用于質(zhì)譜鑒定的革蘭氏細(xì)菌蛋白質(zhì)處理方法及其緩沖溶液的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本申請(qǐng)?jiān)O(shè)及微生物質(zhì)譜鑒定領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種用于質(zhì)譜鑒定的革蘭氏細(xì)菌蛋白 質(zhì)處理方法及其緩沖溶液。
【背景技術(shù)】
[0002] 未知微生物的鑒定技術(shù)發(fā)展由久W來(lái)，通常在描述微生物鑒定結(jié)論中最基本的單 位為屬和種。分類單位中最小的單位菌株是來(lái)自同一單個(gè)細(xì)胞的后代純培養(yǎng)。傳統(tǒng)的做法 是利用化學(xué)方法進(jìn)行細(xì)菌的鑒定，有時(shí)候也稱之為細(xì)菌化學(xué)分類。分類的標(biāo)準(zhǔn)可依據(jù)若干 多個(gè)化學(xué)分類指標(biāo)，可W依據(jù)某些組分的有無(wú)，或者某些化合物豐度的比率，來(lái)獲得一個(gè)顯 著的分類指紋圖譜。
[0003] 隨著化學(xué)儀器的發(fā)展，該領(lǐng)域的先驅(qū)者化therine化nselau所著ACSSymposium Series將所有發(fā)展的質(zhì)譜技術(shù)用于細(xì)菌化學(xué)分類。當(dāng)基質(zhì)輔助激光解析離子化 (Matrix-assistedlaserdeso;rptionionization,MALDI)成功的應(yīng)用到蛋白質(zhì)組學(xué)時(shí)， 開(kāi)始有人利用該技術(shù)分析細(xì)菌蛋白質(zhì)，其中包括可W用于細(xì)菌分類的蛋白質(zhì)。
[0004] 基質(zhì)輔助激光解析離子化（MLDI)是眾多氣化和離子化方法之一，飛行時(shí)間質(zhì)量 分析器燈0巧是離子在電場(chǎng)作用下加速飛過(guò)飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間不同而 被檢測(cè)即測(cè)定離子的質(zhì)荷比（M/幻與離子的飛行時(shí)間成正比，從而檢測(cè)離子。MLDI-T0F 實(shí)際上實(shí)現(xiàn)了一步完成氣化和離子化。分析物首先由固相或液相變成氣相離子，通常情況 下是進(jìn)行氣化，有些粒子在高度真空的環(huán)境下很容易氣化，但是有些分子要在加熱時(shí)分解， 如生物大分子蛋白等。MLDI-T0F能夠?qū)崿F(xiàn)在不破壞分子結(jié)構(gòu)的前提下實(shí)現(xiàn)由固相到氣相 的轉(zhuǎn)變。在MLDI-T0F過(guò)程中，分析物首先被大量的基質(zhì)包裹，并涂在樣品盤表面。樣品盤 通常是由不誘鋼制成，樣品的溶液能在樣品盤上很快揮發(fā)，通常是水、乙臘/水或者丙酬/ 水?；|(zhì)通常是一種弱酸，并且能夠吸收激光，由于基質(zhì)對(duì)一定波長(zhǎng)的激光具有強(qiáng)吸收，因 此，無(wú)論分析物是否有吸光性基質(zhì)或分析物在固相層都會(huì)發(fā)生很強(qiáng)的反應(yīng)。在經(jīng)過(guò)激光轟 擊后，被擊中的樣品點(diǎn)很快被加熱并且獲得動(dòng)能后開(kāi)始從樣品板上脫離下來(lái)，運(yùn)樣基質(zhì)連 同分析物一起氣化，由于基質(zhì)通常是弱酸，一些極性的分析物如蛋白質(zhì)，能夠從基質(zhì)的簇酸 基團(tuán)中獲得質(zhì)子，在質(zhì)量分析器中通過(guò)分析物的質(zhì)荷比的不同進(jìn)行分離檢巧UdMALDI-TOF作 為微生物鑒定的方法關(guān)鍵點(diǎn)在于分辨率。因?yàn)榧?xì)菌全細(xì)胞是一個(gè)非常復(fù)雜的混合體，而且 整個(gè)過(guò)程沒(méi)有前期的分離純化，所WMLDI-T0F所得結(jié)果是一個(gè)用于細(xì)菌鑒定的平均值， 而對(duì)于特異蛋白質(zhì)分析相對(duì)有限。 