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一種用三維指紋圖譜鑒別特定產(chǎn)地特定品種葡萄酒的方法與流程

文檔序號:11109090閱讀:781來源:國知局
一種用三維指紋圖譜鑒別特定產(chǎn)地特定品種葡萄酒的方法與制造工藝

本發(fā)明屬于酒類檢測領(lǐng)域,具體涉及一種用三維指紋圖譜(高效液相色譜法、氣相色譜法和紫外可見分光光度法)鑒別特定產(chǎn)地特定品種葡萄酒的方法。



背景技術(shù):

葡萄酒是世界上最早的飲料酒之一,在世界各類酒中占據(jù)著十分顯赫的位置,其產(chǎn)量在世界飲料酒中列第二位。葡萄酒酒精含量低、營養(yǎng)價值高,是最健康、最衛(wèi)生的飲料,所以它一直是飲料酒中優(yōu)先發(fā)展的品種之一。葡萄酒(特指紅葡萄酒)不僅具有飲料酒的飲用、滋補(bǔ)功能,而且適量飲用葡萄酒還有保健功能。

葡萄酒跟人們的生活息息相關(guān),因此,其質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到人民的身體健康。葡萄酒是以新鮮葡萄或葡萄汁經(jīng)酵母部分或完全發(fā)酵釀制而成的,其酒精體積分?jǐn)?shù)通常為8~16%。

但近年來,部分商家在商業(yè)利益的驅(qū)使下,制售假葡萄酒,給消費(fèi)者的身心健康帶來了威脅。一種制假方式是用一種或多種低端葡萄酒混合后貼高端產(chǎn)品的標(biāo)簽以次充好,另外一種是用水、色素、酒精、香精來調(diào)制所謂的葡萄酒,生產(chǎn)原料中唯獨(dú)沒有造葡萄酒必備的葡萄原汁。無論是哪種制假方法,都對消費(fèi)者的消費(fèi)權(quán)益和身心健康造成侵害。

葡萄酒成分多,具有類似中草藥的復(fù)雜體系,但葡萄酒因其葡萄品種固定、種植技術(shù)穩(wěn)定和生產(chǎn)工藝的一致,葡萄酒的質(zhì)量還是具有均一性和穩(wěn)定性的。因此借鑒中藥研究方法,把建立指紋圖譜方法引入葡萄酒的檢測體系中。葡萄酒指紋圖譜的建立,不需要對葡萄酒各組分物質(zhì)的定性分析,只需對葡萄酒中主要化學(xué)成分的組成和含量利用現(xiàn)代分析技術(shù)如色譜分析技術(shù)反映出來,再從宏觀上進(jìn)行分析確定各組分間的差異。

葡萄酒成分大致可分為揮發(fā)性成分和不揮發(fā)性成分兩大類,揮發(fā)性成分包括醇類、酯類、有機(jī)酸類、揮發(fā)性酚類、硫醇類、萜烯醇類等;不揮發(fā)性成分包括黃酮類、氨基酸、糖類、色素、維生素、微量金屬等。由于葡萄酒成分十分復(fù)雜,很難通過單一的檢測方法進(jìn)行產(chǎn)地的溯源和質(zhì)量鑒定,目前,毛細(xì)管柱—?dú)庀嗌V分析葡萄酒中揮發(fā)性成分是葡萄酒分類鑒定、質(zhì)量控制以及了解葡萄酒香氣特點(diǎn)的重要手段。而葡萄酒中不揮發(fā)性成分可通過液相色譜分析進(jìn)行鑒定。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

本發(fā)明的目的是提供一種用三維指紋圖譜(高效液相色譜法、氣相色譜法和紫外可見分光光度法)鑒別特定產(chǎn)地特定品種葡萄酒的方法,該方法通過對多批次特定產(chǎn)地特定品種的葡萄酒樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)收集,利用HPLC和UV建立該產(chǎn)地該品種葡萄酒中提取物的特征指紋圖譜,利用GC法建立該產(chǎn)地該品種葡萄酒二氯甲烷提取物的特征指紋圖譜,最終建立該葡萄酒的共有模式圖譜;將待測葡萄酒樣品的指紋圖譜與該共有模式圖譜進(jìn)行比較,即可鑒別真假。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):

