一種快速檢測(cè)色素蘇丹紅的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種快速檢測(cè)色素蘇丹紅的方法，本發(fā)明還涉及一種包被蛋白G的蘇 丹紅的ELISA檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 蘇丹紅是一種人工合成的偶氮類、油溶性的化工染色劑，被大量地用在生物、化學(xué) 等領(lǐng)域。
[0003] 蘇丹紅為親脂性偶氮化合物，外觀呈暗紅色或深黃色片狀晶體，難溶于水，主要包 括I、II、III和IV等4種類型。其中II、111和IV均為I的化學(xué)衍生物。由于國(guó)際癌癥研究機(jī) 構(gòu)（IARC)將蘇丹紅歸為第3類可致癌物質(zhì)，研究快速檢測(cè)蘇丹紅的方法，很有必要。
[0004] 目前，對(duì)蘇丹紅的檢測(cè)一般采用高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法及液 譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等，但上述方法操作復(fù)雜，價(jià)格較高。
[0005] 簡(jiǎn)單快速有效的檢測(cè)方法是治理蘇丹紅濫用問題的關(guān)鍵。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 法（ELISA)具有高效、靈敏、便于基層推廣等優(yōu)點(diǎn)，而且可以直接采樣進(jìn)行檢測(cè)，與HPLC、 GC-MS檢測(cè)有較高的一致性，目前已有應(yīng)用于蘇丹紅快速檢測(cè)的報(bào)道，但常規(guī)的蘇丹紅 ELISA快速檢測(cè)試劑盒方法具有以下缺點(diǎn)：需要較高純度的抗體，且抗體利用率低、同一板 之內(nèi)孔間變異較大。
[0006] -是抗體利用率低。現(xiàn)有技術(shù)方法是抗體直接與酶標(biāo)板反應(yīng)，由于抗體排列不規(guī) 貝1J，不能夠保證與抗原有效相結(jié)合（見圖1)。而且因?yàn)榭贵w利用率低，用量大，還需要較高 純度，造成檢測(cè)成本較高；
[0007] 二是，同一酶標(biāo)板中的各孔間變異較大，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。如圖1所示。此 外，現(xiàn)有ELISA檢測(cè)方法是先包被抗原，然后加抗體，再加酶標(biāo)二抗，然后再加顯色劑。步驟 較多，操作比較繁瑣。
[0008] 因此，如果能使得抗體Y排列較為整齊，保證抗體Y與抗原有效相結(jié)合，將能有效 利用抗體。既提高抗體利用率，降低檢測(cè)成本，又能提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
[0009] 蛋白G(Protein G)是從鏈球菌A、C和G群很多菌株的細(xì)胞壁及培養(yǎng)上清中提取 的能與IgG Fc片段特異性結(jié)合的蛋白。利用了蛋白G的功能，蛋白G是一種G型鏈球菌細(xì) 胞壁上的蛋白，能特異性的與多種動(dòng)物抗體的Fc部位相結(jié)合，并且具有很高的親和力。通 過克隆了蛋白G的基因序列，在大腸桿菌中表達(dá)出了與抗體有高親和力的基因重組蛋白G。 將基因重組的蛋白G偶聯(lián)到酶標(biāo)板上后，再進(jìn)行抗體包被。將基因重組的蛋白G偶聯(lián)到酶 標(biāo)板上后，降低了空間位阻，增加了重組蛋白G與蘇丹紅抗體IgG的結(jié)合能力，從而使抗體 的Fab端朝向外側(cè)，空間位阻不對(duì)抗原結(jié)合區(qū)域構(gòu)成干擾，對(duì)酶標(biāo)板先經(jīng)蛋白G處理后，再 進(jìn)行抗體包被，不僅可提高同一板內(nèi)及不同板間的酶標(biāo)孔的均一性，而且能提高抗體的利 用率。試驗(yàn)表明，在不影響檢測(cè)性能的條件下，先經(jīng)蛋白G預(yù)處理的ELISA試劑盒蘇丹紅抗 體的需用量?jī)H為通常制備方法下抗體的需用量的十分之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的是提供一種快速檢測(cè)色素蘇丹紅的方法。具體目的是提供一種提高 抗體利用率，降低檢測(cè)成本，又能提高檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的ELISA檢測(cè)方法和試劑盒。
