專利名稱：蛋白質和多肽的質譜鑒定和定量檢測的方法學革新的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及蛋白質混合物的分析方法，用于目標蛋白的鑒定和定量檢測。更明確的是，本發(fā)明涉及到方法上的革新改良，以達到能對微量物質的鑒定和定量檢測。
背景技術：
蛋白質組學研究的成功取決于是否能夠可靠地定性并定量檢測某一生物系統(tǒng)中任何一個蛋白質或一組蛋白。然而，由于常規(guī)的生物樣品都是含有蛋白質和其他組分的復雜的混合物，使用質譜分析這類樣品并不容易。
串聯(lián)質譜(“MS/MS")系統(tǒng)已經(jīng)被研發(fā)出來用以檢測生物樣品中的蛋白質。在這類技術中，蛋白質被從樣本中分離提取出來，可供選擇的手段包括色譜法、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他分離技術。然后，蛋白質組分經(jīng)蛋白酶水解，再通過脫鹽和濃縮得到多肽組分。所得多肽混合物經(jīng)質譜儀進行一級質譜分析，即MSl。MSl質譜記錄下信號的強度， 其強度與樣品中的肽含量相對應。MSl質譜中的目標離子可選擇性被分離出來，通過碰撞誘導解離(CID)引發(fā)二級質譜事件。碰撞誘導解離(CID)導致選定的肽斷裂產(chǎn)生小的片斷， 記錄這些片斷的質譜譜圖即二級質譜圖(MS》具有肽的特征信息，可通過與數(shù)據(jù)庫進行比較從而對多肽進行鑒定識別?？墒?，這樣的串聯(lián)質譜(MS/MQ分析系統(tǒng)受MSl質譜分析中儀器對目標肽檢測能力的限制，只有相對豐度較高的蛋白質才能被檢測到。此外，即使一種特定蛋白質被檢測到，其在MSl質譜中的某一特定質/荷比(m/z)的強度也不足以在沒有內(nèi)標物的情況下直接用以定量檢測。
質譜儀的定量問題現(xiàn)在通過另一種手段加以解決，那就是添加一個與目標蛋白質或多肽的m/z有一定關系的內(nèi)標物。定量是通過比較添加至樣品中的內(nèi)標物(其數(shù)量為已知)與目標蛋白質或肽的相對強度來實現(xiàn)的。此外，混合物中蛋白質的相對含量也可通過比較多肽在兩個不同樣品中的相對強度來確定。
目前，搭配穩(wěn)定同位素標記蛋白質或肽的“鳥槍”質譜(Ms)是一種很有吸引力并被廣泛利用的定量蛋白質組學方法。多種將穩(wěn)定同位素標記引入蛋白質的方法已有報道， 包括代謝標記(例如在細胞培養(yǎng)中利用氨基酸進行穩(wěn)定同位素標記如“SILAC”)、蛋白質水平的化學衍生(例如同位素編碼及親和標簽技術如“ICAT”)或肽水平的化學衍生(例如用以相對和絕對定量的同質元素標記法如“iTRAQ”)、串聯(lián)質譜標簽技術(如“TMT”)、同位素編碼蛋白質標記(“ICPL”)以及肽酶標記法等。參見，例如Colzani，Μ.等人，Mol. Cell.Proteomics (2008) 7. 5 :927-937 ；Hanke, S.等人，J. Proteome Res. (2008)7 :1118-1130 ； Thompson, Α.等人，Anal. Chem. 75 :1895-1904 ；Ross, P. L.等人，Mol. Cell. Proteom. 3 1154-1169. Doman，B.等人，Science (2006) 312 :212-217 提供了一篇有關各種基于質譜分析平臺的綜述。
在SILAC方法中，內(nèi)標物與目標肽是化學結構一致的肽，通過特定同位素替代進行修飾，因此，質/荷比(m/z)已發(fā)生改變，但其色譜分離或化學行為并無變化。例如，內(nèi)標物通常是所需蛋白質的重同位素形式(即含有諸如15N^O和/或1V等罕見及較重的同位素)。這些重同位素的標準物可添加至初始提取物中，并隨目標肽或蛋白質一起介入樣品制備和分析。目標肽在MSl中所產(chǎn)生的峰與重內(nèi)標物的相應峰可直接進行比較，用以量化目標肽。類似方法中，可在樣品制備后期摻入重同位素；例如，QconCAT使用串聯(lián)肽，AQUA 法用肽標準物，或者蛋白質標準物在重水(H218O)中水解。此外，混合物中蛋白質的相對量可使用穩(wěn)定同位素對蛋白質進行差異標記來測定。Colzani等人描述了 SILAC方法的一種更為復雜的形式，他們采用了重蛋白質的兩種同(質量)形式。
雖然這樣的鳥槍質譜法量化蛋白質組學平臺已被廣泛用于量化蛋白質組，但方法的靈敏性、定量的準確性以及可重復性不能滿足許多蛋白質組學研究的要求。為了解決這些問題，最近的努力都集中在開發(fā)基于質譜來監(jiān)測特定蛋白質組的方法。預計這些蛋白質組學平臺將在不久的將來在臨床應用以及基礎科學研究中發(fā)揮重要作用，特別是可用在不同條件下對蛋白質組進行反復定量。一個特別有希望的目標定量法叫選擇反應監(jiān)測或多反應監(jiān)測(“SRM”或“MRM”)，該方法運用三重四極桿(QQQ)質譜儀，檢測每一目標肽的特定母離子和碎片(子)離子組/隊(稱為“轉化態(tài)”)。其他相關方法還包含使用諸如LTQ Orbitrap等高精度掃描質譜儀，運用列入清單的方式對預設母離子進行質譜分析。
然而，這些先進方法仍有其局限性。例如，雖然列入清單法可提供更高靈敏度和重復性，但目標母離子仍必須在MSl全譜掃描時可被檢測到以便于產(chǎn)生子離子譜圖(MS2或 MS/MS)。這個問題在高復雜性和濃度范圍差異大的生物樣品中，尤其當目標肽豐度較低時， 就變得很關鍵了。SRM方法是一種靈敏度高、重復性好、對目標蛋白進行量化的方法，但其應用卻受限于必不可少的一步對測定分析的優(yōu)化過程。這樣的優(yōu)化過程通常包括為每一個目標肽選擇最合適的轉化態(tài)，以及為每一目標肽測定最佳碰撞能量和液相色譜(LC)留柱時間。此外，量化通常是在基于具普通質量精度和分辨率的QQQ儀器上進行的，對每一肽來說，其量化僅由一定數(shù)目的轉化態(tài)來決定，因此，測量精度可能會受到化學雜質和共洗脫離子的影響，尤其表現(xiàn)在對復雜樣品的測量中。
現(xiàn)有用于MS2量化的報告離子同重元素標記試劑(例如iTRAQ或TMT)受到以下條件的限制(1)需要在較低質量范圍內(nèi)檢測報告離子，這限制了可用儀器的范圍；(2)受到具有類似m/z值的共洗脫肽離子的潛在影響。
其他以MS2為基礎的使用特定肽的子離子來量化的蛋白質組學方法也有報道。然而，這些方法需要一個放大的前體分離窗(例如10個m/z單位)將輕重同位素標記的前體肽囊括在范圍內(nèi)，用于同時進行CID及隨后量化(基于y離子)。雖然使用多個子離子進行量化可提高準確度，但這一優(yōu)勢又會被削弱，因為放寬窗口后碰撞池內(nèi)存在無關肽離子和更多的化學噪音從而影響定量。
Koehler等人報道了一種在二級質譜中量化同質量肽的方法。Koehler，C.J.等人，J. Proteome Res. 2009，8 (9)，4333-41.在這項研究中，LysC酶水解產(chǎn)生的肽分別由丁二酸酐(Δ O或Δ 4)在N-端、2-甲氧基-4，5- 二氫-IH-咪唑(Δ 4或Δ 0)在C-端賴氨酸殘基上進行化學標記，生成同質量肽。盡管同位素標記的同質量肽已被證明對量化有用，但此方法局限于以賴氨酸為末端的肽，同時還需要兩步基于胺的標記步驟。更重要的是，蛋白質豐度僅靠Mascot分數(shù)半定量估算，而不是經(jīng)由子離子強度直接測定。
因此，盡管目前有多種針對復雜樣品中蛋白質和多肽的鑒定和定量檢測的有效策略，仍然需要能夠有效鑒定目標肽和蛋白質的蛋白質組學平臺，和/或得到通量高、重復性好、且準確的定量檢測方法，尤其是在目標濃度較低的情況下。發(fā)明內(nèi)容
一方面，本發(fā)明涉及一種用于定量檢測目標肽的基于二級質譜的離子定量方法。 在此方法中，目標肽一端(C-端或N-端)經(jīng)重同位素(“重”)作第一標記修飾，而另一端則由“輕”同位素作第二標記修飾。內(nèi)標物，或稱“MSTIQ標準肽”，系制備產(chǎn)生的與修飾后目標肽質量相同的類似物。就其序列而言，內(nèi)標物與修飾后目標肽是一致的，(因而內(nèi)標物在合成反應、采樣工作、色譜及提取過程中與修飾后目標肽表現(xiàn)一致)，但在任何情況下對應端均具有重質和輕質標記；在同質量肽對中，成員1的C端重同位素標記與成員2在C端相對應的輕質標記之間的m/z差異(Δm/ζ)，通過成員2的N端重同位素標記與成員1的N 端相對應輕質標記之間的相同Δπι/z得到平衡。本文中，這類同質量肽對的成員也被稱作 “輕-重”(“LH”)和“重-輕”(“HL”)肽。將已知濃度的內(nèi)標物添加至含有修飾后目標肽的樣本中，接著用串聯(lián)質譜對混合物進行分析。
在質譜分析的第一階段(MSl)，同質量離子對以單一 m/z峰出現(xiàn)；儀器在基本相同 m/z處檢測到同質量離子對的兩個成員的母離子。這些母離子被選擇經(jīng)CID分裂而用于二級質譜分析。CID過程中產(chǎn)生許多對具特異性序列的子離子對，這些子離子對分別對應于每一對同質量肽的N-端和C-端(例如，b-離子和y-離子)，其質量差異等于同質離子對中重輕同位素標記之間的質量差異。由于任何一對子離子對均來自于該同質量(肽)對的每一個成員，它們的強度比可用來測定修飾后目標肽和內(nèi)標物的相對量。因為每個肽能夠沿著肽骨架分裂并產(chǎn)生相應的子離子，所以分裂模式也被用來鑒別目標肽的序列。參見

圖1， 本方法原理概述示意圖。