一種用三維指紋圖譜鑒別特定產(chǎn)地特定品種葡萄酒的方法,包括以下步驟:

(1)收集多批次的相同品牌或不同品牌的特定產(chǎn)地特定品種葡萄酒,分別用高效液相色譜法、氣相色譜法、紫外可見分光光度法提取各批次該葡萄酒的液相圖譜、氣相圖譜和紫外-可見光吸收光譜;

(2)建立該葡萄酒的共有模式圖譜;

2-1:氣相部分

提取各批次該葡萄酒氣相色譜中的共有峰,以所有共有峰峰面積之和為分母,每個成分的峰面積做分子,處理后為歸一化面積;歸一化面積大于1%為篩選條件,得到若干個指紋特征峰,為該葡萄酒氣相部分的共有模式圖譜;

2-2:液相部分

提取各批次該葡萄酒液相色譜中的共有峰,以所有共有峰峰面積之和為分母,每個成分的峰面積做分子,處理后為歸一化面積;歸一化面積大于0.7%為篩選條件,得到若干個指紋特征峰,為該葡萄酒液相部分的共有模式圖譜;

2-3:紫外-可見光吸收光譜部分

取各批次吸收光譜中各波長吸光值的平均值,建立紫外-可見光吸收光譜的共有模式圖譜;

(3)待測的聲稱是相同產(chǎn)地相同品種的葡萄酒,分別用高效液相色譜法、氣相色譜法、紫外可見分光光度法提取其液相圖譜、氣相圖譜和紫外-可見光吸收光譜,與步驟(2)得到的共有模式圖譜進(jìn)行比對,依據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)判斷其真?zhèn)危?/p>

3-1:氣相部分

待測葡萄酒的氣相圖譜應(yīng)含有共有模式圖譜的全部指紋特征峰,同時以相對含量計算各個指紋特征峰的相似度,差值法應(yīng)全部大于0.9;

3-2:液相部分

待測葡萄酒的液相圖譜應(yīng)含有共有模式圖譜的全部指紋特征峰,同時以相對峰面積計算各個指紋特征峰的相似度,差值法應(yīng)全部大于0.9;

3-3:紫外-可見光吸收光譜部分

待測葡萄酒的紫外-可見光吸收光譜與共有模式圖譜進(jìn)行比較,差值法應(yīng)全部大于0.9;

若待測葡萄酒的氣相圖譜、液相圖譜和紫外-可見光吸收光譜與共有模式圖譜比對都全部合格,則可以判定待測葡萄酒的確是相同產(chǎn)地相同品種的葡萄酒。

步驟(1)所述的多批次至少需要9個批次;

步驟(1)所述的特定產(chǎn)地是指葡萄酒的主產(chǎn)區(qū),諸如河北秦皇島、山東煙臺、法國波爾多等等;

步驟(1)所述的特定品種是指赤霞珠葡萄酒、梅洛葡萄酒、西拉葡萄酒等等;

步驟(1)和(3)中,葡萄酒樣品做氣相色譜時,樣品的處理步驟如下:

向玻璃離心管加入3mL樣品、7mL二級水和60μL 0.02%(v/v)的內(nèi)標(biāo)溶液4-甲基-2-戊醇,然后加入4.5g優(yōu)級純硫酸銨以提高萃取效率和消除乳化現(xiàn)象,然后加入0.5mL二氯甲烷,于渦旋震蕩儀1100r/min渦旋10min后放入離心機(jī)以2500r/min離心10min,取下層二氯甲烷層至300μL微量進(jìn)樣瓶中用于氣相分析;

氣相色譜標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備:

1、2%(V/V)單標(biāo)母液的配制:各精密吸取表1中的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度為99%左右)2mL于100mL容量瓶中,用無水乙醇定容;

2、0.02%(V/V)內(nèi)標(biāo)溶液的配制:精密吸取1.00mL 2%(V/V)4-甲基-2-戊醇于100mL容量瓶中,用無水乙醇定容;

