分子成像和相關(guān)方法
【專利說明】
[0001] 本申請要求享有以下提交于2013年3月6日、編號61/851,276的美國臨時(shí)專利 申請的權(quán)利，通過引用的方式包括在本申請中。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及單個(gè)分子成像，或單個(gè)分子的一個(gè)或多個(gè)集合，以及與成像相關(guān)的方 法。
【背景技術(shù)】
[0003] 曾有報(bào)道介紹過以約300納米的分辨率在極小的區(qū)域（即，小于lOnmxlOOnm的區(qū) 域）檢測單個(gè)分子的方法。例如熒光原位雜交（FISH)是一種測量基因表達(dá)的方法，這種方 法足夠敏感，可以檢測單個(gè)mRNA分子。正如辛格最初的描述，該方法涉及五支寡核苷酸探 針對每個(gè)mRNA目標(biāo)同時(shí)雜交。費(fèi)米諾AM、費(fèi)伊FS、福格蒂K、辛格RH。單個(gè)RNA原位轉(zhuǎn)錄 之可視化?！犊茖W(xué)》。1998;280:585-590。所述寡核苷酸各長約50個(gè)核苷酸，且各標(biāo)有多達(dá) 五個(gè)熒光團(tuán)。于是在熒光顯微鏡下，mRNA目標(biāo)在雜交時(shí)變?yōu)榭梢姷难苌錁O限熒光斑點(diǎn)。
[0004] 拉吉已經(jīng)研制出了改良的FISH方法。見拉吉A、范登包革P、里夫金SA、范奧德 納爾德A、特亞吉S。使用多個(gè)單標(biāo)記探針使單個(gè)mRNA分子成像?！蹲匀环椒▽W(xué)》，2008 ;5 ; 877-879。該方法使用了大量單獨(dú)標(biāo)記探針代替數(shù)量有限但多重標(biāo)記的探針，用于克服辛 格的原始FISH步驟所造成的若干問題：大量標(biāo)記的寡核苷酸難以合成及純化；當(dāng)某些熒光 團(tuán)以多份拷貝存在于同一寡核苷酸中時(shí)，發(fā)生自淬滅；信號易于變性。見費(fèi)米諾AM、福格蒂 K、利弗席茲LM、卡林頓W、辛格RH。原位mRNA單個(gè)分子可視化?！睹笇W(xué)方法》。2003:361; 245-394。另見蘭多夫JB、瓦格納AS。多重標(biāo)記的熒光DNA探針之穩(wěn)定性、特異性和熒光亮 度?！逗怂嵫芯俊?。1997;25;2923-2929.拉吉改良后的方法能生成可被識別的均勻信號，提 供極小的視場中mRNA準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，而探針的產(chǎn)生和純化比較簡單。
[0005] 盡管有辛格和拉吉等科學(xué)家開展的研究工作，在本領(lǐng)域仍存在改進(jìn)分子成像和相 關(guān)方法的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 在方法方面，本發(fā)明提供了單分子成像的方法。該方法包括以下步驟：a)將測試 樣品暴露給探針，其中所述探針包含特異結(jié)合至靶分子的第一部分，以及因與以一個(gè)或多 個(gè)波長的光相互作用的一個(gè)或多個(gè)化學(xué)基團(tuán)而可檢測的第二部分，其中所述探針與靶分子 結(jié)合，形成復(fù)合物；b)將復(fù)合物暴露給與所述一個(gè)或多個(gè)化學(xué)基團(tuán)相互作用的光的一個(gè)或 多個(gè)波長，及；c)與所述一個(gè)或多個(gè)化學(xué)基團(tuán)相互作用的光，檢測與其一個(gè)或多個(gè)波長相 互作用而形成的結(jié)果，生成一個(gè)或多個(gè)單分子的影像。該影像在至少IX 105平方微米的成 像區(qū)域上具有高于450納米的分辨率，且其中影像通過一個(gè)單一檢測步驟便可得到，而無 需改變?nèi)魏螜z測設(shè)置。