因此，本發(fā)明涉及一種樣品中目標肽的量化方法，其包含以下步驟(a)對目標肽作如下修飾用重同位素在(1)端作第一標記(A*)，并用輕同位素在(2)端作第二標記(B)， 由此形成(I)型結構A*-肽-B (I);(b)向樣品中添加內(nèi)標物，其中標示肽由與目標肽同序列的肽經(jīng)如下修飾而組成 ⑴端用輕同位素作第一標記㈧并在⑵端用重同位素作第二標記(B*)，形成(II)型結構A-肽-B* (II)，其中，(A*)與㈧之間的質量差異等于(B)與⑶之間的質量差異，以致于內(nèi)標物與修飾后目標肽具有相同質量；(c)獲得樣品的一級質譜；(d)識別與修飾后目標肽和內(nèi)標物相對應的的一級質譜的離子；(e)對步驟(d)中所識別的修飾后目標肽和內(nèi)標物離子進行CID分裂，獲得其二級質譜；(f)比較修飾后目標肽子離子與內(nèi)標物子離子的相對強度；以及(g)基于步驟(f)中的比較，從而量化目標肽。
另一方面，本發(fā)明涉及一種檢測樣品中目標肽的標示離子觸發(fā)分析(“ITA”)方法。在此方法中，將含有修飾后目標肽的樣品內(nèi)摻入標示肽，標示肽是修飾后目標肽的不同同位素形式(具有比修飾后目標肽更輕或更重的同位素)，其數(shù)量足以確保一級質譜分析期間對標示肽母離子的檢測。作為修飾后目標肽的同位素變種，標示肽在化學合成、采樣工作、色譜及提取方法中與修飾后目標肽表現(xiàn)一致。加入標示肽的樣品混合物用串聯(lián)質譜進行分析。在一級質譜分析中，標示肽的母離子出現(xiàn)在與目標肽母離子相差一個已知Δπι/ζ 的地方。由于標示肽豐度在實驗中可以被控制，標示肽母離子在MSl被檢測到后，質譜儀器經(jīng)程序設定在測得的標示肽的Δπι/ζ (修飾后目標肽母離子的預期m/z與標示肽母離子預期m/z之間的差異)左右獲取MS2質譜，該MS2的獲取并不取決于樣品中修飾后目標肽的濃度或修飾后目標肽在MSl中的母離子強度。通常經(jīng)這樣的質譜儀的程序設定，可獲得在修飾后目標肽的m/z附近較小m/z單位區(qū)間(CID分離窗)內(nèi)的二級質譜。通過對MS2分裂模式進行分析，即可測定樣品中是否存在目標肽。
因此，本發(fā)明涉及一種檢測樣品中目標肽的方法，其包含以下步驟(a)對目標肽作如下修飾在(1)端作第一標記(X)并在(2)端作第二標記(Y)，形成(III)型結構X-肽-Y (III)；(b)向樣品中添加標示肽，其中標示肽由與目標肽同序列的肽經(jīng)如下修飾而組成在 (1)端作第一標記(X*)并在(2)端作第二標記(Y*)，形成(IV)型結構 X*-肽-Y* (IV)，其中，(X)、(X*)、(Y)和(Y*)各自獨立地含有正常或至少一個重原子同位素，其中標示肽母離子m/z與目標肽母離子m/z之間的差異X足夠大，以便標示肽母離子的同位素峰落在八個m/z單位之外，或落在目標肽母離子m/z周圍一個較小的CID分離窗之外；(c)獲得樣品的一級質譜；(d)檢測一級質譜中標示肽離子；(e)通過標示肽離子位于χ道爾頓處的 CID分裂，獲得二級質譜；并(f)分析表征目標肽子離子的二級質譜。
本發(fā)明進一步考慮一種結合ITA和MSTIQ的方法(稱為iMSTIQ方法)，用以對目標肽進行檢測、識別和量化。參見圖2。在此方面，本發(fā)明涉及一種分析樣品中目標肽的方法，其包含以下步驟(a)目標肽經(jīng)如下修飾，用重同位素在(1)端作第一標記(C*)、用輕同位素在(2)端作第二標記(D)，形成(V)型結構C*-肽-D (V)；(b)向樣品中添加內(nèi)標物，其中內(nèi)標物由與目標肽同序列的肽經(jīng)如下修飾組成在(1) 端經(jīng)輕同位素作第一標記(C)、在(2)端經(jīng)重同位素作第二標記(D*)，形成(VI)型結構 C-肽-D* (VI)，其中Cf與C之間的質量差異等于D*與D之間的質量差異，以致于內(nèi)標物與修飾后目標肽具相同質量；(c)向樣品中添加標示肽，其中標示肽由與目標肽同序列的肽，經(jīng)如下修飾組成(I)用重同位素在(1)端作標記(Cf)、用重同位素在(2)端作標記(D*)，形成(VII)型結構Cf-肽-D* (VII)；或(II)用輕同位素在⑴端作標記(C)并用輕同位素在(2)端作標記(D)，形成(VIII) 型結構C-肽-D (VIII)；其中標示肽母離子m/z與目標肽母離子m/z之間的差異χ足夠大，以便標示肽母離子的同位素峰落在八個m/z單位之外，或落在目標肽母離子m/z周圍一個較小的CID分離窗之外(e)檢測對應于標示肽的一級質譜離子；(f)通過比標示肽母離子的m/z小xfm/ ζ單位處的CID分裂，獲得二級質譜；(g)分析表征修飾后目標肽的子離子的二級質譜；(h) 比較修飾后目標肽子離子與內(nèi)標物子離子的相對強度；(i)并根據(jù)步驟(h)中的比較對目標肽進行量化。附圖簡介
圖1. MSTIQ量化策略的示范性實施例的原理概述示意圖。肽樣品1 (源自測試蛋白質樣品)及肽樣品2 (市售、肽合成或兩者兼而有之)在其C-端經(jīng)輕(精氨酸和賴氨酸; 白色圓圈)或重(1 -精氨酸或13C61X-賴氨酸；黑色圓圈)氨基酸同位素標記。接著分別用重(黑色五邊形)或輕(白色五邊形)同位素胺標記試劑處理輕重肽，得到同質量的 HL和LH肽。如圖所示示范性MSTIQ胺標記試劑結構。將上述肽混合并進行色譜質譜分析。 MS2中CID之后，生成多個序列特異的子離子對(例如b-離子和y_離子)，其具有4Da的質/荷差異。兩種樣品中肽的相對豐度由相應子離子對的強度比例來決定。
圖2. iMSTIQ策略的MSl階段的原理概述示意圖。摻入肽樣品中的標示肽(“HH”) 的檢測觸發(fā)了修飾后目標肽在預定m/z的CID。在兩個端部各自含有一個重同位素標記和一個輕同位素標記的修飾后目標肽和內(nèi)標物(“HL”和“LH”肽)的母離子，均出現(xiàn)在相同的m/z處。
圖3.實例5中所述的MSTIQ肽量化試驗結果。(a)全掃描MSl光譜(400_1800m/ ζ)，色譜留柱時間59.48min。插圖代表性肽“LWTLVSEQTR”的同位素分布譜圖([M+2H]2+， m/z688.88)。(b)前體肽形式(a)的全掃描MS2質譜(175-1390m/z)。如圖所示多個b_離子對和y-離子對。插圖代表性1+子離子對的透視圖，相距4Da遠；如預計一樣，每一對相對峰強度約為1 1。(c)所有七個效價的預期和實際豐度比(In(HL/LH))。如圖所示每一效價的中位數(shù)(M，點)和分布范圍；直方圖)。直方圖表示分布范圍內(nèi)的數(shù)值；每個直方圖上、下或旁邊的數(shù)值分別表示高于、低于分布范圍或在分布范圍內(nèi)比值的肽。
圖4.實例6中所述ITA檢測試驗結果。指定數(shù)量的八十六個(86)多肽添加至來源于酵母細胞總蛋白提取物的胰蛋白酶水解物，并利用ITA(正方形)或列入清單法(三角形)進行鑒定。圖中繪制了由每種方法選擇用于CID(虛線)或被鑒定的肽(實線)的百分數(shù)與添加至樣品中肽的數(shù)量的關系。
圖5.實例7a中肽的定量檢測。圖5顯示目標肽預期比率(log 10)與MSTIQ內(nèi)標肽之間的相關性。
圖6.實例7b和7c的結果。實例7b (a)全MSl光譜(350-1，800m/z)，色譜留柱時間:41.41min0插圖代表性肽“FAISYQEK”的標示肽母離子([M+2H]2+, 572. 3028m/z) 放大圖(566-575m/z)。目標肽([M+2H]2+, 568. 2973m/z)及共洗脫非特異性肽([M+2H]2+， 567. 2920m/z)均在CID分離窗內(nèi)(567. 2-570. 2m/z，直方圖)，(b)經(jīng)(a)中標示肽觸發(fā)的全MS2光譜(145-1150m/z)。對已經(jīng)識別的特異性肽子離子對進行標記。目標MSTIQ子離子對強度低于非特異性肽子離子(單個子離子模式)。插圖均具有接近1 1相對豐度的代表性子離子對(相距4Da)的MS2光譜放大圖。實例7c (c) log(LH/HL)與已知量每一內(nèi)標(LH)肽(對數(shù)級別)比值的曲線。觀測到線性回歸范圍1 ( LH彡30fmol。
圖7.實例7c的結果。log(LH/HL)與八個待檢肽的已知量LH內(nèi)標肽(對數(shù)) 比值的曲線。將數(shù)據(jù)代入Iogltl (LH/HL) = lc^1(l(LH)-h (虛線)得到粗制HL肽的量(h)， 其中LH彡3fmol(實心圓；h顯示為平均估計值，及2個線性標準誤差范圍，h = IOu, (10μ_20彡h彡10μ+2°))。注意對于肽DGQLLPSSDYSNIK而言，h不在線性范圍內(nèi)，因此可能不準確(有星號標記)。
圖8.實例8的結果。所有六個樣品中14個被測試肽的絕對豐度(Y軸)與時間的關系(X軸)。19h時間點處可見對照樣品數(shù)據(jù)，(a)三個非特異性肽的關系圖(表1內(nèi)的組2)。(b)顯示出LPS依賴性釋放的八個目標肽的關系圖，(c)未顯示出LPS依賴性釋放的三個目標肽的關系圖。發(fā)明詳細描述
