專利名稱：：一種用于激活微生物體內(nèi)光敏蛋白的裝置及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及ー種用于激活微生物體內(nèi)光敏蛋白的裝置及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：基于光敏蛋白的超分辨率顯微成像技術(shù)是最近幾年才發(fā)現(xiàn)的一種分辨率可以達(dá)到納米級(jí)別、且優(yōu)于激光共聚焦的單分子成像技木。該技術(shù)的原理是通過(guò)激光將原本不呈現(xiàn)熒光(或不釋放光子)的蛋白進(jìn)行激活，激活后的蛋白可以釋放光子信號(hào)，然后采用光激活定位顯微技術(shù)PALM(Photoactivatablelocalizationmicroscopy)或STORM(Stochasticopticalreconstructionmicroscopy)捕捉光子信號(hào)。這些光敏蛋白其實(shí)是對(duì)普通的熒光蛋白進(jìn)行突變修飾，修飾后的蛋白不產(chǎn)生熒光或者不釋放光子，只有用405nm激光激發(fā)后才能產(chǎn)生熒光(即釋放光子)或者發(fā)生光轉(zhuǎn)換(即從一種顏色的熒光轉(zhuǎn)變成另外ー種顏色)。目前已經(jīng)報(bào)道的可以被405nm激光激活的光敏特征的蛋白有PAGFP、PATag-RFP、PAmCherry、mKO、YPet、mEos2(G)、Emerald、Cerulean等。Zeiss和Nikon目前已有商業(yè)化的光激活定位顯微鏡出售，價(jià)格是激光共聚焦顯微鏡的數(shù)倍，目前在國(guó)內(nèi)還沒(méi)有普及，但是作為新一代超分辨率三維成像技木，必定代表將來(lái)顯微成像技術(shù)的發(fā)展方向。由于光激活定位顯微鏡采用的是對(duì)光子信號(hào)進(jìn)行捕捉，只有對(duì)光子捕捉到一定數(shù)量之后，才能實(shí)現(xiàn)三維成像，因此從樣品上機(jī)到完成圖像采集，通常需要2-3個(gè)小時(shí)甚至更長(zhǎng)。因此，對(duì)于含有光敏蛋白基因的重組細(xì)菌，這些蛋白在細(xì)菌內(nèi)能否正確表達(dá)、能否呈現(xiàn)熒光、能否釋放光子等，在進(jìn)行PALM分析之前實(shí)驗(yàn)者是不清楚的。從實(shí)驗(yàn)者的角度考慮，其更關(guān)心的是樣品被405nm激光激發(fā)之后必須呈現(xiàn)熒光。對(duì)于雖經(jīng)過(guò)激光激發(fā)也不呈現(xiàn)任何熒光、或者激發(fā)后不發(fā)生熒光轉(zhuǎn)換的樣品都是無(wú)效樣品。這提示光敏蛋白在微生物內(nèi)沒(méi)有表達(dá)；或者雖然表達(dá)，但是蛋白結(jié)構(gòu)已經(jīng)發(fā)生變化，不再具有光敏蛋白的特性，也無(wú)法進(jìn)行PALM分析。對(duì)于這些無(wú)效的樣品，如果直接用PALM分析，從時(shí)間和資源的角度考慮是ー種巨大浪費(fèi)，也大大減少了激光器的壽命。因此，研究者希望能夠通過(guò)一個(gè)簡(jiǎn)單的裝置，在PALM分析之前，借助普通的熒光顯微鏡對(duì)樣品是否具有光敏特征做出初步判斷。由于光敏蛋白必須經(jīng)過(guò)405nm激光激發(fā)后才能呈現(xiàn)熒光，對(duì)于生長(zhǎng)于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板或者平皿的細(xì)菌，直接用激光器發(fā)射的激光激發(fā)是不可能的，也是不現(xiàn)實(shí)的。因?yàn)榧す馄魇欠浅＞艿母邇r(jià)值儀器，開(kāi)機(jī)時(shí)間具有使用壽命限制，不允許反復(fù)多次開(kāi)啟；而且激光器發(fā)射的激光束為不足I_2的聚焦點(diǎn)，顯然對(duì)于96孔培養(yǎng)板(87x126mm)和圓形培養(yǎng)皿(d=86mm)是不合適的。