一種蛋白g金黃色葡萄球菌腸毒素試劑盒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種包被蛋白G的金黃色葡萄球菌腸毒素的ELISA檢測(cè)試劑盒，屬于 金黃色葡萄球菌腸毒素的快速檢測(cè)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 金黃色葡萄球菌腸毒素 （SEs)是由金黃色葡萄球菌分泌的，能刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng) 引起中毒反應(yīng)，是食物中最重要的細(xì)菌性毒素，同時(shí)具有"超抗原"作用，可激活免疫系統(tǒng)。 SEs分子量26~30kDa，易溶于水和鹽溶液，其性質(zhì)穩(wěn)定，許多蛋白質(zhì)酶均不能將其消化，并 且十分耐熱，用巴氏消毒法或一般的蒸煮方法均不能將其破壞。除了早已被鑒定出的SEA、 SEB、SEC、SED、SEE等最主要的5種血清型外，近年來還發(fā)現(xiàn)了 SEF、SEG、SEH、SEI、SEJ、SEK、 SEL、SEM、SEN、SEO、SEP、SEQ、SER等血清型。其中由SEA-SEE引起的食物中毒占由金黃色 葡萄球菌導(dǎo)致的食物中毒的95%。
[0003] 其中金黃色葡萄球菌腸毒素A、B是最受關(guān)注的腸毒素，據(jù)我國食品污染物和食源 性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)在2003~2005年調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的微生物食源 性疾病居第4位，其中以金黃色葡萄球菌腸毒素A引起的食物中毒最多，B型次之，C型及D 型少見。A型腸毒素引起食物中毒發(fā)生率最高，B型腸毒素的毒性最強(qiáng)，檢測(cè)這兩種腸毒素 對(duì)于進(jìn)行食品安全檢測(cè)，預(yù)防食物中毒深有意義。
[0004] 為確保臨床病因的診斷和食品的衛(wèi)生安全，金黃色葡萄球菌及腸毒素A、B (SEA、 SEB)的檢測(cè)方法也一直在發(fā)展，目前已有的檢測(cè)方法有動(dòng)物檢測(cè)法、放射免疫法、聚合酶鏈 反應(yīng)、基因探針、超抗原技術(shù)、反向乳膠凝集、免疫印跡技術(shù)等。但這些方法有些方法存在靈 敏度低，特異性不強(qiáng)，有些存在檢測(cè)局限性，檢測(cè)成本昂貴等缺點(diǎn)，不易于推廣使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種包被蛋白G的金黃色葡萄球菌腸毒素的ELISA檢測(cè)試 劑盒，這種方法靈敏度高，準(zhǔn)確度好，操作簡(jiǎn)便。使用蛋白G預(yù)處理酶標(biāo)板，可快速有效的 檢測(cè)待檢樣本中金黃色葡萄球菌腸毒素殘留水平?；赑roteinG和IgG的特殊親和力， ProteinG與抗體Fc片段結(jié)合后，F(xiàn)ab片段伸展在外，更容易抓取抗原。直接用抗體包板， 抗體在板上的結(jié)合方向是隨機(jī)的，而proteinG板上的抗體具有一致方向性，抗體利用率更 尚。
[0006] 本發(fā)明試劑盒包含：96孔酶標(biāo)板、蛋白G重組蛋白、抗金黃色葡萄球菌腸毒素A單 克隆抗體(抗SEA抗體)、抗金黃色葡萄球菌腸毒素B單克隆抗體(抗SEB抗體)、含辣根過氧 化物酶標(biāo)記的金黃色葡萄球菌腸毒素抗體酶標(biāo)物、樣本稀釋液、洗滌液、終止液。 蛋白G是經(jīng)過基因優(yōu)化后在大腸桿菌中重組表達(dá)的蛋白。
[0007] 包被液為碳酸鹽緩沖液，0.05M pH9.6 CB。
[0008] ELISA 封閉液為含 5% BSA 的 0· 05Μ ρΗ9· 6 CB。
[0009] 樣本稀釋液為0· 05% Tween-20的1%明膠/PBS。
[0010] 洗滌液為含 0· 05% Tween20 pH 為 7· 4 的 0· 01M PBS 溶液。
[0011] 終止液為含 lmol/L H2S04〇
[0012] ELISA檢測(cè)方法的建立： 1) 包被ELISA板： 首先用包被液將蛋白G稀釋到0. 1~1 μ g/ml，100 μ 1/孔；包被到ELISA微孔板內(nèi)，37°C 孵育2h ; 洗板：取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，用洗滌液（PBST)洗滌板孔，200~400 μ 1/孔，洗滌2 次； 再用10mM pH7. 4 PBS緩沖液將抗SEA抗體稀釋到0. 01~1 μ g/ml，100 μ 1/孔；分別包 被到ELISA微孔板內(nèi)，37°C孵育0. 5h ; 2) 洗板：取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，用洗滌液洗滌板孔，200~400 μ 1/孔，洗滌2次； 3) 封閉：100~200 μ 1/孔封閉液，37°C孵育2h ; 4 )干燥：取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，排干，37 °C烘干3h ; 5) ELISA反應(yīng)：每孔加入100 μ L樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，室溫靜置lh，用洗板液洗滌4次，再加 入100 μ L的酶標(biāo)抗體，室溫靜置lh，用洗板液洗滌4次； 6) 顯色：每孔加入反應(yīng)底物150 μ L，室溫避光反應(yīng)15min。每孔加入50 μ L終止液中 止反應(yīng)。