術語“標記”是指氨基酸或其他適當?shù)碾男揎椈瘜W標記或其組合。例如，標記可能包含一個單獨的氨基酸、兩個氨基酸、一個非氨基酸化學標記或一個經(jīng)非氨基酸標記進一步修飾的氨基酸。標記可能是或可能包括部分目標肽序列，例如，可能是或可能包括目標肽的實際C-或N-端殘基，或者也可是添加的第二個氨基酸或化學標記，或這個標記可能添加至目標肽序列中。其中標記被添加至目標肽序列時，指被添加到目標肽序列的C-端或 N-端。重同位素標記包含至少一個原子同位素，此原子同位素具有比其天然最豐富質量數(shù)更大的質量數(shù)(“重原子同位素”)，例如/ 替代12c。重原子同位素具有大于其天然最豐富質量數(shù)的質量數(shù)，但其原子數(shù)相同。與質譜方法有關的是，利用重同位素標記修飾的化合物，將得到一個具有比該化合物天然同位素形式更大m/z的化合物。與相同標記的重同位素類似物相比，輕同位素標記具有更少重原子同位素。同位素“輕”標記可以是同位素正常標記(天然最豐富形式)。因此，術語“重”和“輕”是相對術語。重或輕同位素標記應指穩(wěn)定原子同位素的標記。
術語“同量異位素”可定義為具有相同質量數(shù)但原子數(shù)不同的兩個或多個原子中的一個。同量異位素具有近似質量，但又不同于精確質量。“同質量肽”是具有相同質量的肽，但在N-端和C-端使用不同穩(wěn)定同位素進行標記。在這樣的“同質量”對中，肽具有相同質量數(shù)(因此大致相同的質量)，而且同質量對中一個成員的同位素含量(原子數(shù))的任何增加，可通過同質量對中另一個成員同位素含量的相同增加來達到平衡。例如，目標肽可在其N-端經(jīng)重同位素標記、在C-端經(jīng)正常同位素標記。與修飾后目標肽同質量的內(nèi)標肽則互換輕重同位素進行修飾。
合適的N-端標記包括任何可共價結合至多肽N-端的化學基團。優(yōu)選的N-端標記為諸如丙氨酸之類的氨基酸、其他包括那些源自mTRAQ 試劑的胺反應化學標記(Applied Biosystems 公司 http//www3. appliedbiοsystems, com/cms/groups/psm support/ documents/Reneraldocuments/cms 054141. pdf)或其重同位素變體。特別優(yōu)選的N_端標記為丙氨酸、(13C315N)-丙氨酸(所有三個氨基酸碳均用1:3C標記，氨基酸氮則用1N標記)， 以及輕或重的mTRAQ 試劑。11
N-端標記可通過以下方法將目標肽N-端引入或添加至目標序列，例如，諸如氨基酸活化酯形式之類的合適標記試劑或其他胺反應標記試劑的化學反應。
合適的C-端標記包括任何可共價結合至肽C-端的化學基團。在優(yōu)選實施方案中， C-端標記為蛋白質樣品水解后生成的C-端殘基的氨基酸。例如，胰蛋白酶通常水解蛋白質得到在C-端具有賴氨酸或精氨酸殘基的肽。其他蛋白水解酶可在不同位置分裂蛋白質，得到具有不同端氨基酸的肽。優(yōu)選的C-端標記為賴氨酸、("C615N2)-賴氨酸(所有六個賴氨酸碳原子均被13C取代，而兩個賴氨酸氮原子則被1N取代)、精氨酸或15N4-精氨酸(所有四個精氨酸氮原子被1M取代)。
C-端標記可通過以下方法并入或添加至目標序列中，例如1)重或輕同位素氨基酸代謝標記；幻與重或輕同位素標記進行化學合成；或幻當目標肽C-端殘基為精氨酸時， 在輕或重同位素水存在的情況下(例如H218O)，蛋白質樣品的胰蛋白酶水解置換完成。
當目標肽含有或添加有C-端賴氨酸或(13C61X)-賴氨酸時，某些N-端標記試劑會同時與肽的N-端以及賴氨酸的側鏈氨基發(fā)生反應。所述領域的技術人員了解到，為了平衡所需的同位素分布，需要對分析系統(tǒng)中的其他肽進行類似修飾。因此，在某些實施方案中，優(yōu)選的C-端標記為每個側鏈氨基均被丙氨酸或(13C315N)-丙氨酸所修飾的賴氨酸或 (13C615N2)-賴氨酸。更優(yōu)選的C-端標記為賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸、CC615N2)-賴氨酸-丙氨酸或(13C61X)-賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸。其他優(yōu)選的C-端標記為賴氨酸-VTRAQCWRAQ 為mTRAQ標記的重同位素變種)、(13C61X)-賴氨酸-mTRAQ或(1 1 )-賴氨酸-*mTRAQ。 術語賴氨酸-丙氨酸和賴氨酸-mTRAQ及其“重”變種定義為具有連接至賴氨酸側鏈氨基酸的丙氨酸或mTRAQ部分。
本發(fā)明的優(yōu)選方案，應在具有高質量精度、高分辨率和高吞吐量的儀器上獲得一級和二級質譜。在更優(yōu)選的方案中，一級和二級質譜可在LTQ Orbitrap儀器上獲得。
在本發(fā)明的優(yōu)選方案中，CID分離窗小于8m/z單位。在更優(yōu)選的方案中，CID分離窗小于3m/z單位。在更進一步的優(yōu)選方案中，CID分離窗介于lm/z單位與3m/z單位之間。MSTIQ方法
在MSTIQ方法的優(yōu)選方案中，每個肽的(1)端為其C-端，而每個肽的⑵端為其 N-端。在其他優(yōu)選方案中，每個肽的⑴端為其N-端，而每個肽的⑵端為其C-端。
所屬領域技術人員意識到㈧、(A*)、⑶及(B)可以是任何合適的化學標記，其任何一個均可含有零個或多個重原子同位素，只要所得到的修飾后目標肽和內(nèi)標物質量相同。
在優(yōu)選方案中，每個肽的⑴端為其C-端，㈧和(A*)各自獨立地為賴氨酸、 賴氨酸-丙氨酸、賴氨酸-mTRAQ或精氨酸或其任何同位素標記變種，而(B)和(B*)則各自獨立地為丙氨酸或mTRAQ或其同位素標記變種。在優(yōu)選方案中，每個肽的(1)端為其 C-端，(A)為賴氨酸、賴氨酸-丙氨酸、賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸、13C^N2-賴氨酸-丙氨酸、賴氨酸-mTRAQ、賴氨酸-VtraqJ3C61X-賴氨酸-mTRAQ或精氨酸，(α*)為13C^n2-賴氨酸、13C61X-賴氨酸-丙氨酸、13C61X-賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸、13C61X-賴氨酸-mTRAQ、 3C61X-賴氨酸-VTRAQ或1X-精氨酸。在更優(yōu)選方案中，每個肽的(ι)端為其c-端，每個肽的( 端為其N-端，(A)為賴氨酸、賴氨酸-丙氨酸、賴氨酸-(13C615N)-丙氨酸、13C61X-賴氨酸-丙氨酸、賴氨酸-rnTRAQ、賴氨酸-VTRAQ J3C61X-賴氨酸-mTRAQ或精氨酸，(A*)為 13C615N2-賴氨酸、13C^N2-賴氨酸-丙氨酸、13C^N2-賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸、13C61X-賴氨酸-mTRAQ、1^;1、-賴氨酸-VTRAQ或15N4-精氨酸，(B*)為(13C315N)-丙氨酸或源自同位素重mTRAQ試劑，而(B)為丙氨酸或mTRAQ試劑的同位素輕試劑。在其他更優(yōu)選方案中，每個肽的⑴端為其C-端，(A)為賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸，(A*)為13C61X-賴氨酸-丙氨酸， ⑶為丙氨酸，而(B)為(13C315N)-丙氨酸。
在優(yōu)選方案中，每個肽的(1)端為其N-端，(B)和(B*)各自獨立地為賴氨酸、賴氨酸-丙氨酸、賴氨酸-mTRAQ或精氨酸或其任何同位素標記變種，而(A)和(A*)則各自獨立地為丙氨酸或mTRAQ或其同位素標記變種。在更優(yōu)選方案中，每個肽的(1)端為其 N-端，(A)為(13C315N)-丙氨酸或源自同位素重mTRAQ試劑，而(A)為丙氨酸或mTRAQ試劑的同位素輕變種。在其他更優(yōu)選方案中，每個肽的⑴端為其N-端，(A,為(13C315N)-丙氨酸或源自同位素重mTRAQ試劑，(A)為丙氨酸或mTRAQ試劑的同位素輕變種，每個肽的 (2)端為其C-端，(B)為賴氨酸、賴氨酸-丙氨酸、賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸、13C61X-賴氨酸-丙氨酸、賴氨酸-mTRAQ、賴氨酸-VtraqJ3C61X-賴氨酸-mTRAQ或精氨酸，而(B)為 13C615N2-賴氨酸、13C61X-賴氨酸-丙氨酸、13C61X-賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸、13C61X-賴氨酸-mTRAQ、13c6' 賴氨酸-VTRAQ或15N4-精氨酸。在其他更優(yōu)選方案中，每個肽的(ι) 端為其N-端，㈧為丙氨酸，(Α*)為(13C315N)-丙氨酸，每個肽的⑵端為其C-端，⑶為賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸，而(B)為13C61X-賴氨酸-丙氨酸。ITA方法
在ITA方法的優(yōu)選方案中，每個肽的⑴端為其C-端，而每個肽的⑵端為其 N-端。在其他優(yōu)選方案中，每個肽的(1)端為其N-端，而每個肽的⑵端為其C-端。
所述領域技術人員意識到(X)、(X*),⑴和(Y*)可以是任何合適的化學標記，其中每一者均可含有零個或多個重原子同位素。
在某些實施方案中，⑴和⑴均為輕同位素。在那些⑴和⑴為輕同位素的方案中，(X*)和(Y*)應優(yōu)選為重同位素。在那些(X)和(Y)均不具有重原子同位素、標記為部分目標肽序列的方案中，所述領域技術人員認識到結構X-肽-Y與目標肽結構，在化學、 同位素上是一致的。
