一種小分子肽探針及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種小分子肽探針及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的小分子肽WAVGHLM能與肺癌細(xì)胞特異性結(jié)合，為肺癌的特異性診斷及治療提供了新方法。用輔助基團(tuán)18F-NFP標(biāo)記小分子肽，得到放射性同位素18F標(biāo)記的小分子肽探針18F-FP-WAVGHLM，該探針在體內(nèi)對肺腺癌LTEP-a-2具有良好的靶向性，且顯像效果優(yōu)于18F-FDG，顯像維持時間長，因此，該探針可用于制備肺癌的診斷顯像劑，進(jìn)行肺癌腫瘤的早期診斷和監(jiān)測腫瘤治療療效。
【專利說明】一種小分子肽探針及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種小分子肽探針及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]眾所周知，肺癌是世界上死亡率最高的惡性腫瘤，據(jù)世界衛(wèi)生組織2005年的統(tǒng)計結(jié)果顯示每年新發(fā)病例達(dá)135.2萬，男性每年發(fā)病為96.5萬例，女性為38.7萬例。2008年中國肺癌發(fā)病率，男性為49.0/10萬，女性為22.9/10萬。英國腫瘤學(xué)家R.Peto預(yù)言:如果我國不及時控制吸煙和空氣污染，到2025年我國每年肺癌發(fā)病人數(shù)將超過100萬，成為世界第一肺癌大國。肺癌起病隱匿，目前國內(nèi)外仍缺乏有效的篩查和早期診斷方法，確診時已是中晚期。肺癌目前的診斷方法包括痰液細(xì)胞學(xué)檢查，胸部X光，CT，支氣管鏡，B超或CT引導(dǎo)經(jīng)皮肺穿刺活檢，肺功能、心臟檢查，肝、脾、骨腦等部位的掃描檢查，開胸探查術(shù)或胸腔鏡手術(shù)等。由于PET-CT的出現(xiàn)，尤其是小動物PET的出現(xiàn)，為我們尋找肺癌特異性的顯像劑提供了有效的技術(shù)平臺，而這又為肺癌的診斷提供了更加靈敏、準(zhǔn)確、特異的方法。小動物PET是基于PET臨床診斷技術(shù)發(fā)展起來的專門用于小動物的斷層顯像裝置，具有體積小，結(jié)構(gòu)緊湊，超高空間分辨率，可對小動物進(jìn)行精確PET顯像。現(xiàn)在已經(jīng)頻繁應(yīng)用于生物醫(yī)藥學(xué)研究中，例如代謝顯像，腫瘤顯像，基因表達(dá)顯像，受體顯像及藥物研究等方面。
[0003]分子探針是分子影像學(xué)的關(guān)鍵因素，也是分子影像學(xué)研究的先決條件，PET與分子生物學(xué)的結(jié)合，發(fā)展分子成像探針是可行的，也有廣闊的前景。放射性核素標(biāo)記的單克隆抗體片段、人鼠嵌合抗體、基因重組的生物活性物質(zhì)、小分子的生物多肽、反義寡核苷酸等都已經(jīng)進(jìn)入小分子探針研究領(lǐng)域。小分子探針相對于大分子抗體探針，具有分子量小，組織穿透性好，更易達(dá)到靶細(xì)胞，無免疫原性，可大批量合成，易于標(biāo)記等特點，因此，小分子探針較大分子探針具有更好的臨床應(yīng)用前景。
[0004]18F-氟代脫氧葡萄糖(18F-FDG)是目前最常用的一種糖代謝型PET顯像劑，它已成功地應(yīng)用于臨床各方面，如腫瘤的良惡性鑒別、評價腫瘤的惡性程度以及腫瘤治療效果監(jiān)測等。但18F-FDG還存在特異性差、某些腫瘤細(xì)胞對它不攝取以及炎癥細(xì)胞也有攝取等問題，從而造成對腫瘤的鑒別診斷會出現(xiàn)一定假陽性或假陰性結(jié)果。