激光器發(fā)射的激光只能聚焦于顯微鏡鏡頭下方的微小視野。因此，如何研發(fā)ー種可以替代激光器，且能發(fā)射405nm光譜的輔助裝置尤為必要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供ー種用于激活微生物體內(nèi)光敏蛋白的裝置及應(yīng)用。是將特殊的微型紫外發(fā)光二極管(波峰為405nm)通過(guò)印刷電路板(即PCB板)焊接在一起，制作成與實(shí)驗(yàn)室96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(或者96孔酶標(biāo)板、方形培養(yǎng)皿)或圓形培養(yǎng)皿形狀一致的裝置。該裝置通過(guò)紫外光對(duì)培養(yǎng)的細(xì)菌菌液或者菌落表達(dá)的蛋白進(jìn)行激發(fā)，進(jìn)而使細(xì)菌表達(dá)的蛋白發(fā)出光子信號(hào)，呈現(xiàn)熒光或者發(fā)生熒光轉(zhuǎn)換。細(xì)菌發(fā)出的光子信號(hào)可以被特殊的光激活定位顯微鏡捕捉，從而實(shí)現(xiàn)分辨率為納米級(jí)別的單分子成像和特定蛋白精確定位。為解決技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的解決方案是提供ー種用于激活微生物體內(nèi)光敏蛋白的裝置，包括外接的電源轉(zhuǎn)換器；該裝置的主體結(jié)構(gòu)是ー張印刷電路板，印刷電路板上布設(shè)若干個(gè)完全相同的紫外發(fā)光二極管，各發(fā)光二極管和輔助電子元件通過(guò)印刷電路板實(shí)現(xiàn)連接；每個(gè)發(fā)光二極管的發(fā)射波長(zhǎng)為395415nm，波峰為405nm，正向?qū)妷簽?.5V，功率為10-40mW，輻射角度為30度，ニ極管直徑小于6mm。本發(fā)明中，所述印刷電路板呈正方形，紫外發(fā)光二極管的數(shù)量為96個(gè)，發(fā)光二極管布局為8X12的方形矩陣形式，且每個(gè)紫外燈泡的位置均與96孔酶標(biāo)板上的孔的位置相互對(duì)應(yīng)。本發(fā)明中，所述印刷電路板呈圓形，紫外發(fā)光二極管的數(shù)量為4964個(gè)，發(fā)光二極管布局為圓形矩陣形式，且最外圈的ニ極管所構(gòu)成的圓的直徑小于圓形培養(yǎng)皿的直徑。本發(fā)明中，所述外接的電源轉(zhuǎn)換器是提供524V電壓、660mA電源的電源轉(zhuǎn)換器。作為進(jìn)ー步的發(fā)明目的，本發(fā)明還提供了前述裝置在進(jìn)行PALM分析之前檢驗(yàn)含有光敏蛋白基因的重組細(xì)菌是否具有光敏特征的應(yīng)用，以及所述的裝置在細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域關(guān)于光敏蛋白激發(fā)和熒光蛋白顔色轉(zhuǎn)換中的應(yīng)用。本發(fā)明中裝置的應(yīng)用包括以下步驟在進(jìn)行PALM分析之前，將含有光敏蛋白基因的重組細(xì)菌置于96孔酶標(biāo)板或圓形培養(yǎng)皿中，然后將所述裝置對(duì)應(yīng)地?cái)R置于96孔酶標(biāo)板或圓形培養(yǎng)皿上，接通電源I分鐘，對(duì)重組細(xì)菌進(jìn)行光激活；通過(guò)熒光顯微鏡觀察重組細(xì)菌是否呈現(xiàn)熒光或者熒光轉(zhuǎn)換，確定其是否具有光敏特性。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明可以直接用于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板或者圓形平皿中細(xì)菌的光激發(fā)，僅需要Imin光激發(fā)時(shí)間，即可通過(guò)普通的熒光顯微鏡對(duì)培養(yǎng)板或者平板上的細(xì)菌是否具有光敏特性進(jìn)行判定。