一種糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其制備方法，屬于醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病已成為全球第一大流行病，由糖尿病導(dǎo)致的微血管并發(fā)癥（視網(wǎng)膜病變、 糖尿病腎病、神經(jīng)病變和糖尿病足）及大血管并發(fā)癥（心、腦血管疾?。┑陌l(fā)生率、致殘率 和致死率極高，嚴(yán)重威脅糖尿病患者的生存質(zhì)量甚至生命，也給醫(yī)療資源和社會經(jīng)濟(jì)造成 巨大的負(fù)擔(dān)，因此，糖尿病的早期診斷以及糖尿病患者血糖水平的合理控制是解決問題的 關(guān)鍵所在。糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展取決于患者體內(nèi)蛋白長期的糖基化狀態(tài)，評估這 種糖基化狀態(tài)的有效方法是檢測血液中葡萄糖與血紅蛋白的穩(wěn)定的加合產(chǎn)物一一糖化血 紅蛋白，其中血紅蛋白A le (HbAlc)是糖化血紅蛋白的主要組成成分，大約占糖化血紅蛋白的 80%，以HbA1。的結(jié)果來報告糖化血紅蛋白在業(yè)界已達(dá)成共識。糖化血紅蛋白與傳統(tǒng)的診斷 指標(biāo)血糖相比，具有樣本穩(wěn)定、抽血時間不受限制、不易受干擾等優(yōu)點(diǎn)，被業(yè)界譽(yù)為與胰島 素的發(fā)現(xiàn)作用等同。
[0003] HbA1C是世界衛(wèi)生組織推薦的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)（2011年），還是糖尿病血糖控制的 "金標(biāo)準(zhǔn)"，也是評估糖尿病微血管、大血管并發(fā)癥的有效指標(biāo)。目前相當(dāng)一部分國家和地區(qū) 采用糖化血紅蛋白診斷、管理糖尿病，包括我們的鄰國，日本和韓國。冊4(3作為糖尿病診斷 標(biāo)準(zhǔn)實施的關(guān)鍵前提是：HbA 1C的檢測實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，但我國目前還沒有采用糖化血紅蛋白診 斷糖尿病，有部分原因是我們的實驗室測定結(jié)果不準(zhǔn)確、不可比，也就是：在我國HbA 1C的檢 測還沒有實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，使得HbA1C在我國的臨床應(yīng)用沒有發(fā)揮其應(yīng)有的作用。
[0004] 2013年，由美國糖尿病協(xié)會、歐洲糖尿病研宄會、國際糖尿病聯(lián)盟及IFCC發(fā)表聯(lián) 合聲明：IFCC參考系統(tǒng)是HbA 1C標(biāo)準(zhǔn)化唯一有效的參考系統(tǒng)；HbA1C測定應(yīng)在全球范圍內(nèi)實 現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化；HbA1C結(jié)果應(yīng)以IFCC單位（mmol/mol)和NGSP單位（％ )共同報告。
[0005] 由于臨床實驗室檢測HbA1C的常規(guī)方法有幾十種之多，所用原理不同、方法不同， 所測組分有差異，加上變異血紅蛋白等影響因素，導(dǎo)致各實驗室之間結(jié)果有較大差異。因 此，必須開展HbA 1C檢測的標(biāo)準(zhǔn)化工作，以保證各實驗室檢測結(jié)果的溯源性，在此基礎(chǔ)上實 現(xiàn)準(zhǔn)確性和可比性。標(biāo)準(zhǔn)化工作的核心是建立參考系統(tǒng)，參考系統(tǒng)包括標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和參考 方法，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對于實現(xiàn)檢測結(jié)果的量值溯源，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、可比性有重要意 義。冊八^有國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（IRMM/IFCC-466HbA lC、IRMM/IFCdeTHbA^，是高純度的基準(zhǔn) 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（primary reference material)，二個標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)以一定的比例混合為IFCC推薦 的、HbA1C 標(biāo)準(zhǔn)化唯一有效的參考測量程序（primary reference measurement procedure) 校準(zhǔn)，而作為HbA1C測定結(jié)果的量值傳遞，HbA1C次級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是必不可少的，一些國家 的HbA 1C標(biāo)準(zhǔn)化組織致力于制備形式各異的符合自己需要的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用于廠家儀器和臨 床實驗室的校準(zhǔn)。