[0007] 在方法的另一方面，本發(fā)明提供了單分子成像的方法。該方法包括以下步驟：a) 將測試樣品暴露給探針，其中所述探針包含特異結(jié)合至目標(biāo)分子的第一部分，以及經(jīng)過改 性而包含與一個(gè)或多個(gè)波長的光相互作用的一個(gè)或多個(gè)化學(xué)基團(tuán)的第二部分，其中所述探 針與目標(biāo)分子結(jié)合，形成復(fù)合物；b)將探針第二部分改性，使之包含與光相互作用的一個(gè) 或多個(gè)化學(xué)基團(tuán)；c)將復(fù)合物暴露給與所述一個(gè)或多個(gè)化學(xué)基團(tuán)相互作用的光的一個(gè)或 多個(gè)波長，及d)與所述一個(gè)或多個(gè)化學(xué)基團(tuán)相互作用的光，檢測與其一個(gè)或多個(gè)波長相互 作用而形成的結(jié)果，生成一個(gè)或多個(gè)單分子的影像。該影像在至少IX 105平方微米的成像 區(qū)域上具有高于450納米的分辨率，且其中影像通過一個(gè)單一檢測步驟便可得到，而無需 改變?nèi)魏螜z測設(shè)置。
【附圖說明】
[0008] 圖1示出了 SA0成像裝置的一種實(shí)施例。
[0009] 圖2A示出了SA0成像裝置的另一種實(shí)施例。
[0010] 圖2B示出了根據(jù)一個(gè)實(shí)施例的SA0成像裝置光照模式產(chǎn)生模塊的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。
[0011] 圖2C示出了根據(jù)另一種實(shí)施例的SA0成像裝置光照模式產(chǎn)生模塊的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。
[0012] 圖3示出了 SA0 -般方法。
[0013] 圖4不出了視場直徑26mm光學(xué)顯微鏡的視場直徑和面積表。
[0014] 圖5示出了光波長對固定數(shù)值孔徑（0. 95)分辨率的影響表。
[0015] 圖6不出了使用標(biāo)準(zhǔn)焚光顯微鏡為一個(gè)mRNA或若干mRNA成像的一種方法以及本 發(fā)明介紹的使用包含有SA0成像裝置為一個(gè)mRNA或若干mRNA成像的相反方法。
[0016] 圖7顯示了TOPI mRNA(亮/白/綠點(diǎn)）SA0圖像的一部分，圖像區(qū)域含有大約100 個(gè)細(xì)胞。
[0017] 圖8顯示了 TOP 1 mRNA之SA0圖像感興趣區(qū)之選擇，包括有基于斑點(diǎn)強(qiáng)度和質(zhì)量 的選擇過程。
[0018] 圖9顯示了 MCF7人乳腺癌細(xì)胞系HER2mRNA(亮/白點(diǎn)）相關(guān)的SA0圖像。圖中 顯示了含有超過1〇〇個(gè)細(xì)胞的圖像區(qū)域，并伴有成像細(xì)胞截面圖像，含有約20個(gè)細(xì)胞。就 所述20個(gè)細(xì)胞之圖像，根據(jù)所示情況，平均每個(gè)細(xì)胞包括約72份HER2mRNA。
[0019] 圖10顯示了標(biāo)準(zhǔn)熒光顯微鏡（60倍/l. 41NA0. 1油）下來自A549細(xì)胞的 FKBP5mRNA兩份相關(guān)圖像（亮/白點(diǎn)）。標(biāo)有"減地塞米松"的圖像顯示了加入24納米的 地塞米松（大約13個(gè)細(xì)胞）進(jìn)行上調(diào)之前的細(xì)胞；標(biāo)有"加地塞米松"圖像顯示了加入24 納米的地塞米松8小時(shí)（約14細(xì)胞）后的細(xì)胞。
[0020] 圖11顯示了使用由SA0成像設(shè)備（20倍）組成的系統(tǒng)而獲取的來自A549細(xì)胞的 FKBP5mRNA(亮/白點(diǎn)）兩份有關(guān)圖像（完整圖像的1/10)。標(biāo)有"減地塞米松"的圖像顯 示了加入24納米的地塞米松（50個(gè)細(xì)胞以上）進(jìn)行上調(diào)之前的細(xì)胞；標(biāo)有"加地塞米松" 圖像顯示了加入24納米的地塞米松8小時(shí)（50細(xì)胞以上）后的細(xì)胞。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 本發(fā)明涉及單個(gè)分子成像，或單個(gè)分子的一個(gè)或多個(gè)集合，以及與成像相關(guān)的方 法。
