金屬離子的分布，從而有助于TritonX-100有效的結(jié)合細(xì)胞壁，或者 是細(xì)胞膜周圍的EPS,LI^S和化itin等。化C1同時(shí)維持一定的細(xì)胞滲透壓，防止細(xì)胞在運(yùn) 一步驟發(fā)生細(xì)胞破裂，釋放胞內(nèi)物質(zhì)。化C1的濃度不能太高，化離子濃度太高，會(huì)導(dǎo)致真?zhèn)€ 蛋白提取過程的鹽離子濃度高影響蛋白質(zhì)在進(jìn)行質(zhì)譜儀分析時(shí)的分子離子化。
[0018] 本發(fā)明的一種用于質(zhì)譜鑒定的革蘭氏細(xì)菌蛋白質(zhì)處理方法包括W下步驟：
[0019] 利用本發(fā)明的緩沖溶液洗涂菌體：選取菌體并置于容器中，加入緩沖溶液懸浮菌 體，離屯、后去掉上清液；
[0020] 細(xì)菌蛋白質(zhì)提?。杭尤爰?xì)胞裂解液，重新懸浮菌體，第一次超聲處理，離屯、后去掉 上清液；后加入蛋白質(zhì)溶解液，第二次超聲處理，離屯、后收集上層蛋白質(zhì)溶液。
[0021] 本發(fā)明所用細(xì)胞裂解液為65%~75%乙醇的水溶液，將傳統(tǒng)方法得加入3份水和 9份無水乙醇，改為直接加入65%~75%的乙醇水溶液，操作更為簡單。
[0022] 本發(fā)明所用蛋白質(zhì)溶解液為摩爾比為10:7:1~10:7:3的乙臘：甲酸：水。 陽02引本發(fā)明的離屯、均選用10000-15000RPM的轉(zhuǎn)速，離屯、效果最好。
[0024] 本發(fā)明利用緩沖溶液洗涂菌體步驟重復(fù)1次W上，由于質(zhì)譜微生物鑒定技術(shù)本身 的靈敏度很高，菌體培養(yǎng)物在培養(yǎng)過程會(huì)出現(xiàn)胞外多糖巧xopolySaccharides,EPS)、脂多 糖化ipopolysaccha;ride，LP巧和幾下質(zhì)類物質(zhì)（又叫殼多糖，化itin)。而且在后續(xù)的步 驟不能有效去除，從而有可能影響最終質(zhì)譜微生物鑒定的準(zhǔn)確性和靈敏性。此外，有些培養(yǎng) 基存留染料（如剛果紅培養(yǎng)基）和其他有機(jī)物質(zhì)。因此，利用本發(fā)明的緩沖溶液洗涂能有 效去除雜質(zhì)。
[0025]其中，本發(fā)明方法對(duì)菌體的培養(yǎng)條件比較寬松，固體培養(yǎng)或液體培養(yǎng)物均可。 陽0%] 實(shí)施例1 :
[0027] 選取lOmg大腸桿菌（革蘭氏陰性菌）固體培養(yǎng)物置于離屯、管中，加入1mlTEST 菌體洗涂緩沖溶液，完全重新懸浮菌體，WlOOOORPM轉(zhuǎn)速離屯、Imin棄取上清液。TEST洗 涂緩沖溶液配方：化C1 0.Olmol/L，his-肥 1(抑 8. 0)lmmol/L，邸TA(pH8. 0)0.Immol/L， TritonX-1000.Olmmol/l，Tris-HCl的濃度和邸TA的濃度比例為10:1，洗涂一次。
[0028] 加入65%的乙醇作為細(xì)胞裂解液，重新懸浮菌體，并置于超聲波細(xì)胞破碎儀上超 聲處理5min，WlOOOORPM的轉(zhuǎn)速離屯、2min后去上清液。
[0029] 加入乙臘：甲酸：水為10:7:3溶解液100祉，進(jìn)行超聲波處理2min，促進(jìn)蛋白質(zhì) 溶解。 陽030] 通過10000RPM轉(zhuǎn)速離屯、2min，收集上層蛋白液，直接進(jìn)行下一步分析鑒定。 陽0川實(shí)施例2: 陽0巧選取lOmg大腸桿菌（革蘭氏陰性菌）固體培養(yǎng)物置于離屯、管中，加入1mlTEST菌 體洗涂緩沖溶液，完全重新懸浮菌體，W10000RPM轉(zhuǎn)速離屯、Imin棄取上清液。TEST洗涂緩 沖溶液配方：化C1 0. 05mol/L，Tris-肥 1(抑 8. 0)5mmol/^，邸TA(pH8. 0)lmmol/L，Triton X-100 0.Immol/l，Tris-肥1的濃度和邸TA的濃度比例為5:1，洗涂兩次。
[0033] 加入70 %的乙醇作為細(xì)胞裂解液，重新懸浮菌體，并置于超聲波細(xì)胞破碎儀上超 聲處理5min，W15000RPM的轉(zhuǎn)速離屯、2min后去上清液。
[0034] 加入乙臘：甲酸：水比例為10:7:2的溶解液100祉，進(jìn)行超聲波處理3min，促進(jìn) 蛋白質(zhì)溶解。 陽035] 通過15000RPM轉(zhuǎn)速離屯、2min，收集上層蛋白液，直接進(jìn)行下一步分析鑒定。
