/mL逐級稀釋至 10yg/mL;接著分別取lmL濃度為10yg/mL的尼古丁、可替寧和3-羥基可替寧加入到15mL離心 管中，再加去離子水定容到10mL，得到尼古丁、可替寧和3-羥基可替寧的濃度均為l.Oyg/ mL，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)液A。
[0046] 準(zhǔn)確稱取10 .Omg氘代可替寧內(nèi)標(biāo)品，加入10mL甲醇溶解，得到濃度為1.Omg/mL的 內(nèi)標(biāo)溶液。然后再用甲醇將內(nèi)標(biāo)溶液的濃度由1.Omg/mL稀釋至1.Oyg/mL，得到內(nèi)標(biāo)液B。 [0047] (4)質(zhì)控品的配制：取混合標(biāo)準(zhǔn)液A20yL、100yL、500yL分別用非吸煙志愿者的空 白唾液定容至10mL得到。
[0048] (5)樣品處理
[0049] 1)標(biāo)準(zhǔn)品的制備及前處理:移取1OOyL混合標(biāo)準(zhǔn)液A于1.5mL離心管中，向其中加入 100yL空白唾液基質(zhì)作為第一個(gè)高值濃度點(diǎn)；移取2〇yL混合標(biāo)準(zhǔn)液A用空白唾液基質(zhì)定容至 200yL得到第二個(gè)濃度點(diǎn);接著，移取10yL混合標(biāo)準(zhǔn)液A用空白唾液基質(zhì)定容至500yL，取200 yL作為第三個(gè)濃