[0022] 單分子成像的方法通常包括以下步驟：1)將測試樣品（即生物體、外來體、組織或 細(xì)胞）暴露給探針-其中探針包括一個(gè)特異結(jié)合至目標(biāo)分子（即RNA、蛋白質(zhì)、小分子）的 一個(gè)部分以及因與以一個(gè)或多個(gè)波長的光相互作用的一個(gè)或多個(gè)化學(xué)基團(tuán)而可檢測的一 個(gè)部分或改性后可包含與一個(gè)或多個(gè)波長的光相互作用的一個(gè)或多個(gè)化學(xué)基團(tuán)的一個(gè)部 分-探針與目標(biāo)分子結(jié)合，形成復(fù)合物；2)將復(fù)合物暴露給與所述一個(gè)或多個(gè)化學(xué)基團(tuán)相 互作用的光的一個(gè)或多個(gè)波長；3)與所述一個(gè)或多個(gè)化學(xué)基團(tuán)相互作用的光，檢測與其一 個(gè)或多個(gè)波長相互作用而形成的結(jié)果，生成一個(gè)或多個(gè)單分子的影像，其中該成像系統(tǒng)只 需單個(gè)檢測步驟便可在至少為1 X 105平方微米的成像區(qū)域上提供的檢測分辨率高于450 納米（即，采集的單組數(shù)據(jù)，而無需變更任何檢測設(shè)置（即，光學(xué)器件和攝像機(jī)都不動）），從 而使單個(gè)分子或單個(gè)分子集合成像。所述成像系統(tǒng)通常為一個(gè)具有合成孔徑光學(xué)作用（SAO 成像）或熒光偏振功能的裝置而組成的系統(tǒng)。
[0023] "SA0成像"是指利用一組模式化或結(jié)構(gòu)化的光照模式來照亮成像目標(biāo)，以實(shí)現(xiàn)超 過成像裝置（即鏡頭和相機(jī)）物理限制的分辨率的一種光學(xué)成像方法。在SA0成像方法中， 成像目標(biāo)有選擇性地激發(fā)，以檢測目標(biāo)的空間信息。由于在頻率（或傅立葉）域和目標(biāo)域 之間存在一對一的關(guān)系，SA0可以通過獲取其空間頻率信息而重構(gòu)原始成像目標(biāo)。
[0024] 參見2010年3月19日提交的12/728110美國專利申請，其名稱為"使用最低選擇 性激發(fā)模式的合成孔徑光學(xué)成像方法"，在此通過引用而并入本文。
[0025] "熒光偏振"指的是熒光團(tuán)發(fā)射出的光具在不同偏振軸上強(qiáng)度不相等的現(xiàn)象。對于 本文所討論的顯微鏡應(yīng)用情況，熒光偏振在照明光的路徑中及在裝置的成像/相機(jī)部分之 前采用偏振器。例如參見洛闊威克茲J.R.，2006?！稛晒夤庾V原理》（第3版，施普林格，第 10-12章）。另見，瓦勒、伯納德。2001。《分子熒光原理與應(yīng)用》威利-VCH，第29頁。
[0026] 圖1示出了SA0成像裝置的一種實(shí)施例。該裝置是一種多光束對光學(xué)掃描器。掃 描儀優(yōu)點(diǎn)突出，因?yàn)樗軐?shí)現(xiàn)并行數(shù)據(jù)采集，大大提高了掃描的采集速度。對于以n個(gè)光束 為結(jié)構(gòu)的掃描儀，并行數(shù)據(jù)的采集程度以及較已知光學(xué)掃描器的采集速度提高程度按n的 平方提高。其假設(shè)為，已知光學(xué)掃描儀的采集速度受樣品或的單個(gè)光束對的機(jī)械旋轉(zhuǎn)的速 度所限制。
[0027] 在一個(gè)實(shí)施例中，所述多個(gè)光束對光學(xué)掃描器10包括對準(zhǔn)樣品16的n個(gè)源光束 (一般編號為14)的圓弧12,其中n等于十時(shí)圓弧12為一個(gè)圓。上述n個(gè)源光束14可會 相序不同或光頻不同。每對n個(gè)源光束14之間的相序或頻率差14'，應(yīng)選為與其它n個(gè)源 光束14對相序或頻率差中不同。n個(gè)源光束14在空間20中重疊。檢測器18檢測以對應(yīng) 于該光束對的相序或頻率差的唯一相序或載波頻率而編碼的圓弧12內(nèi)各多光束對信息的 信號。
[0028] n個(gè)源光束14在空間20中重疊，與樣本16相互作用，而利用通過空間20的n個(gè) 源光束14的所述多個(gè)光束對光學(xué)掃描器10的檢測器信號可利用本領(lǐng)域中已知方法計(jì)算。 參見美國專利6016196,在此通過引用而并入本文。