陽(yáng)〇化]傳統(tǒng)的微生物分類包括表型分類、生理生化分類等方式，其歸根結(jié)底都是微生物 蛋白質(zhì)差異的不同表現(xiàn)形式。而直接利用蛋白質(zhì)進(jìn)行微生物分類更能反映出不同微生物之 間區(qū)別的本質(zhì)，是最有效、最本質(zhì)的微生物分類和鑒定方法。W高通量的MALDI-T0F為基礎(chǔ) 開(kāi)發(fā)的微生物鑒定系統(tǒng)，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)MLDIBioTyper系統(tǒng)在微生物鑒定和 分類的應(yīng)用，可實(shí)現(xiàn)S方面的工作：①對(duì)于一系列已知微生物，可獲得MLDI-T0FMS數(shù)據(jù) 庫(kù)，即建立已知微生物的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)組指紋質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)；②對(duì)于未知微生物，則制備未鑒定 微生物樣品，利用MALDI-TOFMS獲得質(zhì)譜數(shù)據(jù)，再采用提供的軟件包，將獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與 已知微生物的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)組指紋質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，W鑒定具有相同或相似質(zhì)譜數(shù)據(jù)的 已知微生物，再建立未知微生物的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)組指紋質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)；③采用提供的軟件包工 具，可W利用已建立的已知和未知微生物標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)組指紋質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)用于臨床、環(huán)境、工 業(yè)未知樣品的鑒定。由質(zhì)譜檢測(cè)得到的蛋白指紋應(yīng)用于微生物鑒定。運(yùn)項(xiàng)技術(shù)僅需要極少 量的樣品和處理費(fèi)用，就可W快速鑒定出不明細(xì)菌、酵母菌和霉菌，能極好地替代經(jīng)典的微 生物鑒定和分類技術(shù)。
[0006] 但傳統(tǒng)的應(yīng)用于質(zhì)譜鑒定的革蘭氏陰性菌蛋白質(zhì)的處理方法，如應(yīng)用于革蘭氏陰 性菌的乙醇/甲酸法，將一定量的菌落純培養(yǎng)巧-lOmg)放入離屯、管中，加入300y1水混 勻，加入900iil乙醇混勻，W最大速度（15000巧m)離屯、2min，除去上清液，重復(fù)離屯、，完全 除去乙醇，加入50y1 70%的甲酸，重新懸浮所有菌落，并且劇烈震蕩Imin，加入50y1純 乙臘混勻，最大速度（15000rpm)離屯、2min，轉(zhuǎn)移上清液到一個(gè)新的離屯、管中，樣品制備完 畢可直接進(jìn)行鑒定。
[0007] 傳統(tǒng)的應(yīng)用于革蘭氏陽(yáng)性菌蛋白質(zhì)的提取方法為80%TFA提取法。其主要過(guò)程 為將一定量的菌落純培養(yǎng)物巧-lOmg)放入離屯、管加入50ul80%TFA(S氣乙酸），懸浮震 蕩使得菌體混勻，靜置數(shù)分鐘。加入=倍體積（150ul)的去離子水，加入等體積（200ul)的 100%乙臘，最大速度（15000rpm)離屯、2min，轉(zhuǎn)移上清液到一個(gè)新的離屯、管中，樣品制備完 畢可直接進(jìn)行鑒定。