在ITA方法的其他優(yōu)選方案中，如上述MSTIQ方法中所述，目標肽一端(C-端或 N-端)經(jīng)重同位素作第一標記(“重”)修飾，而另一端則經(jīng)輕同位素作第二標記(“輕”) 修飾。標示肽與修飾后目標肽完全一致，但兩個標記均為“重”或“輕”變種。本文中這些優(yōu)選標示肽也稱作“重-重”(“ΗΗ”)肽。在其他優(yōu)選方案中，⑴和⑴中一者為輕同位素，而另一者則為重同位素，而(X*)和(Y*)兩者均為輕同位素或均為重同位素。作為首選， (X*)和(Y*)兩者均為重同位素。
因此，在優(yōu)選方案中，每個肽的(1)端為其C-端，(X)為賴氨酸、賴氨酸-丙氨酸、 13C615N2-賴氨酸-丙氨酸、賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸、賴氨酸-HiTRAQJ3C61X-賴氨酸-mTRAQ、 賴氨酸-VTRAQ或精氨酸，而(χ*)為13C61X-賴氨酸、13C61X-賴氨酸-丙氨酸、13C61X-賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸、13C61X-賴氨酸-mTRAQ、13C61X-賴氨酸-VTRAQ或15N4-精氨酸。在更優(yōu)選方案中，每個肽的(1)端為其C-端，每個肽的( 端為其N-端，(X)為賴氨酸、賴氨酸-丙氨酸、13C61X-賴氨酸-丙氨酸、賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸、賴氨酸-HITRAQJ3C61X-賴氨酸-mTRAQ、賴氨酸-VTRAQ或精氨酸，(Y)為丙氨酸或mTRAQ試劑的同位素輕質變種，(χ*) 為13C61X-賴氨酸、13C61X-賴氨酸-丙氨酸、13C61X-賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸、"(;1 -賴氨酸-HiTRAQj3Cf^2-賴氨酸-VTRAQ或15N4-精氨酸，而(Y*)為(13C315N)-丙氨酸或源自同位素重mTRAQ試劑。在其他更優(yōu)選方案中，每個肽的(1)端為其C-端，每個肽的(2)端為其N-端，⑴為13Cf^N2-賴氨酸-丙氨酸或賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸，⑴為丙氨酸，(X*) 為13Cf^2-賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸，而(Y*)為(13C315N)-丙氨酸。
在優(yōu)選方案中，每個肽的⑴端為其N-端，(X*)為(13C315N)-丙氨酸或源自同位素重mTRAQ試劑，而(X)為丙氨酸或mTRAQ試劑的同位素輕變種。在更優(yōu)選方案中，每個肽的⑴端為其N-端，(X*)為(13C315N)-丙氨酸或源自同位素重mTRAQ試劑，⑴為丙氨酸或 mTRAQ試劑的同位素輕變種，每個肽的⑵端為其C-端，(Y*)為13C6%2-賴氨酸、1^1 -賴氨酸-丙氨酸、13C^N2-賴氨酸- (13C315N)-丙氨酸、13C61X-賴氨酸-mTRAQ、13C^N2-賴氨酸-VTRAQ或1X-精氨酸，而(Y)為賴氨酸、賴氨酸-丙氨酸、13Cf^N2-賴氨酸-丙氨酸、賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸、賴氨酸-HiTRAQJ3C61X-賴氨酸-mTRAQ、賴氨酸-VTRAQ或精氨酸。 在其他更優(yōu)選方案中，每個肽的⑴端為其N-端，(X*)為(13C315N)-丙氨酸，⑴為丙氨酸， 每個肽的⑵端為其C-端，(Y*)為13Cf^2-賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸，而⑴為13Cf^N2-賴氨酸-丙氨酸或賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸。
在優(yōu)選方案中，χ大于或等于+3道爾頓，或小于或等于-6道爾頓。
在其他實施例中，步驟(e)進一步包括對標示肽離子進行CID分裂獲得二級質譜。 iMSTIQ 方法
在某些實施方案中，每個肽的(1)端為其C-端，而每個肽的(2)端為其N-端。在其他實施方案中，每個肽的(1)端為其N-端，而每個肽的(2)端為其C-端。
所屬領域技術人員意識到(C)、(C*)、⑶和(D)可以使任何合適的化學標記，其任何一個可以含有零個或多個重原子同位素，只要所得的修飾后目標肽和內(nèi)標物質量相同。
在某些iMSTIQ方法的實施方案中，(VII)型結構中的標記(C*)和(D)可能比(V) 和(VI)型結構中的化學標記(C*)和(D)要重。換句話說，當所有(C)或⑶型標記同位素一致時，標示肽中重標記的(Cf)和(D*)同位素含量可能大于修飾后目標肽或內(nèi)標肽中同位素含量。
在iMSTIQ方法的優(yōu)先實施方案中，每個肽的⑴端為其C-端，而每個肽的⑵端為其N-端。
在優(yōu)先實施方案中，每個肽的(1)端為其C-端，(C)和(Cf)各自獨立地為賴氨酸、 賴氨酸-丙氨酸、賴氨酸-mTRAQ或精氨酸或其任何同位素標記變種，而(D)和(D*)則各自獨立地為丙氨酸或mTRAQ或其同位素標記變種。在更優(yōu)先實施方案中，每個肽的(1)端為其C-端，(C)為賴氨酸、賴氨酸-丙氨酸、13C61X-賴氨酸-丙氨酸、賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸、賴氨酸-IiiTRAQJ3C61X-賴氨酸-mTRAQ、賴氨酸-VTRAQ或精氨酸，而(Cf)為13Cf^N2-賴氨酸、13C61X-賴氨酸-丙氨酸、13C61X-賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸、13C61X-賴氨酸-mTRAQ、 13C61X-賴氨酸-VTRAQ或1\-精氨酸。在更優(yōu)先實施方案中，每個肽的(ι)端為其c-端， 每個肽的( 端為其N-端，(C)為賴氨酸、賴氨酸-丙氨酸、13C^N2-賴氨酸-丙氨酸、賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸、賴氨酸-HiTRAQJ3C61X-賴氨酸-mTRAQ、賴氨酸-VTRAQ或精氨酸，(C*) 為13C615N2-賴氨酸、13C615N2-賴氨酸-丙氨酸、13C615N2-賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸、13C615N2-賴氨酸-HITRAQJ3C5I-賴氨酸-VTRAQ或15N4-精氨酸，(D*)為(13C315N)-丙氨酸或源自重同位素 mTRAQ試劑，而(D)為丙氨酸或mTRAQ試劑的輕同位素變種。在其他更優(yōu)先實施方案中，每個肽的⑴端為其C-端，每個肽的⑵端為其N-端，(C)為賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸，⑶ 為丙氨酸，式(V)中的(C*)為13C61X-賴氨酸-丙氨酸，式(VII)中的(Cf)為13Cf^N2-賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸，而(D)為(13C315N)-丙氨酸。
在優(yōu)先實施方案中，每個肽的(1)端為其C-端，(D)和(D*)各自獨立地為賴氨酸、 賴氨酸-丙氨酸、賴氨酸-mTRAQ或精氨酸或其任何同位素標記變種，而(C)和(Cf)則各自獨立地為丙氨酸或mTRAQ或其同位素標記變種。在優(yōu)先實施方案中，每個肽的(1)端為其 N-端，(C*)為(13C315N)-丙氨酸或源自重同位素mTRAQ試劑，而(C)為丙氨酸或mTRAQ試劑的同位素輕變種。在其他更優(yōu)先實施方案中，每個肽的⑴端為其N-端，(C*)為(13C315N)-丙氨酸或源自重同位素mTRAQ試劑，(C)為丙氨酸或mTRAQ試劑的輕同位素變種，每個肽的(2) 端為其C-端，(D)為13C61X-賴氨酸、13C61X-賴氨酸-丙氨酸、"C6I-賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸、13C61X-賴氨酸-HITRAQJ3C61X-賴氨酸-VTRAQ或1X-精氨酸，而⑶為賴氨酸、賴氨酸-丙氨酸、13C61X-賴氨酸-丙氨酸、賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸、賴氨酸-HITRAQJ3C61X-賴氨酸-mTRAQ、賴氨酸-Vtraq或精氨酸。在其他更優(yōu)先實施方案中，每個肽的(ι)端為其 N-端，(C*)為(13C315N)-丙氨酸，(C)為丙氨酸，每個肽的(2)端為其C-端，式(VI)中的 (D)為13C61X-賴氨酸-丙氨酸，式(VII)中的(D)為13Ce1X-賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸， 而⑶為賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸。
在其他實施方案中，iMSTIQ方法中步驟(f)進一步包括對標示肽離子作CID分裂獲得其二級質譜。通用方法