3、混合標(biāo)液的配制:按表1中各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)量濃度配制,最終混合標(biāo)液中含12%乙醇,并用酒石酸和0.2M NaOH調(diào)節(jié)pH值至3.2;

表1:混合標(biāo)液中各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)量濃度

氣相色譜條件是:40℃保持5min后以3℃/min升溫至190℃,保持10min;載氣為高純氮?dú)?,流?.5mL/min;進(jìn)樣量0.5μL;進(jìn)樣口200℃;分流模式:不分流進(jìn)樣;

步驟(1)和(3)中,葡萄酒樣品做高效液相色譜時,樣品的處理步驟如下:

將葡萄酒樣品用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.3,采用SDB-L固相萃取小柱,上樣10ml,不吹干;用磷酸鹽緩沖溶液(pH值2.3)5ml清洗,清洗2次,吹干;用甲醇洗脫三次,每次1ml,吹干;收集洗脫液在55℃條件下,吹至1ml;

液相色譜條件是:

流動相組成:甲醇-磷酸鹽緩沖液(0.2%H3PO4+0.05M NaH2PO4,用磷酸調(diào)節(jié)pH值2.3);洗脫梯度為:在保留時間為0min、80min、90min、100min、120min時,磷酸鹽緩沖液和甲醇的比例分別為98:2,42:58,10:90,98:2,98:2;流速:1.0ml/min;進(jìn)樣量:10μl;檢測波長:300nm;柱溫:25℃;

步驟(1)和(3)中,葡萄酒樣品做紫外-可見光吸收光譜時,樣品的處理步驟如下:

取2ml葡萄酒樣品于50ml容量瓶中,加入0.4M磷酸1.7ml,用pH值2.0的磷酸二氫鈉-磷酸緩沖液定容;

紫外-可見光吸收光譜的檢測方法是:

先用空白對照溶液在波長200-800nm下進(jìn)行基線校正,然后再將處理后的樣品在波長200-800nm下進(jìn)行掃描,掃描步長為1nm;

步驟(3)所述的差值法,其計算公式如下:

其中,n為特征峰數(shù)目或步長,A和B為比較對象;

當(dāng)本發(fā)明方法用于鑒別秦皇島產(chǎn)赤霞珠葡萄酒時,步驟(3)中,氣相部分差值法應(yīng)全部大于0.9670,液相部分差值法應(yīng)全部大于0.9380,紫外-可見光吸收光譜部分差值法應(yīng)全部大于0.9650。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:

本發(fā)明通過利用HPLC和UV法建立葡萄酒不揮發(fā)類物質(zhì)成分的指紋圖譜,利用GC法建立葡萄酒香氣等揮發(fā)性成分的指紋圖譜。通過對兩種類型(揮發(fā)性成分指紋圖譜和非揮發(fā)性物質(zhì)指紋圖譜)指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和擬合,建立一種三維指紋圖譜技術(shù)鑒別特定產(chǎn)地特定品種葡萄酒的方法。本發(fā)明具有靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。

附圖說明

圖1是秦皇島產(chǎn)赤霞珠葡萄酒9個批次的氣相色譜。

圖2是秦皇島產(chǎn)赤霞珠葡萄酒9個批次的液相色譜。

圖3是秦皇島產(chǎn)赤霞珠葡萄酒9個批次的紫外-可見光吸收光譜。

圖4是秦皇島產(chǎn)赤霞珠葡萄酒氣相部分的共有模式圖譜。

圖5是秦皇島產(chǎn)赤霞珠葡萄酒液相部分的共有模式圖譜。

圖6是××品牌批次20120527葡萄酒的液相圖譜。

圖7是××品牌批次20120527葡萄酒的氣相圖譜。

圖8是××品牌批次20120527葡萄酒的紫外-可見光吸收光譜。

圖9是××品牌批次20111211葡萄酒的液相圖譜。

圖10是××品牌批次20111211葡萄酒的氣相圖譜。

圖11是××品牌批次20111211葡萄酒的紫外-可見光吸收光譜。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述,但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1