[0008] 但是傳統(tǒng)的樣品處理方法不能有效排除細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的幾下質(zhì)物質(zhì)，胞外 多糖和脂多糖，細(xì)菌菌體的培養(yǎng)基等，從而影響蛋白質(zhì)的分離純化，從而影響到了鑒定準(zhǔn)確 性和靈敏性，而且當(dāng)樣品不確定是革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的情況下，不能快速確定 選用處理方法，因此，現(xiàn)有的用于質(zhì)譜鑒定的革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌蛋白質(zhì)的處理方法不 能通用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N用于質(zhì)譜鑒定的革蘭氏細(xì)菌蛋白質(zhì)處理方法，解決傳統(tǒng)的革蘭氏 細(xì)菌蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定的準(zhǔn)確性和靈敏性不高的問(wèn)題。
[0010] 根據(jù)本申請(qǐng)的第一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N用于質(zhì)譜鑒定的革蘭氏細(xì)菌洗涂的緩沖 溶液，其緩沖溶液配方包括 0.Olmol/L~0.Imol/L化C1，Immol/L~lOmmol/LTris-HCl， 0.Immol/L~2mmol/L邸TA和 0.Olmmol/L~0. 2mmol/LTritonX-100。
[0011] 根據(jù)本申請(qǐng)的第二方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N用于質(zhì)譜鑒定的革蘭氏細(xì)菌蛋白質(zhì)處理 方法，包括W下步驟：
[0012] 利用緩沖溶液洗涂菌體：選取菌體并置于容器中，加入緩沖溶液懸浮菌體，離屯、 后去掉上清液，該緩沖溶液配方包括0.Olmol/L~0.Imol/L化C1，Immol/L~lOmmol/L Tris-HCl,0.Immol/L~2mmol/L邸TA和 0.Olmmol/L~0. 2mmol/LTritonX-100 ；
[0013] 細(xì)菌蛋白質(zhì)提取：往緩沖溶液洗涂后的菌體加入細(xì)胞裂解液，重新懸浮菌體，第一 次超聲處理，離屯、后去掉上清液；后加入蛋白質(zhì)溶解液，第二次超聲處理，離屯、后收集上層 蛋白質(zhì)溶液。
[0014] 本申請(qǐng)的有益效果是：通過(guò)本發(fā)明的緩沖溶液洗涂用于質(zhì)譜鑒定的革蘭氏細(xì)菌 后，再提取細(xì)菌蛋白質(zhì)作為鑒定細(xì)菌樣品，提高了質(zhì)譜鑒定細(xì)菌的分辨率和準(zhǔn)確性。
[0015] 進(jìn)一步地，本申請(qǐng)?zhí)峁┑囊环N用于質(zhì)譜鑒定的革蘭氏細(xì)菌蛋白質(zhì)處理方法，不僅 提高了質(zhì)譜鑒定細(xì)菌的分辨率和準(zhǔn)確性，還同時(shí)適用于革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌的樣品處理 方法。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 本發(fā)明用于質(zhì)譜鑒定的革蘭氏細(xì)菌洗涂的緩沖溶液配方包括：0.01mol/L~ 0.Imol/LNaCl，lmmol/L~lOmmol/LTris-HCl，0.Immol/L~2mmol/LEDTA和O.Olmmol/ L~0. 2mmol/LTritonX-100。Tris-肥1為S(徑甲基）氨基甲燒-鹽酸緩沖液；邸TA為 乙二胺四乙酸絡(luò)合劑；TritonX-100為聚乙二醇辛基苯基酸非離子型表面活性劑。
[0017] 該緩沖溶液可應(yīng)用于本發(fā)明的用于質(zhì)譜鑒定的革蘭氏細(xì)菌蛋白質(zhì)處理方法中洗 涂菌體步驟，也可應(yīng)用于傳統(tǒng)的質(zhì)譜鑒定的革蘭氏細(xì)菌蛋白質(zhì)的處理方法。本發(fā)明的緩沖 溶液的核屯、組分為化C1、化is-肥1和邸TA，化is-肥1和邸TA的主要作用是維持一定抑 值，并改變菌體周圍的