[0011] 本發(fā)明利用了蛋白G的功能。檢測(cè)時(shí)，在酶標(biāo)孔中先加蛋白G，蛋白G具有跟抗體 上Fc部分特異結(jié)合的特點(diǎn)，所以將蛋白G偶聯(lián)到酶標(biāo)板上后，使抗體的Fab端朝向外側(cè)，從 而降低了空間位阻，不對(duì)抗原結(jié)合區(qū)域構(gòu)成干擾，使抗體Y排列更加的整齊，增加了重組蛋 白G與蘇丹紅抗體IgG的結(jié)合能力，能夠保證Y有效的跟抗原相結(jié)合，提高抗體的利用率 (見圖2)。試驗(yàn)表明，在不影響檢測(cè)性能的條件下，先經(jīng)蛋白G預(yù)處理的ELISA試劑盒蘇丹 紅抗體的需用量?jī)H為通常制備方法下抗體的需用量的十分之一。
[0012] 不僅如此，對(duì)酶標(biāo)板先經(jīng)蛋白G處理再進(jìn)行抗體包被，還可提高同一酶標(biāo)板內(nèi)或 不同酶標(biāo)板中各孔間的均一性，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。
[0013] 所述蛋白G(Protein G)是一種G型鏈球菌細(xì)胞壁上的蛋白，從鏈球菌A、C和G群 很多菌株的細(xì)胞壁及培養(yǎng)上清中提取得到。蛋白G能特異性的與多種動(dòng)物抗體的Fc部位 相結(jié)合，并且具有很高的親和力。
[0014] 在實(shí)際應(yīng)用中，所用的蛋白G也可以選用基因重組蛋白G，通過克隆蛋白G的基因 序列，在大腸桿菌中表達(dá)出與抗體有高親和力的基因重組蛋白G而獲得。蛋白G可以通過 市售方式，方便獲得。
[0015] 本發(fā)明的實(shí)施例1比較了傳統(tǒng)的方法和采用本專利的方法檢測(cè)蘇丹紅I，由試驗(yàn) 結(jié)果可以看出可以只用原來的抗體濃度的十分之一，即可達(dá)到傳統(tǒng)方法的檢測(cè)效果；
[0016] 實(shí)施例1是采用和未采用蛋白G處理的試驗(yàn)比較，其中：
[0017] 實(shí)驗(yàn)1采用蛋白G處理，抗體用量為100微升，抗體濃度為1 :1000000 ;
[0018] 實(shí)驗(yàn)2未采用蛋白G處理，抗體濃度稀釋比為1 :100000,為實(shí)驗(yàn)1的10倍?？贵w 用量未變，仍為100微升，
[0019] 從結(jié)果可看出：采用蛋白G處理后，不僅節(jié)約了 90 %的抗體用量，而且每個(gè)批次的 結(jié)果更加均勻，結(jié)果更一致。
[0020] 傳統(tǒng)ELISA檢測(cè)方法的步驟為：空白酶標(biāo)板--包被抗體--加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或樣 品與酶標(biāo)化合物競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)；
[0021] 本專利的步驟為：空白酶標(biāo)板--包被一層protein G--包被抗體--加入標(biāo) 準(zhǔn)物質(zhì)或樣品與酶標(biāo)化合物競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)；
[0022] 本發(fā)明與傳統(tǒng)方法相比，最大的特點(diǎn)就是：通過這一技術(shù)處理，可以節(jié)省抗體用 量，減小板間板內(nèi)的差異；同時(shí)通過優(yōu)化抗體濃度以及酶標(biāo)化合物可增加檢測(cè)的靈敏度。
[0023] 本發(fā)明建立的EL1SA檢測(cè)方法的具體步驟如下：
[0024] 1)制備包被有蛋白G的酶標(biāo)板
[0025] 第一步：包被蛋白G
[0026] 用包被緩沖液將蛋白G稀釋到10~100 μ g/ml，按100 μ 1/孔加到空白酶標(biāo)板的 微孔內(nèi)，37°C孵育2h ;
[0027] 第二步：洗板
[0028] 取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體之后，洗滌酶標(biāo)板孔，洗滌2次；
[0029] 第三步：包被抗體
[0030] 用ΙΟηΜ ρΗ7· 4PBS緩沖液將抗蘇丹紅特異性單克隆抗體稀釋到10~100 μ g/ml， 按100 μ 1/孔加到酶標(biāo)板的孔內(nèi)，37°C孵育0. 5h ;