一種用三維指紋圖譜鑒別秦皇島產(chǎn)赤霞珠葡萄酒的方法,包括以下步驟:

(1)收集9個批次的不同品牌秦皇島產(chǎn)赤霞珠葡萄酒,分別用高效液相色譜法、氣相色譜法、紫外可見分光光度法提取各批次該葡萄酒的液相圖譜、氣相圖譜和紫外-可見光吸收光譜;

氣相色譜的樣品處理步驟如下:

向玻璃離心管加入3mL樣品、7mL二級水和60μL 0.02%(v/v)的內(nèi)標(biāo)溶液4-甲基-2-戊醇,然后加入4.5g優(yōu)級純硫酸銨以提高萃取效率和消除乳化現(xiàn)象,然后加入0.5mL二氯甲烷,于渦旋震蕩儀1100r/min渦旋10min后放入離心機(jī)以2500r/min離心10min,取下層二氯甲烷層至300μL微量進(jìn)樣瓶中用于氣相分析;

氣相色譜標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備:

1、2%(V/V)單標(biāo)母液的配制:各精密吸取表1中的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度為99%左右)2mL于100mL容量瓶中,用無水乙醇定容;

2、0.02%(V/V)內(nèi)標(biāo)溶液的配制:精密吸取1.00mL 2%(V/V)4-甲基-2-戊醇于100mL容量瓶中,用無水乙醇定容;

3、混合標(biāo)液的配制:按表1中各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)量濃度配制,最終混合標(biāo)液中含12%乙醇,并用酒石酸和0.2M NaOH調(diào)節(jié)pH值至3.2;

表1:混合標(biāo)液中各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)量濃度

氣相色譜條件是:40℃保持5min后以3℃/min升溫至190℃,保持10min;載氣為高純氮?dú)?,流?.5mL/min;進(jìn)樣量0.5μL;進(jìn)樣口200℃;分流模式:不分流進(jìn)樣;氣相色譜儀(美國PerkinElmer公司,帶PSS分流進(jìn)樣口、襯管2mm內(nèi)徑和FID檢測器);TotalChrom色譜工作站(美國PerkinElmer公司);ZB-WAX毛細(xì)柱30m×0.25mm×0.25μm(美國)。

高效液相色譜的樣品處理步驟如下:

將葡萄酒樣品用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.3,采用SDB-L固相萃取小柱,上樣10ml,不吹干;用磷酸鹽緩沖溶液(pH值2.3)5ml清洗,清洗2次,吹干;用甲醇洗脫三次,每次1ml,吹干;收集洗脫液在55℃條件下,吹至1ml;

液相色譜條件是:

流動相組成:甲醇-磷酸鹽緩沖液(0.2%H3PO4+0.05M NaH2PO4,用磷酸調(diào)節(jié)pH值2.3);洗脫梯度為:在保留時間為0min、80min、90min、100min、120min時,磷酸鹽緩沖液和甲醇的比例分別為98:2,42:58,10:90,98:2,98:2;流速:1.0ml/min;進(jìn)樣量:10μl;檢測波長:300nm;柱溫:25℃;色譜柱:Phenomenex Gemini 5 C18

紫外-可見光吸收光譜的樣品處理步驟如下:

取2ml葡萄酒樣品于50ml容量瓶中,加入0.4M磷酸1.7ml,用pH值2.0的磷酸二氫鈉-磷酸緩沖液定容;pH值2.0的磷酸二氫鈉-磷酸緩沖液的配制方法如下:分別配制0.2M磷酸二氫鈉溶液和0.4M磷酸溶液,按78:122ml比例混合,測緩沖液實(shí)際pH值,若pH值有偏差再調(diào)至2.0。

此外,空白對照溶液是:取2mL 10%乙醇溶液于50ml容量瓶中,用pH值2.0的磷酸二氫鈉-磷酸緩沖液定容。

紫外-可見光吸收光譜的檢測方法是:

先用空白對照溶液在波長200-800nm下進(jìn)行基線校正,然后再將處理后的樣品在波長200-800nm下進(jìn)行掃描,掃描步長為1nm。

9個批次葡萄酒的氣相色譜圖如圖1所示;

9個批次葡萄酒的液相色譜圖如圖2所示;

9個批次葡萄酒的紫外-可見光吸收光譜如圖3所示;

(2)建立該葡萄酒的共有模式圖譜;

2-1:氣相部分

提取各批次該葡萄酒氣相色譜中的共有峰(共有69個),以所有共有峰峰面積之和為分母,每個成分的峰面積做分子,處理后為歸一化面積;歸一化面積大于1%為篩選條件,得到9個指紋特征峰,為該葡萄酒氣相部分的共有模式圖譜(圖4);

9個指紋特征峰及其歸一化面積分別是:1號峰1-丙醇1.1%,2號峰異丁醇6.0%,3號峰為內(nèi)標(biāo)(4-甲基-2-戊醇),4號峰異戊醇40.5%,5號峰乳酸乙酯14.8%,6號峰1.0%,7號峰r-丁內(nèi)酯1.6%,8號峰琥珀酸二乙酯2.6%,9號峰苯乙醇12.7%,10號峰13.4%(6號、10號為未知峰,未做定性試驗,不影響指紋圖譜建立);

2-2:液相部分

提取各批次該葡萄酒液相色譜中的共有峰,以所有共有峰峰面積之和為分母,每個成分的峰面積做分子,處理后為歸一化面積;歸一化面積大于0.7%為篩選條件,得到24個指紋特征峰,為該葡萄酒液相部分的共有模式圖譜(圖5);

24個特征峰及其歸一化面積分別為:1號峰1.4%,2號峰9.1%,3號峰1.3%,4號峰9.3%,5號峰2.6%,6號峰4.8%,7號峰9.8%,8號峰2.9%,9號峰3.9%,10號峰4.7%,11號峰0.9%,12號峰10.8%,13號峰2.2%,14號峰3.3%,15號峰0.8%,16號峰2.9%,17號峰1.4%,18號峰3.9%,19號峰2.6%,20號峰1.1%,21號峰1.6%,22號峰2.1%,23號峰1.1%,24號峰1.9%;

2-3:紫外-可見光吸收光譜部分

取各批次吸收光譜中各波長吸光值的平均值,建立紫外-可見光吸收光譜的共有模式圖譜(圖3中的R即為共有模式圖譜);

(3)待測的××品牌聲稱是秦皇島產(chǎn)赤霞珠葡萄酒(批次:20120527),分別用高效液相色譜法、氣相色譜法、紫外可見分光光度法提取其液相圖譜(圖6)、氣相圖譜(圖7)和紫外-可見光吸收光譜(圖8),將它們與步驟(2)得到的共有模式圖譜進(jìn)行比對:

3-1:氣相部分

待測葡萄酒的氣相圖譜含有共有模式圖譜的全部指紋特征峰,同時以相對含量計算相似度,差值法為0.9889,大于0.9670,符合要求;

3-2:液相部分

待測葡萄酒的液相圖譜含有共有模式圖譜的全部指紋特征峰,同時以相對峰面積計算相似度,差值法為0.9884,大于0.9380,符合要求;

3-3:紫外-可見光吸收光譜部分

待測葡萄酒的紫外-可見光吸收光譜與共有模式圖譜進(jìn)行比較,差值法為0.9717,大于0.9650,符合要求;

待測葡萄酒的氣相圖譜、液相圖譜和紫外-可見光吸收光譜與共有模式圖譜比對都全部合格,可以判定待測葡萄酒的確是秦皇島產(chǎn)赤霞珠葡萄酒。

實(shí)施例2

一種用三維指紋圖譜鑒別秦皇島產(chǎn)赤霞珠葡萄酒的方法,包括以下步驟:

秦皇島產(chǎn)赤霞珠葡萄酒的共有模式圖譜見實(shí)施例1;