[0036] 實(shí)施例3 :
[0037] 選取lOmg大腸桿菌（革蘭氏陰性菌）固體培養(yǎng)物置于離屯、管中。加入1mlTEST菌 體洗涂緩沖液，重新懸浮菌體，W10000RPM的速度離屯、Imin，棄取上清液。TEST配方：化Cl 0.lmol/L，Tris-HCl(抑 8. 0)10mmol/L，邸TA(pH8. 0)2mmol/L，TritonX-100 0. 2mmol/L。 Tris-HCl和邸TA的濃度比為5:1，洗涂S次。
[0038] 加入75 %的乙醇作為細(xì)胞裂解液，重新懸浮菌體，并置于超聲波細(xì)胞破碎儀上超 聲處理5min，W10000RPM的轉(zhuǎn)速離屯、2min去上清。
[0039] 加入乙臘：甲酸冰=10:7:1的混合液lOOul。超聲處理，通過離屯、10000RPM離 屯、2min收集上層蛋白液，直接進(jìn)行下一步分析鑒定。 W40] 實(shí)施例4 :
[0041] 實(shí)施例四和實(shí)施例一的區(qū)別在于將根瘤菌（革蘭氏陰性菌）取代了大腸桿菌。W42] 實(shí)施例5 :
[0043] 實(shí)施例五和實(shí)施例二的區(qū)別在于將根瘤菌（革蘭氏陰性菌）取代了大腸桿菌。
[0044] 實(shí)施例6 :
[0045] 實(shí)施例六和實(shí)施例=的區(qū)別在于將根瘤菌（革蘭氏陰性菌）取代了大腸桿菌。
[0046] 實(shí)施例7 :
[0047] 實(shí)施例屯和實(shí)施例一的區(qū)別在于將假單胞菌（革蘭氏陽性菌）取代了大腸桿菌。 引實(shí)施例8:
[0049] 實(shí)施例八和實(shí)施例二的區(qū)別在于將假單胞菌（革蘭氏陽性菌）取代了大腸桿菌。
[0050] 實(shí)施例9 :
[0051] 實(shí)施例九和實(shí)施例=的區(qū)別在于將假單胞菌（革蘭氏陽性菌）取代了大腸桿菌。 陽05引實(shí)施例10 :
[0053] 實(shí)施例十和實(shí)施例一的區(qū)別在于將乳酸桿菌（革蘭氏陽性菌）取代了大腸桿菌。
[0054] 實(shí)施例11 : 陽化5] 實(shí)施例十一和實(shí)施例二的區(qū)別在于將乳酸桿菌（革蘭氏陽性菌）取代了大腸桿 -tt: 園O
[0056] 實(shí)施例12 :
[0057] 實(shí)施例十二和實(shí)施例=的區(qū)別在于將乳酸桿菌（革蘭氏陽性菌）取代了大腸桿 困。 陽〇5引對(duì)比例1 :
[0059]將lOmg純培養(yǎng)菌落大腸桿菌放入離屯、管中，加入300y1水混勻，加入900y1乙 醇混勻，W最大速度1500化pm離屯、2min，除去上清液，重復(fù)離屯、，完全除去乙醇，加入50y1 70%的甲酸，重新懸浮所有菌落，并且劇烈震蕩Imin，加入50y1純乙臘混勻，W1500化pm 離屯、2min，轉(zhuǎn)移上清液到一個(gè)新的離屯、管中，樣品制備完畢可直接進(jìn)行鑒定。 W60] 對(duì)比例2 :
[0061] 將lOmg純培養(yǎng)菌落大腸桿菌放入離屯、管中，加入1mlTEST菌體洗涂緩沖液， 重新懸浮菌體，W15000RPM的速度離屯、Imin，棄取上清液。TEST配方：化C1 0.lmol/1， Tris-HCl(抑 8.0)lmmol/L，邸TA(pH8.0)0.lmmol/L，TritonX-100 0.2mmol/L〇Tris-肥 1 和邸TA的濃度比為10:1，洗涂S次。
[0062] 往經(jīng)過緩沖溶液洗涂后的大腸桿菌加入300y1水混勻，加入900y1乙醇混勻，W 1500化pm離屯、2min，除去上清液，重復(fù)離屯、，完全除去乙醇，加入50y170%的甲酸，重新懸 浮所有菌落，并且劇烈震蕩Imin，加入50y1純乙臘混勻，W1500化pm離屯、2min，轉(zhuǎn)移上清 液到一個(gè)新的離屯、管中，樣品制備完畢可直接進(jìn)行鑒定。 W63] 對(duì)比例3 : W64] 對(duì)比例^和對(duì)比例一的區(qū)別在于將根瘤菌取代了大腸桿菌。 W65] 對(duì)比例4 :
[0066] 對(duì)比例四和對(duì)比例二的區(qū)別在于將根瘤菌取代了大腸桿菌。 W67] 對(duì)比例5 :
[0068] 將lOmg的假單胞菌菌落純培養(yǎng)物放入離屯、管加入50ul80%S氣乙酸（TFA)，懸 浮震蕩使得菌體混勻，靜置數(shù)分鐘。加入150111的去離子水，加入200111的100%