同位素標記的內(nèi)標肽和標示肽的制備重同位素肽可由市售獲得，或可利用重 (輕)同位素標簽試劑，采用標準的多肽合成方法制得。例如，為了在N-端引入重同位素標記，肽可與重同位素標記的活化氨基酸(例如Boc-(13C315N)-Ala)-Osu，參見實例1 ；“Su” 為琥珀酰亞胺)反應，或直接與重mTRAQ 試劑(產(chǎn)于Applied Biosystems，加州，F(xiàn)oster city)反應。輕同位素多肽可由市售或由標準肽合成方法制得。
樣品制備蛋白質樣品由個別蛋白或蛋白混合物組成，可源自諸如細胞提取物、血清或其他體液等任何適當來源。蛋白質通常經(jīng)由胰蛋白酶等適合的蛋白酶，通過標準方法水解而生成一種或多種目標肽，此多肽混合物進一步由C18色譜進行脫鹽。
目標肽的修飾為在C-端引入標記，作為范例，蛋白質樣品可在相應的SILAC培養(yǎng)基中生長制備。SILAC-特異性的培養(yǎng)基如RPMI-1640培養(yǎng)基(產(chǎn)于Caisson Laboratories, 猶他州，North Logan)，含有同位素重或輕標記的氨基酸，例如賴氨酸和精氨酸及其各種重質變種。此外，C-端標記也可在蛋白質樣品水解過程中(之前或之后)進行。為引入N-端標記，水解后的多肽混合物被懸浮于適當緩沖液中，接著用N-端標記試劑(例如輕或重標記的活化氨基酸酯或mTRAQ 試劑)處理。標記試劑上的任何保護基團可用常規(guī)的去保護方法去除。隨后，樣品通常經(jīng)過Cw色譜純化。
液相餼譜-質譜分析已知數(shù)量的MSTIQ標準肽和(或)ITA標示肽與修飾后目標肽混合。添加內(nèi)標物的數(shù)量以等同于修飾后目標肽的數(shù)量為好。然而，因為定量檢測在約 1000倍濃度范圍內(nèi)呈線性關系，所以濃度有效范圍很大。標示肽的添加水平以能夠產(chǎn)生強15烈質譜信號為準，最好是高于噪音約50倍的水平?；旌衔锢肔TQ-Orbitrap 儀器(Thermo Scientific)通過納米色譜串聯(lián)質譜進行分析，也可在液質聯(lián)用(LC-MQ分析前通過強陽離子交換色譜對樣品進行分離。
另外，利用LTQ Orbitrap，肽樣品經(jīng)反相HPLC (Agi lent 1100系列)電噴霧電離 LC-MS 分析。HPLC 柱(75 μ mX 15cm)裝載有 C18 樹月旨(Magic C18 AQ 5 μ m, Michrom BioResources公司，加利福尼亞州奧本)。多肽通過由緩沖液A(0. 1 %甲酸)至緩沖液 B(0. 甲酸，99. 9%乙腈)的濃度梯度來分離8-25%緩沖液B，(ITA實驗)或 53min (MSTIQ和 iMSTIQ 實驗)；25-35%緩沖液B，6min (ITA 實驗)或 IOmin (MSTIQ和 iMSTIQ 實驗)；35-80%緩沖液B，8min (ITA實驗)或IOmin (MSTIQ和iMSTIQ實驗)。應用固定流速350nl/mino
一般來說，通過在400m/z處分辨率為30，000的Orbitrap獲得MSl掃描。除MSTIQ 檢定以外，MS2掃描則利用正常掃描模式通過LTQ獲得，MSTIQ檢定中，MS2掃描通過在 400m/z處分辨率為7，500的Orbitrap獲得。對于每一 Orbitrap MSl掃描而言，在最長不超過500ms時間內(nèi)累積到5 X IO5個離子。對于每一 LTQ MS2掃描而言，最長不超過250ms 時間內(nèi)累積到5X IO3個離子。對于每一 Orbitrap MS2掃描而言，最長不超過1000ms時間內(nèi)累積到2X IO5個離子。CID碰撞能量規(guī)范設置為35%的能量。
在ITA方法中，在列入清單的標示肽m/z的20ppm窗口內(nèi)檢測到離子將觸發(fā)MSTIQ 肽的二級質譜分析。檢測到符合輸入標準的m/z離子時，在遠離標示肽離子的設定m/z離子處獲取MS2掃描。例如，對于帶有+2電荷的標示肽離子而言，其m/z和修飾后目標肽相差4個單位，儀器可設定在比標示肽m/z小4. 5個單位處且位于兩個道爾頓窗口內(nèi)獲取離子。通過精確的質量測量、液相色譜(LC)留柱時間及標示肽單同位素m/z的小峰-1/z單位的存在，很容易在質譜中識別標示肽。這一小峰是由于制備標示肽的重同位素標記試劑中含有微量輕同位素雜質造成的。這些獨一無二的標示肽特征已經(jīng)被實驗觀測到(參見， 例如，實例7b及相關圖)。
肽的鑒定和定量檢測可利用SEQUEST數(shù)據(jù)庫搜索算法，自MS2數(shù)據(jù)中對肽進行鑒定(Eng，J. K.，等人，J. Am. Soc. Mass Spectrom. (1994)5 :976-989).對于定量分析而言，標示肽的洗脫圖譜可用來鑒別正確的MS2掃描以用于量化的目的。其次，獲取修飾后目標肽和內(nèi)標物的所有預定特異性肽的子離子對的離子強度，并測定每一子離子對的豐度比。針對所有子離子對的比值取一平均值。離群值可被檢測到并被除去。就每一特定肽而言，對來自所有MS2掃描所測得的豐度比值，取一平均值即得最終肽比值。
為了計算肽豐度比，每一子離子對強度i可按A=進行計算，同時利用 “絕對差中間值原則”檢測離群值(參見Wilcox，R. R. Introduction to Robust Estimation and Hypothesis Testing,第二版，Elsevier Academic Press, 2005,第 101 頁)如果Xi-Ml > 3. 321*m，則Xi為離群值；常數(shù)3. 321的選擇有5%的機會與從一個正常分布樣品中去除非離群值相吻合，其中 M = HiediankJ 和Hi = MAD(Xi) = 1. 4826*median{| Xi-M|}表示基于樣本中間值絕對偏差的標準差穩(wěn)健估計(R中間值函數(shù))。每個識別肽的最終量化為去除離群值后的平均IxJ。這種“修剪”平均估計具有已知標準差 恭·,其中 為Winsor 化方差(參見Wilcox，supra，第63頁)。最終，只有至少兩個MSTIQ標記子離子對得到了修剪平均值，肽才考慮為“可被量化的”。如果強度大于等于SNR*BG，則認為觀測到MSTIQ離子；除非另外規(guī)定，SNR等于2。某些潛在的MSTIQ碎片對可因為以下三個理由中的一個從量化中去除⑴去除所有b1+和y1+子離子對；(2)去除在另一預定MSTIQ離子士 1. 5Da范圍內(nèi)、含有預定m/zMSTIQ離子的任何子離子對，或預定離子的中性丟失(b-離子，丟失NH3 ； y-離子，丟失H2O)；以及(3)去除任何至少一個MSTIQ離子強度未被觀測到的子離子對。如果一個離子的強度(源自HL或LH)高于背景信號強度，且離子對強度均為非零強度，子離子對通常被視為可量化的。
對于iMSTIQ檢定而言，利用所述的MSTIQ相同條件，獲得定量自動掃描選擇。此外，標示肽離子洗脫圖譜被用來輔助進行掃描選擇。也可提取預定單同位素標示肽離子峰的離子強度(士20ppm)，以及+1/z和-1/z強度峰值。區(qū)分洗脫的標示肽離子與其他離子可基于以下兩個標準。首先，如果預定標示肽離子單同位素峰強度存在0. 05-0. 35x (-1/z峰) 和0.5-1. (+1/z峰)的強度，則認為掃描含有標示肽離子。其次，僅考慮MSl中標示離子強度大于標示離子洗脫峰值的10%而觸發(fā)的MS2掃描。那些不滿足這類具有高強度和共洗脫標示離子條件的MS2掃描將被除去。除了這些差異外，掃描質譜的選擇和定量檢測與 MSTIQ相同。實例7中iMSTIQ研究自動選擇掃描質譜進行分析，而實例8巨噬細胞研究中則依靠完全手動選擇掃描質譜進行分析。實例
以下實例僅作說明本發(fā)明用，而非限制本發(fā)明。 實例1Boc-L-丙氨酸N- 丁二酰亞胺酯(Boc-Ala-OSu)的制備
為了制備輕同位素MSTIQ試劑Boc-Ala-OSu，Boc-丙氨酸(1當量，NovaBiochem 公司)、N-羥基丁二酰亞胺(1當量，Sigma公司，密蘇里州圣路易斯)及N，N' - 二異丙基碳二亞胺(DIC，1當量，Sigma公司)的混合物溶于N，N- 二甲基甲酰胺(DMF，0. 3M，F(xiàn)isher 公司)，室溫下培養(yǎng)過夜。過夜培養(yǎng)后，含有Boc-Ala-OSu的上清液分離后直接使用?；蛘撸?Boc-Ala-OSu 也可購自 Sigma-Aldrich 公司。
重同位素MSTIQ試劑，Boc- (13C315N) -Ala-OSu,可利用上述方法由同位素標記 Boc-(1V315N)-Ala(馬賽諸塞州，安杜佛，Cambridge Isotope Laboratories 公司)制成。實例2用MSTIQ N-端標記試劑進行目標肽的標記
根據(jù)標準方法由巨噬細胞裂解物制備胰蛋白酶肽。
在不斷攪拌中，向0. 5M HEPES緩沖液(pH 8，20 μ L)胰蛋白酶肽(30 μ g)懸浮液中滴加Boc-(13C315N)-Ala-OSu (30 μ L，0. 15M，溶于DMF)。培養(yǎng)；35分鐘后，在不斷攪拌中添加濃鹽酸(45 μ L)對混合物進行處理。室溫下30分鐘后，混合物在冰上冷卻，并用IM Tris 堿(pH 8. 3，50 μ L)處理以去除未反應的MSTIQ試劑。在不停地漩渦震蕩混合下，重復滴加 IM NaOH(5χ 156 μ L)以中和部分酸，直至pH值達3左右。接著利用Cw色譜純化標記肽。實例3MSTIQ標準肽的制備
變化1包含目標肽序列、具有輕同位素C-端賴氨酸標記的肽可通過標準肽化學方法制備或購買(Peptide 2. O Inc.，Chantilly, VA ；Genscript Co.，Scotch Plains, NJ)。 對于本文中所述實驗，可購買到粗制純度水平的輕肽。接著如實例3中所述，通過與重同位素MSTIQ試劑(B0c-(13C315N)-Ala-OSu)反應對肽進行標記并純化。