對(duì)于生長(zhǎng)于試管和三角瓶等容器中液體培養(yǎng)基的細(xì)菌，待生長(zhǎng)結(jié)束后根據(jù)需要直接轉(zhuǎn)移入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(或者酶標(biāo)板)即可。該裝置適用于表達(dá)光敏蛋白的所有微生物，只要光敏蛋白對(duì)405nm紫外光敏感，均可以使用該裝置，如PAGFP、PATag-RFP、PAmCherry、mKO、YPet、mEos2(G)、Emerald、Cerulean等。相對(duì)于
背景技術(shù)：
，本發(fā)明具有高效、簡(jiǎn)捷、快速、方便、適用廣等特點(diǎn)。圖I為本發(fā)明所述方形(96孔)光激活裝置示意圖。尺寸說(shuō)明是為了幫助設(shè)計(jì)印刷線路板中各個(gè)發(fā)光二極管的排列和間距，其中外周長(zhǎng)X外周寬=126x87mm;內(nèi)周長(zhǎng)X內(nèi)周寬=108x72mm，發(fā)光二極管將以12x8方陣的形式排列在內(nèi)周框內(nèi)。每個(gè)孔直徑為9mm并與圖3中的發(fā)光二極管位置完全對(duì)應(yīng)。圖2為本發(fā)明所述圓形(49-64孔)光激活裝置示意圖。尺寸說(shuō)明是為了幫助設(shè)計(jì)印刷線路板中各個(gè)發(fā)光二極管的排列和間距，其中外周直徑=100mm;內(nèi)周直徑86mm,發(fā)光二極管排列在內(nèi)周圓內(nèi)。圖3為本發(fā)明所述的方形裝置PCB圖(96孔)。其中R1-R18代表電阻接ロ；D1_D96代表紫外發(fā)光二極管接ロ。圖4為本發(fā)明所述的方形裝置Schematic圖(96孔)。其中R1-R18代表電阻元件；D1_D96代表紫外發(fā)光二極管元件。圖5為光激活裝置對(duì)光敏蛋白mEos2和PAmCherry的激活結(jié)果，圖片由熒光體視顯微鏡拍攝。圖中，E.coli代表大腸桿菌；Mycobacterium代表分枝桿菌；BeforePA代表405nm光激活之前；AfterPA代表405nm光激活之后；Phaselight代表普通相位光。drop代表菌液(一滴)；colony代表單菌落；streak代表劃線菌落。含有mEos2蛋白的細(xì)菌在光激活之前為綠色熒光，光激活之后為紅色熒光；含有PAmCherry蛋白的細(xì)菌在光激活之前無(wú)熒光，光激活之后為紅色熒光。所有細(xì)菌在普通相位光下均可以成像。具體實(shí)施例方式發(fā)明原理介紹本發(fā)明中的微生物光敏蛋白激發(fā)裝置，具有方形和圓形兩種形式(圖1、2)。其中方形外觀如圖I所示，含有96個(gè)微型紫外發(fā)光二極管。ニ極管發(fā)射波長(zhǎng)為395nm-415nm，波峰為405nm。每個(gè)ニ極管的正向?qū)妷簽?.5V，功率為40mW，輻射角度為30度，ニ極管直徑小于6mm;圓形外觀如圖2所不,含有49-64個(gè)微型紫外發(fā)光二極管。采用計(jì)算機(jī)軟件，設(shè)計(jì)連接電子元件的PCB線路板外觀(layout),以方形PCB為例(如圖3)。該P(yáng)CB與圖I尺寸完全一致，其中R1-R18指示電阻位置；D1_D96指示ニ極管所在位置，D1-D96內(nèi)的兩個(gè)孔，分別連接紫外發(fā)光二極管的正負(fù)極。PCB設(shè)計(jì)的原則是在保證整體布局與圖I一致的前提下，將96個(gè)微型紫外發(fā)光二極管正負(fù)極依次連接在一起，因此可以內(nèi)部線路搭配可以有若干種不同的連接方式。圖3只是代表其中的ー種。用計(jì)算機(jī)軟件,設(shè)計(jì)與PCB線路板(圖3)相對(duì)應(yīng)的內(nèi)部線路Schematic方案(如圖4)，然后將圖2和圖4通過(guò)軟件將內(nèi)部信息連接在一起，這樣才能形成一個(gè)完整的線路圖。