康定獨(dú)活的hplc指紋圖譜檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物質(zhì)量控制方法技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及康定獨(dú)活的HPLC指紋圖譜檢 測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 康定獨(dú)活是傘形科獨(dú)活屬植物康定獨(dú)活Heracleum souliei de Boiss.的干燥 根，由于康定獨(dú)活與白亮獨(dú)活的性狀類似，通常被認(rèn)為是藏藥白亮獨(dú)活（珠嘎）的偽品。
[0003] 但是，發(fā)明人通過(guò)前期的研究發(fā)現(xiàn)，在鎮(zhèn)痛方面，康定獨(dú)活表現(xiàn)出顯著的療效，而 白亮獨(dú)活卻沒(méi)有表現(xiàn)出療效；在止血方面，康定獨(dú)活和白亮獨(dú)活均表現(xiàn)出顯著的療效，但是 白亮獨(dú)活效果更好?？梢姡M管二者性狀相似，但是其藥效存在明顯的差異，如果在臨床上 將兩者混用，會(huì)產(chǎn)生極大的風(fēng)險(xiǎn)。
[0004] 因此，為了防止藥物的混用，亟需一種方法監(jiān)控康定獨(dú)活的質(zhì)量并將其與近似品， 尤其是白亮獨(dú)活區(qū)分開來(lái)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種康定獨(dú)活的HPLC指紋圖譜檢測(cè)方法，它包括 以下步驟：
[0006] (1)對(duì)照品溶液的制備：取康定獨(dú)活藥材，粉碎得藥材粉末，甲醇超聲或回流提 取，過(guò)濾，得康定獨(dú)活對(duì)照品溶液；
[0007] (2)參照物溶液的制備：取補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯對(duì)照品，混合，加入甲醇，得到 參照物溶液；
[0008] (3)對(duì)照指紋圖譜的建立：
[0009] 分別取參照物溶液和由不同批次康定獨(dú)活藥材制備得到的對(duì)照品溶液，注入高效 液相色譜儀檢測(cè)，得到各批次藥材和參照物的色譜數(shù)據(jù)；色譜條件如下：
[0010] 檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；
[0011] 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠填料；
[0012] 流動(dòng)相：流動(dòng)相A為水，流動(dòng)相B為甲醇或乙腈；
[0013] 梯度洗脫程序如下：
[0014]
[0015] 對(duì)所得色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，建立康定獨(dú)活的對(duì)照指紋圖譜；
[0016] (4)供試品溶液的制備：取待測(cè)藥材，按照步驟（1)相同的方法制備得到供試品溶 液；
[0017] (5)按照步驟⑶相同的色譜條件，將供試品溶液注入高效液相色譜儀檢測(cè)，將所 得色譜圖與對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行比對(duì)，可鑒別出康定獨(dú)活及其質(zhì)量狀況。
[0018] 優(yōu)選地，所述超聲提取是在將藥材粉末冷浸于甲醇30min后進(jìn)行的。
[0019] 優(yōu)選地步驟（1)中，所述藥材與甲醇的重量體積比為I :60g/mL。
[0020] 優(yōu)選地所述紫外檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)為309nm。
[0021] 優(yōu)選地所述色譜柱為Diamonil C18色譜柱，長(zhǎng)度為250mm，內(nèi)徑為4. 6mm，填料的粒 徑為5 μπι。
[0022] 優(yōu)選地所述色譜條件的柱溫為20_40°C，優(yōu)選30°C。
[0023] 優(yōu)選地所述色譜條件的流速為0. 8-1. 2mL/min，優(yōu)選1.0 mL/min。
[0024] 優(yōu)選地，所述對(duì)照指紋圖譜如圖3所示。
[0025] 本發(fā)明還提供了一種測(cè)定康定獨(dú)活中補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯的方法，其特征在 于：它包括以下步驟：
[0026] a、補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：
[0027] 取補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯混合對(duì)照品溶液，按照權(quán)上述檢測(cè)方法中步驟（3)相同 的色譜條件檢測(cè)，得到補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0028] b、取康定獨(dú)活藥材，按照上述檢測(cè)方法中步驟（1)相同的方法，制備得到供試品 溶液，注入高效液相色譜，以步驟a相同的色譜條件檢測(cè)，根據(jù)步驟a的標(biāo)準(zhǔn)曲線得到康定 獨(dú)活藥材中補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯的含量。