變化2具有N-端丙氨酸殘基和重同位素C-端13C615N-賴氨酸殘基的MSTIQ標準肽可在市場上購買(Sigma公司；純度> 95% ；同位素含量98% 13C, 98% 15N)。實例4ITA標示肽的制備
如下制備源自目標肽序列、在N-端修飾有重同位素丙氨酸殘基、在C-端修飾有重同位素賴氨酸殘基的示范性ITA標示肽缺乏N-端丙氨酸殘基但擁有C-端重同位素賴氨酸殘基(13C615N)的肽可購自市場(Sigma公司；純度> 95%;同位素含量98% 13C, 98% 15N)。 如實例2所述，通過與同位素重MSTIQ試劑(Boc- (13C315N) -Ala-OSu)反應對肽的N-端進行標記。實例5MSTIQ法定量檢測評估
通過測量小鼠巨噬細胞中蛋白質的相對水平、并將這些測量結果與已知水平進行比較來評估MSTIQ量化。
實例5a 37°C下，RAW264. 7 細胞(ATCC，Manassas, VA)生長在 5% CO2 SILAC 特異性RPMI-1640培養(yǎng)基(猶他州北洛根Caisson實驗室)中，并用10%透析胎牛血清(加利福尼亞州，圣迭戈，Invitrogen公司)Λ% Pen/Strep (Invitrogen公司)、2mM L-谷氨酰胺 anvitrogen公司)以及添加的輕Lys-Arg氨基酸或重Lys (13C^N2)-Arg (15N4)氨基酸進行補充。如下分別批次處理“重” “輕”樣品經(jīng)過五次傳代后，在收獲前4小時，利用IOOng/ ml LPS(Sigma公司)激活細胞。收集的細胞在冰上于25mM HEPESU50mM NaCl、5mM MgCl2, 1% TritonX-100,0. 05% SDSUmM EDTA和蛋白酶抑制劑混合物(Roche)中裂解30分鐘。 4°C下，以18，200g的轉速離心IOmin后，進一步處理之前收集的細胞裂解物上清液，并貯存于-80°C下。利用 lmg/ml(w/v) RapiGest (Waters，Milford, ΜΑ)和 0· SDS (Mediatech, 徹111(1011，￥4)，使細胞裂解物中的蛋白質在951下變性101^11，用51111 TCEP(三(2-羧乙基) 膦，Thermo Scientific，Waltham，ΜΑ)使其在60°C下還原lh，接著利用12. 5mM碘代乙酰胺 (Sigma)在黑暗中進行烷基化，歷時30min。樣品在經(jīng)IOOmM TEAB (三乙基碳酸氫銨，Thermo Scientific)稀釋10倍后，加入測序級修飾胰蛋白酶(Promega)以酶/基質比1 50 (w/ w)消化，37°C下過夜。接著將所得重或輕肽(經(jīng)SILAC在C-端標記過)分別用輕(Δ 0)或重(A4)mTRAQ 試劑(Applied Biosystems公司)進行標記，生成同質量肽。
這兩種同質量肽樣品以1 30、1 IOU 3、1 1、3 UlO 1和30 1的比率進行混合?；旌衔镞M行^-|^/^3分析之前，先在此14洗脫板(Waters)上純化?；旌衔锿ㄟ^基于強度的數(shù)據(jù)依賴性采集(DDA)，并隨后進行X ！ Tandem搜索，對其構成的多肽進行分析識別。應用DDA模式在每個MSl掃描中檢測到的最豐富母離子上進行4次MS2掃描。選擇信號超過500計數(shù)的MSl離子用于CID。使用l.Om/z的分離窗，動態(tài)剔除所選擇的母離子，為期60s。
利用上述X ！ Tandem軟件，在小鼠國際蛋白質指數(shù)(IPI)數(shù)據(jù)庫(v. 3. 56) 對七個數(shù)據(jù)集進行兩次搜索，并加入反相序列作為隨機對照。查詢參數(shù)變化如下在 Cys (+57. 021464)進行固定修飾；對N-端(+144. 1021)和Lys (+144. 1021)上的固定修飾進行一次查詢，以說明 HL 肽修飾；對 N-端(+140. 095)、Lys (+148. 1092)和 Arg (+3. 98814)上的固定修飾進行其他查詢，以說明LH肽修飾。利用TPP軟件處理查詢數(shù)據(jù)，完成肽的鑒定。
使用ISBquant軟件(可自系統(tǒng)生物學研究所索取)，對在七個效價中至少有一個可被高可信度地確定和鑒別的肽(符合胰蛋白酶水解完全模式，不含有不完全酶解位點， 帶有+2和+3價電荷，P^tideftOphet概率> 0. 9)進行定量分析。除了這些正確識別的掃描質譜外，ISBquant也考慮了其他質譜的量化，包括理論和測量m/z均在0. 5單位范圍內(nèi)， 且質譜中觀測到至少有7個HL或7個LH子離子均在背景水平以上的質譜(BG，定義為掃描中所有非零強度的25% )。這使得一些不能超過0. 9的P印tideProphet閾值的肽也可被定量分析。質譜的選擇進一步受到識別最高質量的掃描質譜的限制，而僅比最高質量質譜保留時間小于士 Imin的質譜才可用于量化。出于這個目的，掃描質譜的質量可由觀測到的 HL或LHMSTIQ離子的數(shù)量(數(shù)額較大)來判定；其關系被每一掃描中的中位觀測MSTIQ離子強度破壞。除了自動選擇掃描質譜(應用于圖3)外，ISBquant可以由用戶手動選擇掃描質譜進行定量分析。
此實驗結果如圖3所示。圖3(a)顯示了全MSl掃描，而圖3(b)顯示了一個代表性肽“LWTLVSEQTR”的MS2光譜，其在1 1混合物中被識別。同質量MSTIQ標簽肽對的單同位素峰[M+2H]2+出現(xiàn)在MSl光譜的688. 88m/z處。這個母離子的分裂在MS2光譜中產(chǎn)生了一系列可看做同位素對的b-離子和y-離子。三個有代表性子離子對(b4+、y7+和y9+) 的光譜如放大圖中所示(插圖)。每一子離子對觀測到兩個經(jīng)四個m/z單位隔離的峰，并且正如試驗設計，其相對峰強度約為1 1。
每一效價比列的實驗中HL和LH肽的相對豐度，通過在至少一個效價內(nèi)檢查總計 1080 個明確識別的肽(PeptideProphet ρ 彡 0. 9,FDR ^ 1. 5% )來評估。ISBquant (同質量量化)軟件(系統(tǒng)生物學研究所提供)利用可定量特異性肽子離子對強度，來計算每一肽的豐度比(HL/LH)。每一效價比列中量化的所有肽的比率均歸納在圖3(c)中。在相對豐度的全范圍(1 30至30 1)內(nèi)，觀察到MSTIQ實測比率和預期比率之間線性關系(R2 =0.9992)良好。該方法的準確性由計算中位數(shù)的兩個標準差內(nèi)的個別肽量化直方圖來顯示；50%的量化具有小于等于13%的相對偏差。參見圖3(c)。
這些結果表明，MSTIQ是一個供較寬動態(tài)范圍內(nèi)對復雜混合物中的肽進行準確定量的有效方法。實例6ITA方法對靈敏度改善
將ITA肽檢測方法的靈敏度與列入清單法的靈敏度進行比較。用對預定肽選擇進行MS2分析并識別該肽的能力來評估此方法。
收獲YPD培養(yǎng)基中生長至對數(shù)期的酵母菌株(BW741，Mata, his3Al, leu2A0, metl5 Δ 0,uraS Δ 0)，并用含有蛋白酶抑制劑混合物(Roche公司，德國曼海姆)的裂解緩沖液(50mM HEPES, pH8. 0,1% SDS, 150mMNaCl)中進行裂解。接著將蛋白質提取物進行丙酮沉淀，然后溶于含有IM尿素的IOmM Tris鹽酸緩沖液(pH 8. 0)。接著利用5mM DTT處理蛋白質混合物，隨后利用15mM碘乙酰胺進行烷基化，胰蛋白酶水解過夜。胰蛋白酶水解肽用于質譜分析之前，先經(jīng)Cw離心柱(Nest集團公司，馬薩諸塞州，索斯巴勒)純化。
與小鼠或人類蛋白質相對應的六十五個含有賴氨酸端基的AQUA 肽，經(jīng)6mM甲基硫代磺酸甲酯(MMTS)進行烷基化，接著按照廠家說明，以重(Δ4)或輕(AO)mTRAQ· 試劑 (Applied Biosystems公司)來進行標記，生成具有8Da質量差異的重輕同質量肽。另有二十一賴氨酸端基AQUA 肽(重質形式)及其合成輕質肽變種也包括在內(nèi)。將500fmol 肽重質變種(標示肽)添加至Iyg酵母肽混合物中，而肽輕質變種(“經(jīng)修飾的目標肽”， 用作修飾后目標肽)以在四個實驗中每一個的濃度都不同的較低飛摩爾(fmol)水平添加到樣品中(0. 75,3. 75,7. 5 或 15fmol)。
分別利用LTQ-Orbitrap儀器，通過ITA法或列入清單法對樣品進行分析。對每個 MSl掃描可獲得五個MS2掃描。MS2分析的閾值設置為2，000，對每1個事件動態(tài)剔除設定在10秒，并使用1. lm/z CID分離窗。的用于電荷狀態(tài)檢查僅將帶+2或+3電荷離子進行分析。在列入清單方法中，修飾后目標肽m/z置于原始列入清單上，在此m/z上的離子檢測觸發(fā)了該m/z上離子的分裂。對于ITA來說，將標示肽離子的m/z值置于原始列表上，在此標示離子m/z上的離子檢測也會觸發(fā)此修飾后目標肽m/z上的離子分裂(例如Δπι/ζ ="4m/z單位，帶+2個電荷的離子)。對于帶+2個電荷的離子，“添加/減去”功能設置為 “-4. 0000”;對于帶+3個電荷的離子，則應用“-2. 6667”。利用X ！ Tandem，針對酵母數(shù)據(jù)庫，輔以目標肽序列，對兩次分析數(shù)據(jù)進行搜詢。從每次分析中得到的正確識別的肽如補充表1中所示(FDR < 5% )。