將鏈接有Schematic方案的PCB原始文件發(fā)給可以制作PCB板的エ廠(文件后綴名分別.sch和.pcb)。目前中國(guó)深圳等多家エ廠提供PCB代加工業(yè)務(wù)，只要提供圖紙(即鏈接圖3和圖4的原始文件)，廠家可以直接通過(guò)計(jì)算機(jī)閱讀PCB信息，通過(guò)機(jī)器數(shù)分鐘之內(nèi)即可根據(jù)圖紙合成PCB主板。拿到PCB主板后，將紫外發(fā)光二極管和電阻焊接在主板上，然后外接5-24V電壓，660mA的電源轉(zhuǎn)換器。此時(shí)，該裝置即可實(shí)現(xiàn)正常工作，為了美觀需要，可以在方形主板上加上外殼。以下的實(shí)施例可以使本專業(yè)
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員更全面的了解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例I.激活微生物體內(nèi)光敏蛋白的裝置制作(光激活裝置)參照?qǐng)D3和圖4，將原始文件發(fā)給PCB板代加工廠，加工PCB主板。將96只紫外發(fā)光二極管(規(guī)格如下發(fā)射波長(zhǎng)為395nm-415nm,波峰為405nm;正向?qū)妷簽?.5V,功率為40mW，輻射角度為30度，ニ極管直徑小于6mm)和電阻焊接在主板上，外接外接24V電壓，660mA的電源轉(zhuǎn)換器。圓形裝置制作與此類似，ニ極管數(shù)量為61個(gè)，只需將PCB板設(shè)計(jì)成圓形(d=100mm)即可。2.應(yīng)用用光激活裝置照射含有光敏蛋白mEos2的大腸桿菌(E.coli)、含有光敏蛋白mEos2的分枝桿菌(Mycobacterium)、含有光敏蛋白PAmCherry的分枝桿菌。照射時(shí)間為Imin，然后利用體視熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。其中mEos2在光激活前(beforePA)呈現(xiàn)綠色熒光，利用光激活裝置照射后(afterPA)，mEos2被激活，呈現(xiàn)紅色熒光(圖5)。PAmCherry在光激活前不呈現(xiàn)任何熒光，利用光激活裝置照射后將被激活，呈現(xiàn)紅色熒光(圖5)。各種光敏蛋白蛋白的熒光變化與預(yù)期完全一致，說(shuō)明該光激活裝置可以正常使用。以上是結(jié)合具體實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明所做的進(jìn)ー步描述。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書(shū)中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。無(wú)論在線路連接上如何變化，方形裝置紫外發(fā)光二極管的數(shù)量為96個(gè)，而圓形裝置紫外發(fā)光二極管數(shù)量為49-64個(gè)，ニ極管的發(fā)射光譜范圍為395-415nm,其中波峰為405nm。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書(shū)及其等效物界定。權(quán)利要求1.ー種用于激活微生物體內(nèi)光敏蛋白的裝置，包括外接的電源轉(zhuǎn)換器，其特征在干，該裝置的主體結(jié)構(gòu)是ー張印刷電路板，印刷電路板上布設(shè)若干個(gè)完全相同的紫外發(fā)光二極管，各ニ極管和輔助電子元件通過(guò)印刷電路板實(shí)現(xiàn)連接；每個(gè)ニ極管的發(fā)射波長(zhǎng)為395.415nm,波峰為405nm,正向?qū)妷簽?.5V,功率為1040mW,福射角度為30度,ニ極管直徑小于6mm。