[0029] 本發(fā)明通過(guò)選定特定的參照物，并經(jīng)過(guò)提取方法和色譜條件的大量篩選，最終得 到了本發(fā)明康定獨(dú)活的HPLC指紋圖譜檢測(cè)方法。本發(fā)明的指紋圖譜出峰多，分離度良好， 重復(fù)性好，精密度高，為全面監(jiān)控康定獨(dú)活質(zhì)量提供了有效保障。
[0030] 同時(shí)，利用本發(fā)明指紋圖譜檢測(cè)方法的提取方法和色譜條件，還可以并測(cè)得康定 獨(dú)活中兩種活性成分補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯的含量，從而可以從更多的角度來(lái)控制康定獨(dú) 活的質(zhì)量。
[0031] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0032] 以下通過(guò)實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō) 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說(shuō)明】
[0033] 圖1為1-10批康定獨(dú)活樣品的HPLC指紋圖譜，分別為S1-S10。
[0034] 圖2為參照物的HPLC色譜圖，1為補(bǔ)骨脂素峰，2為佛手柑內(nèi)酯峰。
[0035] 圖3為康定獨(dú)活的對(duì)照指紋圖譜，2為補(bǔ)骨脂素峰，4為佛手柑內(nèi)酯峰。
[0036] 圖4康定獨(dú)活的HPLC-3D圖。
[0037] 圖5為四種梯度洗脫方式的HPLC譜圖，Sl為梯度1，S2為梯度2, S3為梯度3, S4 為梯度4。
[0038] 圖6為不同濃度的甲醇提取的HPLC譜圖，SI :20%甲醇，S2 :40%甲醇，S3 :60%甲 醇，S4 :80%甲醇，S5 :甲醇。
[0039] 圖7為不同冷浸時(shí)間的HPLC譜圖，Sl :不冷浸；S2 :冷浸30min ;S3 :冷浸60min。
[0040] 圖8為不同超聲時(shí)間的HPLC譜圖，SI :超聲30min ;S2 :超聲60min ;S3 :超聲 90min〇
[0041] 圖 9 為不同料液比的 HPLC 譜圖，SI :1:20 ;S2 :1:40 ;S3 :1:60 ;S4:1:80。
[0042] 圖10為佛手柑內(nèi)酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)的質(zhì)量單位為mg。
[0043] 圖11為補(bǔ)骨脂素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)的質(zhì)量單位為mg。
【具體實(shí)施方式】
[0044] 實(shí)驗(yàn)材料：康定獨(dú)活藥材樣品產(chǎn)地見表1，1-10批均已過(guò)三號(hào)篩，備用。
[0045] 儀器及試劑：BP121S型電子分析天平（萬(wàn)分之一，Sartorius德國(guó)賽多利斯股 份公司），BP21ID型電子分析天平（十萬(wàn)分之一，Sartorius德國(guó)賽多利斯股份公司）， Agilengtl200型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司），HPLC色譜柱（Diamonsil? C18, 250X4. 6mm，5ym)(美國(guó)迪馬公司），KQ5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公 司），DZG-6090型真空干燥箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），DZKW-4型電子恒溫水浴鍋 (北京中興偉業(yè)儀器有限公司），藥典篩（上虞市道墟化驗(yàn)儀器設(shè)備廠）；佛手柑內(nèi)酯對(duì)照 品（批號(hào)：MUST-14032211，純度3 98%，成都曼思特生物科技有限公司）、補(bǔ)骨脂素對(duì)照品 (批號(hào)130739-201115,純度蘭95%，中國(guó)藥品生物制品檢定所），甲醇（色譜純，fisher)、 水為樂(lè)百氏純凈水，其余試劑均為分析純。
[0046] 表1康定獨(dú)活藥材樣品產(chǎn)地
[0047]
[0048] 實(shí)施例1本發(fā)明康定獨(dú)活的HPLC指紋圖譜檢測(cè)方法
[0049] (1)對(duì)照品溶液的制備：精密稱取康定獨(dú)活藥材粉末0. 5g，置于50mL錐形瓶中，加 甲醇30mL，冷浸60min后稱重，超聲（功率200W，頻率40KHZ) 30min，取出，放冷，補(bǔ)重，取上 清液過(guò)0. 45 μ m微孔濾膜，作為對(duì)照品溶液；
[0050] (2)參照物溶液的制備：精密稱取補(bǔ)骨脂素對(duì)照品和佛手柑內(nèi)酯對(duì)照品適量，混 合，用IOmL容量瓶定容，制成補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯濃度分別為0. 086mg/mL和0. 358mg/mL 的甲醇溶液，作為參照物溶液；