針對酵母菌數(shù)據(jù)庫(yeast, nci. 20080206)，利用X ！ Tandem，輔以目標肽序列， 對所得MS2進行搜詢。應用以下搜詢參數(shù)全胰蛋白酶裂解特異性；質量差前體離子 士20ppm，子離子0. 4Da ；不允許存在漏切位點；在Cys (+45. 9877Da)進行固定修飾，在 Met (+15. 9949) ,Lys (+148. 1092)和N-端(+140. 095)進行差異修飾。利用 Trans Proteomic Pipeline 軟件(TPP, http//tools, proteomecenter. orR/wiki/index, php ？ title = Software :TPP)處理查詢數(shù)據(jù)，完成肽的識別。
如圖4總結，就正確選擇用于MS2分析的目標肽及其明確識別而言，在四個效價試驗中，ITA均較列入清單法更為出色。當分析最低數(shù)量的目標肽時，ITA方法的性能尤為強勁。在含有0.75fmol目標肽的樣本分析中，ITA正確觸發(fā)了 97%目標肽的MS2分析，而列入清單法僅正確地觸發(fā)了肽的MS2分析。這一觸發(fā)方面的改進反映為肽識別率有所改善當分析樣品中含有0.75fmol目標肽時，經(jīng)由ITA法，48%的肽被識別出來，而使用列入清單法則只有19%肽被識別。重要的是，在所有四個實驗中，ITA始終顯示出較高的正確 MS2觸發(fā)率(分別是96. 51%、97. 67%、98. 84%和98. 84%)。這些結果表明ITA確保了目標肽MS2事件的可靠觸發(fā)，并表明ITA顯著改善了肽識別率。實例7iMSTIQ方法定量限的測定
將MSTIQ標記肽摻入分離自人血清的糖肽樣品，來估算iMSTIQ定量極限(LOQ)。
人血清(10mg，137 μ L ；紐約?？怂咕S勒Bioclamation公司)如前所述，用于N-糖肽的基于酰胼的固相捕獲(Tian，Y.，Zhou，Y.，Elliott，S.，Aebersold，R. & Zhang，H. N-連接糖肽的固相提取。Nat Protoc 2,334-339(2007)).所得N-糖肽混合物溶于137 μ 1 0. 甲酸。
實例7a對于目標肽(SQVQASYIFK)而言，如下法所示制備同質量MSTIQ肽對(LH， HL)和標示肽。MSTIQ肽的制備
權利要求
1.樣品中目標肽的定量檢測，包含以下步驟(a)對目標肽作如下修飾用重同位素在 ⑴端作第一標記(A*)，用輕同位素在⑵端作第二標記(B)，由此形成⑴型結構A*-肽-B (I);(b)向樣品中添加內(nèi)標物，其中內(nèi)標物由與目標肽序列相同的多肽組成并經(jīng)如下修飾 用輕同位素在(1)端作第一標記(A)，用重同位素在( 端作第二標記(B*)，形成(II)型結構A-肽-B* (II)，其中，(A*)與㈧之間的質量差異等于(B)與⑶之間的質量差異，以致于內(nèi)標物與修飾后的目標肽質量相等；(c)獲得樣品的一級質譜；(d)識別與修飾后目標肽和內(nèi)標物相對應的一級質譜的離子；(e)對步驟(d)中所識別的修飾后目標肽和內(nèi)標物離子進行CID分裂，獲得其二級質譜；(f)比較修飾后的目標肽子離子和內(nèi)標物子離子的相對強度；(g)基于步驟(f)中的比較，從而量化目標肽。
2.在權利要求項1的方法中，每個肽的⑴端為其C-端，每個肽的⑵端為其N-端。
3.根據(jù)權利要求項1中所述的方法，其中每個肽的(1)端為其N-端，每個肽的(2)端為其C-端。
4.根據(jù)權利要求項1中所述的方法，其中每個肽的⑴端為其C-端，(A)和(A*)各自獨立地為賴氨酸、賴氨酸-丙氨酸、賴氨酸-mTRAQ、或精氨酸或其任何同位素標記變種，而 ⑶和(B)則各自獨立地為丙氨酸或mTRAQ或其同位素標記變種。
5.根據(jù)權利要求項1中所述的方法，其中每個肽的(1)端為其C-端，(A)為賴氨酸、 賴氨酸-丙氨酸、賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸、13C61X-賴氨酸-丙氨酸、賴氨酸-mTRAQ、賴氨酸-VTRAQJ3C61X-賴氨酸-mTRAQ或精氨酸，而QO為13C^N2-賴氨酸、13C^N2-賴氨酸-丙氨酸、13C61X-賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸、13C61X-賴氨酸-mTRAQ、13C61X-賴氨酸-VTRAQ 或 15N4-精氨酸。
6.根據(jù)權利要求項1中所述的方法，其中每個肽的(1)端為其C-端，每個肽的(2)端為其N-端，(A)為賴氨酸、賴氨酸-丙氨酸、賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸、13Cf^N2-賴氨酸-丙氨酸、賴氨酸-mTRAQ、賴氨酸-VTRAQj3C61X-賴氨酸-mTRAQ或精氨酸，(A*)為13C^N2-賴氨酸、13C61X-賴氨酸-丙氨酸、13C61X-賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸、13C61X-賴氨酸-mTRAQ、 13Cf^2-賴氨酸-VTRAQ或15N4-精氨酸，(B*)為(13C315N)-丙氨酸或源自重同位素mTRAQ試劑，而(B)為丙氨酸或mTRAQ試劑的輕同位素變種。
7.根據(jù)權利要求項1中所述的方法，其中每個肽的(1)端為其C-端，㈧為賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸，(A)為13C61X-賴氨酸-丙氨酸，⑶為丙氨酸，而(B)為(13C315N)-丙氨酸。
8.根據(jù)權利要求項1中所述的方法，其中每個肽的⑴端為其N-端，⑶和(B)各自獨立地為賴氨酸、賴氨酸-丙氨酸、賴氨酸-mTRAQ、或精氨酸或其任何同位素標記變種，而 (A)和(A*)則各自獨立地為丙氨酸或mTRAQ或其同位素標記變種。
9.根據(jù)權利要求項1中所述的方法，其中每個肽的⑴端為其N-端，(A*)為 (13C315N)-丙氨酸或源自重同位素mTRAQ試劑，而(A)為丙氨酸或mTRAQ試劑的輕同位素變種。
10.根據(jù)權利要求項1中所述的方法，其中每個肽的⑴端為其N-端，(A*)為(13C315N)-丙氨酸或源自重同位素mTRAQ試劑，(A)為丙氨酸或mTRAQ試劑的輕同位素變種，每個肽的⑵端為其C-端，(B)為賴氨酸、賴氨酸-丙氨酸、賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸、 13C615N2-賴氨酸-丙氨酸、賴氨酸-mTRAQ、賴氨酸-VTRAQj3C61X-賴氨酸-mTRAQ或精氨酸，而(B)為13C6I-賴氨酸、13C61X-賴氨酸-丙氨酸、賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸、 13C615N2-賴氨酸-mTRAQ、1:3C6' 5N2-賴氨酸-VTRAQ 或 15N4-精氨酸。
11.根據(jù)權利要求項1中所述的方法，其中每個肽的⑴端為其N-端，㈧為丙氨酸， (A*)為(13C315N)-丙氨酸，每個肽的⑵端為其C-端，⑶為賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸，而 (B*)為13Cf^N2-賴氨酸-丙氨酸。
12.—種樣品中目標肽的檢測方法，包含以下步驟(a)目標肽作如下修飾在(1)端作第一標記(X)、在(2)端作第二標記(Y)，形成(III)型結構X-肽-Y (III)；(b)向樣品中添加標示肽，其中標示肽由與目標肽同序列的肽作如下修飾而組成在 (1)端作第一標記(X*)、在(2)端作第二標記的，形成(IV)型結構X*-肽-Y* (IV)，其中，(X)、(X*)、(Y)和(Y*)各自獨立地含有正常或至少一個重原子同位素，其中標示肽母離子m/z與目標肽母離子m/z之間的差異X足夠大，以便標示肽母離子的同位素峰落在八個m/z單位之外，或落在目標肽母離子m/z周圍一個較小的CID分離窗之外；(c)獲得樣品的一級質譜；(d)在一級質譜中檢測標示肽離子；(e)通過標示肽離子位于χ道爾頓處的CID分裂，獲得二級質譜；并(f)分析表征目標肽子離子的二級質譜。
13.根據(jù)權利要求項12中所述的方法，其中每個肽的⑴端為其C-端，每個肽的⑵ 端為其N-端。
14.根據(jù)權利要求項12中所述的方法，其中每個肽的⑴端為其N-端，每個肽的⑵ 端為其C-端。
15.根據(jù)權利要求項12中所述的方法，其中(X)和(Y)均為輕同位素。
16.根據(jù)權利要求項15中所述的方法，其中(X*)和(Y*)均為重同位素。
17.根據(jù)權利要求項12中所述的方法，其中每個肽的⑴端為其C-端，⑴為賴氨酸、賴氨酸-丙氨酸、13C^N2-賴氨酸-丙氨酸、賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸、賴氨酸-mTRAQ、 13C61X-賴氨酸-mTRAQ、賴氨酸-Vtraq或精氨酸，而(χ*)為13C61X-賴氨酸、13Cf^N2-賴氨酸-丙氨酸、13C61X-賴氨酸- (13C315N)-丙氨酸、13C61X-賴氨酸-mTRAQ、13C61X-賴氨酸-VTRAQ或1精氨酸。