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的裝置，其特征在于，所述印刷電路板呈正方形，ニ極管的數(shù)量為96個(gè)，ニ極管布局為8X12的方形矩陣形式，且每個(gè)ニ極管的位置均與96孔酶標(biāo)板上的孔的位置相互對(duì)應(yīng)。3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的裝置，其特征在于，所述印刷電路板呈圓形，ニ極管的數(shù)量為.4964個(gè)，ニ極管布局為圓形矩陣形式，且最外圈的ニ極管所構(gòu)成的圓的直徑小于圓形培養(yǎng)皿的直徑。4.根據(jù)權(quán)利要求I至3任意ー項(xiàng)中所述的裝置，其特征在于，所述外接的電源轉(zhuǎn)換器是提供524V電壓、660mA電源的電源轉(zhuǎn)換器。5.權(quán)利要求I至3任意ー項(xiàng)中所述的裝置在進(jìn)行PALM分析之前檢驗(yàn)含有光敏蛋白基因的重組細(xì)菌是否具有光敏特征的應(yīng)用。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟將含有光敏蛋白基因的重組細(xì)菌置于96孔酶標(biāo)板或圓形培養(yǎng)皿中，然后將所述裝置對(duì)應(yīng)地?cái)R置于96孔酶標(biāo)板或圓形培養(yǎng)皿上，接通電源I分鐘，對(duì)重組細(xì)菌進(jìn)行光激活；通過(guò)熒光顯微鏡觀察重組細(xì)菌是否呈現(xiàn)熒光或者熒光轉(zhuǎn)換，確定其是否具有光敏特性。7.權(quán)利要求I至3任意ー項(xiàng)中所述的裝置在細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域關(guān)于光敏蛋白激發(fā)和熒光蛋白顔色轉(zhuǎn)換中的應(yīng)用。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟將含有光敏蛋白基因的重組細(xì)菌置于96孔酶標(biāo)板或圓形培養(yǎng)皿中，然后將所述裝置對(duì)應(yīng)地?cái)R置于96孔酶標(biāo)板或圓形培養(yǎng)皿上，接通電源I分鐘，對(duì)重組細(xì)菌進(jìn)行光激活；通過(guò)熒光顯微鏡觀察重組細(xì)菌是否呈現(xiàn)熒光或者熒光轉(zhuǎn)換，確定其是否具有光敏特性。全文摘要本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，旨在提供一種用于激活微生物體內(nèi)光敏蛋白的裝置及應(yīng)用。該裝置的主體結(jié)構(gòu)是一張印刷電路板，印刷電路板上布設(shè)若干個(gè)完全相同的紫外發(fā)光二極管，各二極管和輔助電子元件通過(guò)印刷電路板實(shí)現(xiàn)連接；每個(gè)二極管的發(fā)射波長(zhǎng)為395～415nm，波峰為405nm，正向?qū)妷簽?.5V，功率為10～40mW，輻射角度為30度，直徑小于6mm。本發(fā)明可以直接用于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板或者圓形平皿中細(xì)菌的光激發(fā)，僅需要1min光激發(fā)時(shí)間，即可通過(guò)普通的熒光顯微鏡對(duì)培養(yǎng)板或者平板上的細(xì)菌是否具有光敏特性進(jìn)行判定。該裝置適用于表達(dá)光敏蛋白的所有微生物，只要光敏蛋白對(duì)405nm紫外光敏感，均可以使用該裝置；具有高效、簡(jiǎn)捷、快速、方便、適用廣等特點(diǎn)。文檔編號(hào)G01N21/64GK102692400SQ20121017388公開(kāi)日2012年9月26日申請(qǐng)日期2012年5月28日優(yōu)先權(quán)日2012年5月28日發(fā)明者宋厚輝,方維煥,桂海孌,武曉林,金佩華,黃麗申請(qǐng)人:浙江農(nóng)林大學(xué)