(3)待測的××品牌聲稱是秦皇島產(chǎn)赤霞珠葡萄酒(批次:20111211),分別用高效液相色譜法、氣相色譜法、紫外可見分光光度法提取其液相圖譜(圖9)、氣相圖譜(圖10)和紫外-可見光吸收光譜(圖11),與共有模式圖譜進(jìn)行比對:

3-1:氣相部分

待測葡萄酒的氣相圖譜含有共有模式圖譜的全部指紋特征峰,同時以相對含量計算相似度,差值法為0.9959,大于0.9670,符合要求;

3-2:液相部分

待測葡萄酒的液相圖譜含有共有模式圖譜的全部指紋特征峰,同時以相對峰面積計算相似度,差值法為0.9485,大于0.9380,符合要求;

3-3:紫外-可見光吸收光譜部分

待測葡萄酒的紫外-可見光吸收光譜與共有模式圖譜進(jìn)行比較,差值法為0.9689,大于0.9650,符合要求;

待測葡萄酒的氣相圖譜、液相圖譜和紫外-可見光吸收光譜與共有模式圖譜比對都全部合格,可以判定待測葡萄酒的確是秦皇島產(chǎn)赤霞珠葡萄酒。

實(shí)施例3

一種用三維指紋圖譜鑒別秦皇島產(chǎn)赤霞珠葡萄酒的方法,包括以下步驟:

秦皇島產(chǎn)赤霞珠葡萄酒的共有模式圖譜見實(shí)施例1;

(3)待測的××品牌聲稱是秦皇島產(chǎn)赤霞珠葡萄酒,分別用高效液相色譜法、氣相色譜法、紫外可見分光光度法提取其液相圖譜、氣相圖譜和紫外-可見光吸收光譜,與共有模式圖譜進(jìn)行比對:

3-1:氣相部分

待測葡萄酒的氣相圖譜含有共有模式圖譜的全部指紋特征峰,同時以相對含量計算相似度,差值法為0.8550,小于0.9670,不符合要求;

3-2:液相部分

待測葡萄酒的液相圖譜含有共有模式圖譜的全部指紋特征峰,同時以相對峰面積計算相似度,差值法為0.7600,小于0.9380,不符合要求;

3-3:紫外-可見光吸收光譜部分

待測葡萄酒的紫外-可見光吸收光譜與共有模式圖譜進(jìn)行比較,差值法為0.8744,小于0.9650,不符合要求;

待測葡萄酒的氣相圖譜、液相圖譜和紫外-可見光吸收光譜與共有模式圖譜比對都全部不合格,可以判定待測葡萄酒非秦皇島產(chǎn)赤霞珠葡萄酒。

實(shí)施例4

一種用三維指紋圖譜鑒別秦皇島產(chǎn)赤霞珠葡萄酒的方法,包括以下步驟:

秦皇島產(chǎn)赤霞珠葡萄酒的共有模式圖譜見實(shí)施例1;

(3)待測的××品牌聲稱是秦皇島產(chǎn)赤霞珠葡萄酒,分別用高效液相色譜法、氣相色譜法、紫外可見分光光度法提取其液相圖譜、氣相圖譜和紫外-可見光吸收光譜,與共有模式圖譜進(jìn)行比對:

3-1:氣相部分

待測葡萄酒的氣相圖譜含有共有模式圖譜的全部指紋特征峰,同時以相對含量計算相似度,差值法為0.3988,小于0.9670,不符合要求;

3-2:液相部分

待測葡萄酒的液相圖譜含有共有模式圖譜的全部指紋特征峰,同時以相對峰面積計算相似度,差值法為0.4180,小于0.9380,不符合要求;

3-3:紫外-可見光吸收光譜部分

待測葡萄酒的紫外-可見光吸收光譜與共有模式圖譜進(jìn)行比較,差值法為0.7826,小于0.9650,不符合要求;

待測葡萄酒的氣相圖譜、液相圖譜和紫外-可見光吸收光譜與共有模式圖譜比對都全部不合格,可以判定待測葡萄酒非秦皇島產(chǎn)赤霞珠葡萄酒。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式,但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制,其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化,均應(yīng)為等效的置換方式,都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

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