[0029] 圖2A示出了根據(jù)一個(gè)實(shí)施例用于選擇性地激發(fā)分子的SA0成像裝置（結(jié)構(gòu)化照 明裝置）。圖2A中所示的照明裝置僅僅是示范性的，并且可以根據(jù)本發(fā)明對SA0照明裝置 的結(jié)構(gòu)進(jìn)行各種修改。為了便于說明，圖2A中的照明裝置示例僅顯示了兩個(gè)干涉模式生成 模塊（IPGM)112和113,但對于某些應(yīng)用，IPGM的數(shù)目不止兩個(gè)。每個(gè)IPGM采用的是模塊 化形式，并且配置成以給定的間距和方位生成選擇性的激發(fā)模式，與k空間采樣點(diǎn)一個(gè)共 輒對相對應(yīng)。因此，IPGM和給定間距和方位的2-D正弦選擇性激發(fā)模式存在一對一的關(guān)系， 與k空間采樣點(diǎn)一個(gè)共輒對亦對應(yīng)。若干（N)選擇性激發(fā)模式則需要SAO照明裝置中若干 IPGM〇
[0030] 結(jié)構(gòu)化照明裝置100產(chǎn)生多個(gè)相互相干的激光束，激光束的干擾產(chǎn)生干涉模式。 這種干涉模式投射到固定細(xì)胞基底104,選擇性地激發(fā)觀測102下的細(xì)胞和分子。出于多種 原因，使用多個(gè)激光束的干涉產(chǎn)生的干涉模式具有優(yōu)點(diǎn)。例如這樣能實(shí)現(xiàn)高分辨率激發(fā)模 式，同時(shí)具有極大的F0V (視場）和D0F (景深）。雖然在本文中以為成像分子產(chǎn)生激發(fā)模式 為例描述了圖2的結(jié)構(gòu)化照明裝置，但是應(yīng)該指出的是，圖2的結(jié)構(gòu)化照明設(shè)備A可用于任 何其它類型的應(yīng)用，為任何其他類型的目標(biāo)成像產(chǎn)生激發(fā)模式。
[0031] 參照圖2A，結(jié)構(gòu)化照明裝置100包括一個(gè)激光器102、一個(gè)分束器104、快門 105/107,光纖耦合器108、109, 一對光纖110、111 (也可以使用自由光束架構(gòu)，提供激光束 或任何其它合適的方法）和一對干涉模式生成模塊（IPGMs) 112、113。如上所述，IPGM 112、 113各自生成一個(gè)與k-空間采樣點(diǎn)共輒對相對應(yīng)的干涉模式（選擇性的激發(fā)模式）。激光 器102的光束103被分束器104分成兩道光束140和142。一對高速快門105和107是用 來分別"啟動"或"關(guān)閉"光束140和142的，或分別調(diào)節(jié)光束140和142的振幅。所述開關(guān) 啟閉激光束通過光纖耦合器109和108耦合接入保偏光纖111和110。光纖111和110分 別連接對應(yīng)的干涉模式生成模塊113和112。所述干涉模式生成模塊113包括一個(gè)準(zhǔn)直透 鏡114'、一個(gè)分束器116'、和一塊平移鏡118'，同樣地，所述干涉模式生成模塊112包括 一個(gè)準(zhǔn)直透鏡114, 一個(gè)分束器116,和一塊平移鏡118。
[0032] 出自光纖110的光束144經(jīng)準(zhǔn)直透鏡114校準(zhǔn)，被分束器116分成兩道光束124 和126。平移鏡118通過致動器120平移，改變光束126的光路長度。因此，在兩道激光束 124和126的重疊區(qū)域之間，在襯底204上生成干涉模式122,而該模式的相位通過改變光 束之一的光路長度126而改變（即，通過使用平移反射鏡118調(diào)制光束126的光相位）。
[0033] 類似地，出自光纖111的光束146經(jīng)準(zhǔn)直透鏡114'校準(zhǔn)，被分束器116'分成兩 道光束128和130。平移鏡118'通過致動器120'平移，改變光束128的光路長度。因此， 在兩道激光束128和130的重疊區(qū)域之間，在襯底104上生成干涉模式122,而該模式的相 位通過改變光束之一的光路長度128而改變（即，通過使用平移反射鏡118'調(diào)制光束128 的光相位）。
[0034] 如圖2A所示，IPGM112和113根據(jù)本文的實(shí)施例以模塊形式實(shí)施，而IPGM產(chǎn)