[0031] 第四步：洗板
[0032] 取出酶標(biāo)板，甩掉板內(nèi)液體之后，洗滌酶標(biāo)板孔，洗滌2次；
[0033] 第五步，封閉
[0034] 用1 %魚皮明膠的封閉液，100~200 μ 1/孔，37°C孵育2h ;
[0035] 第六步，干燥
[0036] 取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，排干，37°C烘干3h ;得到包被蛋白G的酶標(biāo)板；
[0037] 2)反應(yīng)
[0038] 操作步驟如下：在步驟1)制備的酶標(biāo)板的各微孔中，或加入50 μ 1系列濃度的蘇 丹紅標(biāo)準(zhǔn)品，或加入50 μ 1待測(cè)樣品提取液；之后，每孔中再加入50 μ 1酶標(biāo)記蘇丹紅抗原， 此時(shí)每微孔內(nèi)含100 μ 1溶液，25°C放置15min~60min ;
[0039] 3)洗板：取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，洗滌酶標(biāo)板孔，洗1~5次，每次間隔20s，甩 掉板內(nèi)液體并拍干板孔；
[0040] 4)加底物：加入底物顯色液放置10~20min，底物顯色液為含0. 8mmol/L過氧化 氫脲和0. 4mmol/L四甲基聯(lián)苯胺的pH7. 9的磷酸緩沖液溶液；
[0041] 5)終止：加入 2mol/L H2S04, 50 μ 1/ 孔；
[0042] 6)讀數(shù)：用酶標(biāo)儀在主波長(zhǎng)450nm，次波長(zhǎng)630nm下檢測(cè)，測(cè)定每孔0D值。
[0043] 以上所述洗滌酶標(biāo)板孔，是用PBST洗滌液洗滌酶標(biāo)板孔，使用洗滌液200~ 400 μ 1/ 孔；
[0044] 所述系列濃度的蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為0~4. 05ng/ml，用0.0 lmol/L PBS緩沖液 配制；
[0045] 所述酶標(biāo)記蘇丹紅抗原的濃度是1:5000~25000。
[0046] 為與傳統(tǒng)EL1SA檢測(cè)方法進(jìn)行比較，本發(fā)明人按如下步驟進(jìn)行了傳統(tǒng)的EL1SA檢 測(cè)：
[0047] 1)包被 ELISA 板：
[0048] 第一步：用10nM pH7. 4PBS緩沖液將抗蘇丹紅特異性單克隆抗體稀釋到0. 1~ 1 μ 1/ml，100 μ 1/孔；包被到ELISA微孔板內(nèi)，37°C孵育0. 5h ;
[0049] 其余步驟與前述相同。
[0050] 結(jié)果表明，與傳統(tǒng)EL1SA檢測(cè)方法相比，本方法不僅特異性強(qiáng)、靈敏度高、精確性 和準(zhǔn)確性高、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，還可提高抗體的利用率，節(jié)省包被抗體的用量。
[0051] 本發(fā)明提供了一種蘇丹紅的ELISA檢測(cè)試劑盒，包括有常規(guī)蘇丹紅ELISA檢測(cè)試 劑和酶標(biāo)板，其特征是，還含有蛋白G。
[0052] 所述常規(guī)蘇丹紅ELISA檢測(cè)試劑包括蘇丹紅I標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)記辣根過氧化物酶的蘇 丹紅I、樣本稀釋液、洗滌液、底物顯色液和終止液。
[0053] 所述樣本稀釋液為pH為7. 4的10mM PBS溶液。
[0054] 洗滌液為含 0· 2% Tween20pH 為 7. 4 的 0· 6M PBS 溶液。
[0055] 底物顯色液為含0. 8mmol/L過氧化氫脲和0. 4mmol/L四甲基聯(lián)苯胺的pH7. 9的磷 酸緩沖液溶液；
[0056] 終止液為含 2mol/L H2S04。
[0057] 本發(fā)明試劑盒使用方法：
[0058] 1.樣本前處理
[0059] 稱取2g樣本于離心管中，加入10mL乙腈，劇烈震蕩lOmin，室溫3000r/min以上離 心lOmin。移取5mL上清液于50°C環(huán)境下氮?dú)獯蹈伞＜尤胝簾?mL禍動(dòng)30S溶解干燥的 殘留物，加入lmLIMNaOH渦動(dòng)15S，室溫3000r/min離心10min，移取lmL上清液于50°C環(huán)境 下氮?dú)獯蹈?，加入? 5mLDMF充分溶解干燥的殘留物