[0005]胃泌素釋放肽前體是胃泌素釋放肽(gastrin-releasing peptide,GRP)的前體結(jié)構(gòu)。McDonald等在1978年從豬的非竇部胃上皮細(xì)胞分離出來GRP，GRP為哺乳動物的蛙皮素類似物，存在于正常人腦、胃腸的神經(jīng)纖維及胎兒肺的神經(jīng)內(nèi)分泌組織。人類GRP基因編碼產(chǎn)物為148個氨基酸的胃泌素釋放肽前體的母體(pr印roGRP)，由信號肽、GRP1-27和C-末端GRP31-125組成，接著pr印roGRP轉(zhuǎn)化成Pro_GRPl_125，通過內(nèi)源性蛋白分解和酰胺化生成成熟的GRP1-27、GRP18-27和C-末端延伸肽，C-末端延伸肽繼續(xù)生成含有C-末端ProGRP分子。已有研究證實，復(fù)發(fā)性小細(xì)胞肺癌(SCLC)患者的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的GRP與ProGRP呈正相關(guān)。本發(fā)明致力于研究開發(fā)一種適用于肺癌的高特異性小分子探針。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種能與肺癌細(xì)胞特異性結(jié)合的小分子肽。
[0007]本發(fā)明的另一目的是提供一種適用于肺癌分子影像診斷的特異性小分子肽探針及其制備方法。
[0008]本發(fā)明的再一目的是提供上述小分子肽探針在制備肺癌分子影像診斷試劑中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種小分子肽，其氨基酸序列為WAVGHLM (SEQ ID N0.1)。
[0010]一種小分子肽探針，由放射性同位素標(biāo)記小分子肽得到，所述小分子肽的氨基酸序列為 WAVGHLM (SEQ ID N0.1)0
[0011]優(yōu)選的，所述放射性同位素為18f。
[0012]上述小分子肽探針在制備肺癌分子影像診斷試劑中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明的小分子肽能與肺癌細(xì)胞特異性結(jié)合，為肺癌的特異性診斷及治療提供了新方 法。
[0014]本發(fā)明用輔助基團(tuán)18F-NFP標(biāo)記小分子肽，得到放射性同位素18F標(biāo)記的小分子肽探針18F-FP-WAVGHLM，該探針在體內(nèi)對肺腺癌LTEP_a_2具有良好的靶向性，且顯像效果優(yōu)于18F-FDG,顯像維持時間長，因此，該探針可用于制備肺癌的診斷顯像劑，進(jìn)行肺癌腫瘤的早期診斷和監(jiān)測腫瘤治療療效。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為小分子肽WAVGHLM的HPLC圖；
圖2為小分子肽WAVGHLM的質(zhì)譜圖；
圖3為小分子肽探針18F-Fp-WAVGHLM的放化純度檢測結(jié)果圖；
圖4為肺腺癌細(xì)胞LTEP-a-2腫瘤的HE染色結(jié)果圖；
圖5為裸鼠模型注射18F-Fp-WAVGHLM后不同時間段的PET圖；
圖6為裸鼠模型注射18F-FDG后60min的PET圖；
圖7為裸鼠模型注射18F-Fp-WAVGHLM后不同時間段的ROI值變化矩形圖。
【具體實施方式】
[0016]一種小分子肽，其氨基酸序列為WAVGHLM (SEQ ID N0.1)。
[0017]一種小分子肽探針，由放射性同位素標(biāo)記小分子肽得到，所述小分子肽的氨基酸序列為WAVGHLM (SEQ ID N0.1)。優(yōu)選的，所述放射性同位素為18F。
[0018]小分子肽探針的制備方法，包括以下步驟:
1)用含K222和K2CO3的乙腈水溶液淋洗18F_富集的QMA柱，得淋洗液，氮氣吹干；然后依次與2-溴丙酸乙酯、氫氧化鉀、二 (對硝基苯)碳酸酯反應(yīng)，冷卻后，加入乙酸水溶液，經(jīng)半制備HPLC分離柱洗脫，得到18F?；绑w4-硝基苯-2-18F-丙酸酯，為18F-NFP ；
2)將18F-NFP與小分子肽WAVGHLM(SEQ ID N0.1)偶聯(lián)，得到小分子肽探針18F-Fp-WAVGHLM ο[0019]優(yōu)選的，步驟2)包括:將步驟I)得到的18F-NFP用三氟乙酸的水溶液稀釋，通過Oasis HLB柱，將18F-NFP吸附在柱上，用水洗滌，吹干后，再用無水乙醚洗脫18F-NFP,并經(jīng)過無水硫酸鈉柱進(jìn)一步除水；用氮氣吹干無水乙醚后，加入二異丙基乙基胺和溶于二甲基亞砜的小分子肽WAVGHLM(SEQ ID N0.1 )，40°C下反應(yīng)8min后，加入乙酸水溶液稀釋，通過C18柱，洗滌、洗脫、吹干后，加水配成溶液，過微孔濾膜，得到小分子肽探針18F-FP-WAVGHIiL