但我國沒有HbA 1C標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，缺少HbA1C檢測標(biāo)準(zhǔn)化的基礎(chǔ)，為促進(jìn)我 國HbA1C的檢測與臨床應(yīng)用早日與國際接軌，本發(fā)明將制備具有醫(yī)學(xué)決定水平的人血基質(zhì) HbA1C候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
[0007] 本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題是提供這種糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法。
[0008] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0009] -種糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，為3種濃度的具有醫(yī)學(xué)決定水平的人血基質(zhì)HbA1C 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
[0010] 所述糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度分別為：
[0011] (1)濃度 I :IFCC 值為 31-42mmol/mol 或 NGSP 值為 5. 0-6. 0HbAlc% ;
[0012] (2)濃度 2 :IFCC 值為 43-58mmol/mol 或 NGSP 值為 6. 1-7. 5HbAlc% ;
[0013] (3)濃度 3 :IFCC 值為 69-91mmol/mol 或 NGSP 值為 8. 5-10. 5HbAlc%。
[0014] 所述糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度分別為：
[0015] (1)濃度 I : IFCC 值為 38. 42 (不確定度：1. 60) mmol/mol 或 NGSP 值為 5. 67 (不確 定度：0.24) HbAlc % ;
[0016] (2)濃度 2 : IFCC 值為 52. 68 (不確定度：2. 20) mmol/mol 或 NGSP 值為 6. 97 (不確 定度：0· 29)HbAlc% ;
[0017] (3)濃度 3 : IFCC 值為 88. 74 (不確定度：3. 65) mmol/mol 或 NGSP 值為 10. 27 (不確 定度：0. 42)HbAlc%。
[0018] 這3個濃度水平皆為醫(yī)學(xué)決定水平，其中：濃度1為國際診療指南推薦的糖尿病篩 查濃度，可以保證糖尿病高危人群的篩查質(zhì)量；濃度2臨近糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，可以保證檢測 質(zhì)量，以減少糖尿病的漏診率和誤診率；濃度3為高值，可用于糖尿病患者的治療監(jiān)測、驗 證常規(guī)方法的檢測限及可報告范圍。
[0019] 所述糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采用以下方法制備：收集不同HbA1。濃度的人新鮮抗 凝全血，在無菌條件下操作制成溶血液，根據(jù)糖化血紅蛋白的醫(yī)學(xué)決定水平，該標(biāo)物包括 高、中、低3個不同的濃度水平，分裝并在-70°C下保存。具體包括以下步驟：
[0020] (1)用EDTA抗凝采血管采集空腹靜脈血50ml/人，室溫放置0. 5小時，將采血管于 8°C 3000g離心10min，去除上層血衆(zhòng)；
[0021] (2)向下層紅細(xì)胞中加入10倍體積的0· 15mol/L NaCl溶液，置37°C溫浴4h，離心 20min，棄去上清液，重復(fù)該步驟，清洗紅細(xì)胞2次；
[0022] (3)加入等體積超純水，混勾，裂解紅細(xì)胞；
[0023] (4)去除細(xì)胞碎片等雜質(zhì)：離心20min，小心吸取上層溶液，加入IOml含穩(wěn)定劑的 水溶液，混勻后，用針頭濾器過濾溶血液，測定總血紅蛋白濃度；
[0024] (5)按糖化血紅蛋白水平混合成3種濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；