[0013] 7)讀數(shù)：用酶標(biāo)儀在主波長(zhǎng)450nm，次波長(zhǎng)630nm下檢測(cè)，測(cè)定每孔0D值。
[0014] SEB雙抗體夾心法的建立同SEA。
[0015] 由于采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明除特異性強(qiáng)、靈敏度高、精確性和準(zhǔn)確性高、操作 簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，還可提高抗體的利用率，節(jié)省包被抗體的用量。
【附圖說明】
[0016] 附圖1、SEA試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0017] 附圖2、SEB試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 具體實(shí)施例1、金黃色葡萄球菌腸毒素A ELISA試劑盒檢測(cè)方法的建立 1、SEA抗體的制備 用金黃色葡萄球菌腸毒素A免疫Balb/c小鼠，將抗原和等量弗氏完全佐劑混合，免疫 劑量為10 μ g/只小鼠，背部、腹腔和足底多點(diǎn)注射，初次免疫30d后，每隔14d免疫一次，免 疫6次后，取尾血進(jìn)行檢測(cè)。免疫雙擴(kuò)散法測(cè)定血清中抗體效價(jià)。然后將抗原和等量弗氏 不完全佐劑混合，進(jìn)行融合前最后一次加強(qiáng)免疫。取脾臟細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，克隆 篩選制備抗SEA單克隆抗體。
[0019] 2、mAb的純化及鑒定 采用常規(guī)的親和層析法純化mAb腹水，BCA法測(cè)定抗體的濃度，用十二烷基磺酸鈉-聚 丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)進(jìn)行純度的分析。
[0020] 3、酶標(biāo)抗體的制備 純化的抗SEA抗體，經(jīng)過過碘酸鈉法標(biāo)記HRP，加甘油于-20 °C保存。
[0021] 4、SEA ELISA雙抗夾心法的建立 1) 包被ELISA板： 首先用包被液將蛋白G稀釋到0. 1 μ g/ml，100 μ 1/孔；包被到ELISA微孔板內(nèi)，37°C孵 育2h ; 洗板：取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，用洗滌液（PBST)洗滌板孔，200 μ 1/孔，洗滌2次； 再用10mM pH7. 4 PBS緩沖液將抗SEA抗體稀釋到0. 05 μ g/ml，100 μ 1/孔；分別包被 到 ELISA微孔板內(nèi)，37°C孵育0. 5h ; 2) 洗板：取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，用洗滌液洗滌板孔，200 μ 1/孔，洗滌2次； 3) 封閉：100 μ 1/孔封閉液，37°C孵育2h ; 4 )干燥：取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，排干，37 °C烘干3h ; 5) ELISA反應(yīng)：每孔加入100 μ L樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，室溫靜置lh，用洗板液洗滌4次，再加 入100 μ L的酶標(biāo)抗體，室溫靜置lh，用洗板液洗滌4次； 6) 顯色：每孔加入反應(yīng)底物150 μ L，室溫避光反應(yīng)15min。每孔加入50 μ L終止液中 止反應(yīng)。
[0022] 7)讀數(shù)：用酶標(biāo)儀在主波長(zhǎng)450nm，次波長(zhǎng)630nm下檢測(cè)，測(cè)定每孔0D值。
[0023] 具體實(shí)施例2、SEB EL1SA雙抗夾心法的建立 5、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 標(biāo)準(zhǔn)品SEA濃度為：0、l、2、4、8、16ppb，對(duì)應(yīng)的吸光度值為(λll、(λ 302、(λ 689、L 208、 1. 655、1. 988。標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)為標(biāo)品濃度，縱坐標(biāo)為吸光度值。，相關(guān)系數(shù)R2=0. 9998。
[0024] 6、蛋白G的SEA的ELISA檢測(cè)技術(shù)重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果 樣本加標(biāo)2ppb SEA標(biāo)準(zhǔn)品，11份樣品進(jìn)行提取和檢驗(yàn)，結(jié)果如下：