[0051] ⑶對(duì)照指紋圖譜的建立：
[0052] 分別取由1-10批次康定獨(dú)活藥材制備得到的對(duì)照品溶液和參照物溶液，注入高 效液相色譜儀檢測(cè)，得到各批次藥材和參照物的色譜數(shù)據(jù)，采用"中藥色譜指紋圖譜相似度 評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A) "軟件進(jìn)行指紋圖譜分析，結(jié)果分別如圖1和圖2所示；
[0053] 色譜條件如下：采用Diamonil C18色譜柱（250X4. 6mm，5 μ m)，流動(dòng)相為A為水， 流動(dòng)相B為甲醇，柱溫為30°C，流速為lmL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為309nm，檢視時(shí)間50min，進(jìn)樣量 20 μ L0
[0054] 梯度洗脫：45 % B 保持 5min、45 % -60 % B 保持 5min、60 % -73 % B 保持 25min， 73% -80% B 保持 5min，80% B 保持 IOmin，即：
[0055]
[0056] 比較10批康定獨(dú)活HPLC指紋圖譜給出的相關(guān)參數(shù)，去除部分色譜分離度較差的 色譜峰，確定7個(gè)峰作為特征峰組成其對(duì)照指紋圖譜，結(jié)果如圖3所示。經(jīng)與參照品比對(duì)可 知：2、4號(hào)峰分別為補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯。
[0057] (4)供試品溶液的制備：取待測(cè)藥材，按照步驟⑴相同的方法制備得到供試品溶 液；
[0058] (5)按照步驟⑶相同的色譜條件，將供試品溶液注入高效液相色譜儀檢測(cè)，將所 得色譜圖與對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行比對(duì)，可鑒別出康定獨(dú)活及其質(zhì)量狀況。
[0059] 實(shí)施例2本發(fā)明檢測(cè)方法的條件篩選和方法學(xué)考察
[0060] 本實(shí)施例下的供試品選自表1中的康定獨(dú)活藥材。
[0061] 1色譜條件
[0062] 采用Diamonil C18色譜柱（250X4. 6mm，5ym)，流動(dòng)相為A為水，流動(dòng)相B為甲醇， 柱溫為30°C，流速為lmL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為309nm，檢視時(shí)間50min，進(jìn)樣量20 yL。梯度洗 脫：45% B 保持 5min、45% -60% B 保持 5min、60% -73% B 保持 25min，73% -80% B 保持 5min，80% B 保持 IOmin，即：
[0063] LlN 丄U010i5d04 A i ^ 0/丄 J JM
[0064] I. I檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇
[0065] 采用二極管陣列檢測(cè)器，對(duì)供試品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，比較各波長(zhǎng)下HPLC-3D 圖，結(jié)果如圖4所示。
[0066] 結(jié)果顯示，在309nm處，峰較多，能較全面反映康定獨(dú)活的化學(xué)成分信息，且峰強(qiáng) 度較大，因此選擇309nm為康定獨(dú)活HPLC指紋圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)。
[0067] 1.2流動(dòng)相的選擇
[0068] 供試品的提取：精密稱取康定獨(dú)活粉末（過(guò)3號(hào)篩）0. 5g，置于50mL錐形瓶中， 加甲醇30mL，稱重，超聲（功率200W，頻率40KHZ)30min，取出，放冷，補(bǔ)重。取上清液過(guò) 0. 45 μ m微孔濾膜，作為供試品溶液。
[0069] 條件考察：分別考察流動(dòng)相甲醇-7K、乙腈-7K，以濃度5%~95%洗脫60min。結(jié) 果表明兩種流動(dòng)相出峰數(shù)及峰強(qiáng)度相差無(wú)幾，出于市售價(jià)格的考慮，故選用甲醇-水作為 流動(dòng)相。
[0070] 1. 3洗脫梯度條件的選擇
[0071] 供試品的提?。和?.2。
[0072] 條件考察：采用Diamonil C18色譜柱（250X4. 6mm，5 μ m)，流動(dòng)相為A為水，B為 甲醇，采用梯度洗脫方式，考察了 4個(gè)條件，洗脫方式見表2,結(jié)果如圖5所示。
[0073] 表2康定獨(dú)活4種梯度洗脫方式
[0074]
[0075] 結(jié)果表明，以S4即梯度4分離為最佳，各主要峰基線達(dá)到分離，且峰形好，分離度 高，故以梯度4作為康定獨(dú)活的梯度洗脫條件。
[0076] 1. 4供試品的制備條件篩選
[0077] 精密稱取康定獨(dú)活藥材粉末0. 5g，置于50mL錐形瓶中，加甲醇30mL，冷浸60min 后稱重，超聲（功率200W，頻率40KHZ) 30