18.根據(jù)權利要求項12中所述的方法，其中每個肽的⑴端為其C-端，每個肽的⑵端為其N-端，(X)為賴氨酸、賴氨酸-丙氨酸、13C6^N2-賴氨酸-丙氨酸、賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸、賴氨酸-mTRAQ、13C:N2-賴氨酸-mTRAQ、賴氨酸-VTRAQ或精氨酸，(Y)為丙氨酸或 mTRAQ試劑的輕同位素變種，(X)為13C6I-賴氨酸、"C6I-賴氨酸-丙氨酸、13C61X-賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸、13C61X-賴氨酸-mTRAQ、13C^N2-賴氨酸-VTOaQ或15N4-精氨酸，而 (Y*)為(13C315N)-丙氨酸或源自重同位素mTRAQ試劑。
19.根據(jù)權利要求項12中所述的方法，其中每個肽的⑴端為其C-端，每個肽的⑵ 端為其N-端，(X)為13Cf^N2-賴氨酸-丙氨酸或賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸，(Y)為丙氨酸， (X*)為 13C61X-賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸，而(Y*)為(13C315N)-丙氨酸。
20.根據(jù)權利要求項12中所述的方法，其中每個肽的⑴端為其N-端，(X)為 (13C315N)-丙氨酸或源自重同位素mTRAQ試劑，而(X)為丙氨酸或mTRAQ試劑的輕同位素變種。
21.根據(jù)權利要求項12中所述的方法，其中每個肽的⑴端為其N-端，(X)為 (13C315N)-丙氨酸或源自重同位素mTRAQ試劑，(X)為丙氨酸或mTRAQ試劑的輕同位素變種， 每個肽的⑵端為其C-端，(Y*)為13Cf^2-賴氨酸、13C61X-賴氨酸-丙氨酸、13C61X-賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸、13C61X-賴氨酸-mTRAQ、13C^N2-賴氨酸-VTRAQ或15N4-精氨酸，而 (Y)為賴氨酸、賴氨酸-丙氨酸、13C^N2-賴氨酸-丙氨酸、賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸、賴氨酸-mTRAQ、13Cf^N2-賴氨酸-mTRAQ、賴氨酸-VTRAQ或精氨酸。
22.根據(jù)權利要求項12中所述的方法，其中每個肽的⑴端為其N-端，(X)為 (13C315N)-丙氨酸，⑴為丙氨酸，每個肽的(2)端為其C-端，(Y*)為13C61X-賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸，而⑴為13Cf^N2-賴氨酸-丙氨酸或賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸。
23.根據(jù)權利要求項12中所述的方法，其中χ大于等于+3道爾頓，或小于等于-6道爾頓。
24.根據(jù)權利要求項12中所述的方法，其中步驟(e)也包括對標示肽離子進行CID分裂而獲得其二級質譜。
25.一種樣品中目標肽的分析方法，包含以下步驟(a)目標肽作如下修飾在(1)端作重同位素第一標記(C*)并在(2)端作輕同位素第二標記(D)，形成(V)型結構C*-肽-D (V)；(b)向樣品中添加內(nèi)標物，其中內(nèi)標物由與目標肽同序列的肽經(jīng)如下修飾組成(1)端作輕同位素第一標記(C)、(2)端作重同位素第二標記(D*)，形成(VI)型結構C-肽-D* (VI)，其中Cf與C之間的質量差異等于D*與D之間的質量差異，以致于內(nèi)標物與修飾后目標肽質量相同；(c)向樣品中添加標示肽，其中標示肽由與目標肽同序列的肽組成并作如下修飾(I)在端⑴作重同位素標記(C*)并在(2)端作重同位素標記(D)，形成(VII)型結構Cf-肽-D* (VII)；或(II)在(1)端作輕同位素標記(C)并在在(2)端作輕同位素標記(D)，形成(VIII)型結構C-肽-D (VIII)；其中標示肽母離子m/z與目標肽母離子m/z之間的差異χ足夠大，以便標示肽母離子的同位素峰落在八個m/z單位之外或落在目標肽母離子m/z周圍的一個較小CID ； (e)在一級質譜中檢測標示肽離子；(f)對比標示肽母離子小χ個m/z單位的離子進行CID分裂，獲得其二級質譜；(g)分析表征修飾后目標肽子離子的二級質譜；(h)比較修飾后目標肽子離子與內(nèi)標物子離子的相對強度；(i)基于步驟(h)中的比較對目標肽進行量化。
26.根據(jù)權利要求項25中所述的方法，其中每個肽的(1)端為其C-端，每個肽的(2) 端為其N-端。
27.根據(jù)權利要求項1中所述的方法，其中每個肽的⑴端為其C-端，(C)和(Cf)各自獨立地為賴氨酸、賴氨酸-丙氨酸、賴氨酸-mTRAQ、或精氨酸或其任何同位素標記變種， 而(D)和(D)則各自獨立地為丙氨酸或mTRAQ或其任何同位素標記變種。
28.根據(jù)權利要求項25中所述的方法，其中每個肽的(1)端為其C-端，(C)為賴氨酸、賴氨酸-丙氨酸、13C^N2-賴氨酸-丙氨酸、賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸、賴氨酸-mTRAQ、 13C61X-賴氨酸-mTRAQ、賴氨酸-VTRAQ或精氨酸，而(Cf)為13C61X-賴氨酸、13Cf^N2-賴氨酸-丙氨酸、13C61X-賴氨酸- (13C315N)-丙氨酸、13C61X-賴氨酸-mTRAQ、13C61X-賴氨酸-VTRAQ或1精氨酸。
29.根據(jù)權利要求項25中所述的方法，其中每個肽的⑴端為其C-端，每個肽的⑵端為其N-端，(C)為賴氨酸、賴氨酸-丙氨酸、13C61X-賴氨酸-丙氨酸、賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸、賴氨酸-mTRAQ、13C^N2-賴氨酸-mTRAQ、賴氨酸-VTRAQ或精氨酸，(Cf)為13Cf^N2-賴氨酸、13C61X-賴氨酸-丙氨酸、13C61X-賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸、13C61X-賴氨酸-mTRAQ、 13C515N2-賴氨酸-VTRAQ或15N4-精氨酸，(D*)為(13C315N)-丙氨酸或源自重同位素mTRAQ試劑，而(D)為丙氨酸或mTRAQ試劑的輕同位素變種。
30.根據(jù)權利要求項25中所述的方法，其中每個肽的(1)端為其C-端，每個肽的(2) 端為其N-端，(C)為賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸，⑶為丙氨酸，(V)型結構中的(Cf)為 13C61X-賴氨酸-丙氨酸，(VII)型結構中的(Cf)為13C61X-賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸，(D) 為(13C315N)-丙氨酸。
31.根據(jù)權利要求項25中所述的方法，其中每個肽的⑴端為其C-端，⑶和(D)各自獨立地為賴氨酸、賴氨酸-丙氨酸、賴氨酸-mTRAQ、或精氨酸或其任何同位素標記變種， 而(C)和(Cf)則各自獨立地為丙氨酸或mTRAQ或其任何同位素標記變種。
32.根據(jù)權利要求項25中所述的方法，其中每個肽的⑴端為其N-端，(C)為 (13C315N)-丙氨酸或源自重同位素mTRAQ試劑，而(C)為丙氨酸或mTRAQ試劑的輕同位素變種。
33.根據(jù)權利要求項25中所述的方法，其中每個肽的⑴端為其N-端，(C)為 (13C315N)-丙氨酸或源自重同位素mTRAQ試劑，(C)為丙氨酸或mTRAQ試劑的輕同位素變種， 每個肽的⑵端為其C-端，(D)為13Cf^2-賴氨酸、13C61X-賴氨酸-丙氨酸、13C61X-賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸、13C61X-賴氨酸-mTRAQ、13C^N2-賴氨酸-VTRAQ或15N4-精氨酸，而 (D)為賴氨酸、賴氨酸-丙氨酸、13C^N2-賴氨酸-丙氨酸、賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸、賴氨酸-mTRAQ、13Cf^N2-賴氨酸-mTRAQ、賴氨酸-VTRAQ或精氨酸。
34.根據(jù)權利要求項25中所述的方法，其中每個肽的⑴端為其N-端，(C)為 (13C315N)-丙氨酸，(C)為丙氨酸，每個肽的(2)端為其C-端，(VI)型結構中的(D)為 13C^N2-賴氨酸-丙氨酸，(VII)型結構中的(D*)為13C61X-賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸，而 ⑶為賴氨酸-(13C315N)-丙氨酸。
35.根據(jù)權利要求項25中所述的方法，其中步驟(f)也包括對標示肽離子進行CID分裂而獲得其二級質譜。
全文摘要
樣品中肽的質譜量化方法，其中改良包含提供經(jīng)同位素在N-端和C-端進行標記的內(nèi)標肽。
文檔編號C07H21/02GK102510903SQ201080025558
公開日2012年6月20日 申請日期2010年4月14日 優(yōu)先權日2009年4月14日
發(fā)明者嚴威, 杰夫瑞涅西, 羅杰 申請人:系統(tǒng)生物學研究所