[0020]下面結(jié)合實施例進(jìn)一步闡述本
【發(fā)明內(nèi)容】
，但不局限于此。
[0021]實施例中所用主要試劑和設(shè)備:CTC-resin (天津南開生物)；N, N-二異丙基碳二亞胺(DIC)(美國 Alfa Aesar) ；N, N-二異丙基乙胺(DIPEA)(美國 Alfa Aesar) ;2-溴丙酸乙酯；NPC (Sigma，美國)；K222 (ΑΒΧ，美國)；1640培養(yǎng)基(美國Gibco);胰蛋白酶(美國Gibco);胎牛血清(美國Gibco);人肺腺癌細(xì)胞系LTEP-a-2 (中科院上海細(xì)胞所)；細(xì)胞超凈工作臺(蘇州凈化)；C02培養(yǎng)箱(美國Thermo);氟多功能化學(xué)合成模塊PET-MF-2V-1T-1(北京派特生物有限公司，中國);安捷倫1200型分析型高效液相分析儀(Agilent，美國);高效液相層析放射性檢測儀(Bioscan,美國)；CyclonelO/5回旋加速器(IBA,比利時)；MicroPET (Siemens,德國)；Sep Pak QMA、Sep Pak HLB、Sep Pak C18 (Water,美國)等。
[0022]實施例1
1、小分子肽WAVGHLM (SEQ ID N0.1)的合成:
采用固相合成法，將多肽從C向N端生長，直至達(dá)到所需要的肽鏈長度。最后脫去保護(hù)基，水解肽鏈和固相載體之間的酯鍵，經(jīng)過純化，得到所需要的多肽。具體步驟如下:
1)取6gCTC樹脂于固相多肽合成瓶中，二甲基甲酰胺(DMF)溶脹20min，抽干，以20%哌啶/DMF脫Fmoc，抽干，DMF洗6次，Imin/次，抽干；
2)稱取相當(dāng)于樹脂3倍當(dāng)量的甲硫氨酸、4.5倍當(dāng)量的1-羥基苯并三唑(H0BT)、6倍當(dāng)量的DIC，混勻后加入樹脂中，鼓`泡反應(yīng)3h，用5%茚三酮測試反應(yīng)是否完全，DMF洗滌，抽干，20%哌啶/DMF脫Fmoc，抽干，DMF洗6次，Imin/次，抽干；
3)重復(fù)2)，直至將氨基酸全部連接上；
4)配制相當(dāng)于已干燥樹脂10倍當(dāng)量的裂解液(TFA/TIS/H20=95/2.5/2.5)，于燒瓶中混勻，冰浴，磁力攪拌，至溶液溫度穩(wěn)定在5°C左右時，緩慢將樹脂加入，繼續(xù)冰浴5min后移走冰浴，室溫下攪拌反應(yīng)3h，將反應(yīng)液抽干，并以相當(dāng)于樹脂3倍當(dāng)量的三氟乙酸(TFA)洗滌樹脂3次，抽干，保留濾液，40°C旋蒸濃縮濾液，至約30mL，濃縮液倒入已冰浴過的異丙醚中，此時有白色沉淀析出，將所有反應(yīng)物移入離心瓶，3500rpm,3min離心，棄去上清液,異丙醚洗滌，再次離心，如此反復(fù)直至上清液PH大于4，氮氣吹干，稱重，經(jīng)高效液相色譜儀純化，獲得小分子肽目的產(chǎn)物。采用HPLC對合成的目的產(chǎn)物進(jìn)行測定，其純度約為95%(見圖1)。對目的產(chǎn)物進(jìn)行LC-MS鑒定，其質(zhì)譜圖如圖2所示。
[0023]小分子肽WAVGHLM (SEQ ID N0.1)具有如下結(jié)構(gòu):
【權(quán)利要求】
1.一種小分子肽，其氨基酸序列為WAVGHLM (SEQ ID N0.1)。
2.—種小分子肽探針，由放射性同位素標(biāo)記小分子肽得到，所述小分子肽的氨基酸序列為 WAVGHLM (SEQ ID N0.Do
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的小分子肽探針，其特征在于:所述放射性同位素為18F。
4.權(quán)利要求2或3所述的小`分子肽探針在制備肺癌分子影像診斷試劑中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K51/08GK103497235SQ201310302559
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年7月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月18日
【發(fā)明者】臧林泉, 杜侃, 潘雪刁 申請人:廣東藥學(xué)院