11次重復(fù)測(cè)量的均值為1. 99ppb，方差（SD) 0. 06,變異系數(shù)（CV) 3. 15%。
[0025] 具體實(shí)施例2、金黃色葡萄球菌腸毒素B ELISA試劑盒檢測(cè)方法的建立 SEB抗體的制備、mAb的純化及鑒定、酶標(biāo)抗體的制備、SEB EL1SA雙抗夾心法的建立步 驟同實(shí)施例中SEA ELISA試劑盒檢測(cè)方法建立。
[0026] 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：標(biāo)準(zhǔn)品SEB濃度為：0、0.5、l、2、4、8ppb，對(duì)應(yīng)的吸光度值為 0. 101、0. 287、0. 614、1. 055、1. 389、1. 653。標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)為標(biāo)品濃度，縱坐標(biāo)為吸光度 值，相關(guān)系數(shù)R2=0. 9997。
[0027] 蛋白G的SEB的ELISA檢測(cè)技術(shù)重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果：樣本加標(biāo)lppb SEB標(biāo)準(zhǔn)品，11 份樣品進(jìn)行提取和檢驗(yàn)，結(jié)果如下：
11次重復(fù)測(cè)量的均值為〇· 98ppb，方差（SD) 0· 06,變異系數(shù)（CV) 5. 75%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種蛋白G金黃色葡萄球菌腸毒素試劑盒及其制備方法，其特征在于：本試劑盒由 96孔酶標(biāo)板、蛋白G重組蛋白抗金黃色葡萄球菌腸毒素A單克隆抗體、抗金黃色葡萄球菌腸 毒素B單克隆抗體、含辣根過氧化物酶標(biāo)記的金黃色葡萄球菌腸毒素抗體酶標(biāo)物、樣本稀 釋液、洗滌液、終止液組成，其中酶標(biāo)板為蛋白G預(yù)處理過的酶標(biāo)板。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛋白G金黃色葡萄球菌腸毒素試劑盒，其特征在于：蛋 白G是經(jīng)過基因優(yōu)化后在大腸桿菌中重組表達(dá)的蛋白。3. -種蛋白G金黃色葡萄球菌腸毒素試劑盒的制備方法，其特征在于：所述方法通過 如下步驟建立： 1) 包被ELISA板：首先用包被液將蛋白G稀釋到0. 1~1μg/ml，100μ1/孔；包被到 ELISA微孔板內(nèi)，37°C孵育2h;洗板：取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，用洗滌液（PBST)洗滌板 孔，200~400μ1/孔，洗滌2次；再用10mMpH7. 4PBS緩沖液將抗SEA/SEB抗體稀釋到 0· 01~1μg/ml，100μ1/孔；分別包被到ELISA微孔板內(nèi)，37°C孵育0· 5h; 2) 洗板：取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，用洗滌液洗滌板孔，200~400μ1/孔，洗滌2次； 3) 封閉：100~200μ1/孔封閉液，37°C孵育2h; 4 )干燥：取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，排干，37 °C烘干3h; 5)ELISA反應(yīng)：每孔加入100μL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，室溫靜置lh，用洗板液洗滌4次，再加 入100μL的酶標(biāo)抗體，室溫靜置lh，用洗板液洗滌4次； 6) 顯色：每孔加入反應(yīng)底物150μL，室溫避光反應(yīng)15min;每孔加入50μL終止液中止 反應(yīng)； 7 )讀數(shù)：用酶標(biāo)儀在主波長(zhǎng)450nm，次波長(zhǎng)630nm下檢測(cè)，測(cè)定每孔0D值。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種蛋白G金黃色葡萄球菌腸毒素試劑盒及其制備方法，采用蛋白G預(yù)處理酶標(biāo)板，結(jié)合ELISA雙抗夾心法實(shí)現(xiàn)對(duì)金黃色葡萄球菌腸毒素A/B的快速準(zhǔn)確檢測(cè)。本試劑盒由96孔酶標(biāo)板、蛋白G重組蛋白抗金黃色葡萄球菌腸毒素A單克隆抗體、抗金黃色葡萄球菌腸毒素B單克隆抗體、含辣根過氧化物酶標(biāo)記的金黃色葡萄球菌腸毒素抗體酶標(biāo)物、樣本稀釋液、洗滌液、終止液組成。本發(fā)明可快速有效的檢測(cè)待檢樣本中蘇丹紅殘留水平，還具有操作簡(jiǎn)單、特異性好、靈敏度高等特點(diǎn)。
【IPC分類】G01N33/569, G01N33/577
【公開號(hào)】CN105353129
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510922509
【發(fā)明人】王瑩, 張彥明
【申請(qǐng)人】北京華安麥科生物技術(shù)有限公司
【公開日】2016年2月24日
【申請(qǐng)日】2015年12月14日