[0025] (6)在無菌間將溶血液分裝至Iml聚乙烯管中，加蓋，編號，置-70°C保存。
[0026] 所述步驟⑷所述的穩(wěn)定劑水溶液為50mmol/Lβ -嗎啉乙磺酸、10mmol/L KC1、 lmmol/L Na2CO3, pH 值為 6. 2。
[0027] 一種糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，包括如下步驟：
[0028] (1)用EDTA抗凝采血管分別采集健康無糖尿病者、糖尿病控制良好者及糖尿病控 制不好者的空腹靜脈血50ml/人，室溫放置0. 5小時，將采血管于8°C 3000g離心10min，去 除上層血漿；
[0029] (2)向下層紅細(xì)胞中加入10倍體積的0· 15mol/L NaCl溶液，置37°C溫浴4h，離心 20min，棄去上清液，重復(fù)該步驟，清洗紅細(xì)胞2次；
[0030] (3)加入等體積超純水，混勾，裂解紅細(xì)胞；
[0031] (4)去除細(xì)胞碎片等雜質(zhì)：離心20min，小心吸取上層溶液，加入IOml含穩(wěn)定劑的 水溶液，混勻后，用針頭濾器過濾溶血液，測定總血紅蛋白濃度；
[0032] (5)按糖化血紅蛋白水平混合成3種濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；
[0033] (6)在無菌間將溶血液分裝至Iml聚乙烯管中，加蓋，編號，置-70°C保存。
[0034] 所述步驟（4)的穩(wěn)定劑水溶液為50mmol/L β -嗎啉乙磺酸、10mmol/L KC1、Immol/ L Na2CO3, pH 值為 6. 2。
[0035] 所述步驟⑷測定總血紅蛋白濃度的方法為氰化高鐵血紅蛋白測定法。
[0036] 所述步驟（5)的3種濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為：
[0037] (1)濃度 I :IFCC 值為 31-42mmol/mol 或 NGSP 值為 5. 0-6. 0HbAlc% ;
[0038] (2)濃度 2 :IFCC 值為 43-58mmol/mol 或 NGSP 值為 6. 1-7. 5HbAlc% ;
[0039] (3)濃度 3 :IFCC 值為 69-91mmol/mol 或 NGSP 值為 8. 5-10. 5HbAlc%。
[0040] 所述步驟（5)的3種濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為：
[0041] (1)濃度 I : IFCC 值為 38. 42 (不確定度：1. 60) mmol/mol 或 NGSP 值為 5. 67 (不確 定度：0.24) HbAlc % ;
[0042] (2)濃度 2 :IFCC 值為 52. 68 (不確定度：2. 20)mmol/mol 或 NGSP 值為 6. 97 (不確 定度：0· 29)HbAlc% ;
[0043] (3)濃度 3 : IFCC 值為 88. 74 (不確定度：3. 65) mmol/mol 或 NGSP 值為 10. 27 (不確 定度：0. 42)HbAlc%。
[0044] 所述糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用于檢測人糖化血紅蛋白常規(guī)方法的發(fā)展、溯源、評 價，試劑的制備及質(zhì)量評價，校準(zhǔn)物的制備、定值及質(zhì)量評價的應(yīng)用。
[0045] 所述糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用于制備檢測糖尿病的試劑的應(yīng)用。
[0046] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有良好的均勻性、穩(wěn)定性及互通性，符合HbA1。國 際標(biāo)準(zhǔn)化工作的要求、《一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》及ISO Guide35的要求；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采用新 鮮血液制備溶血液，來源廣泛，使用方便；制備方法簡單，溶血液無須經(jīng)過二D電泳或HPLC 液相色譜的純化，適合于常規(guī)方法使用；此標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在4°C可儲存1個月，在_70°C可長期儲 存，便于運(yùn)輸，對于常規(guī)檢測系統(tǒng)的溯源和質(zhì)量評價、試劑的制備及質(zhì)量評價、校準(zhǔn)物的制 備、定值及質(zhì)量評價以及協(xié)作研宄分析中的質(zhì)量保證都可發(fā)揮作用。
[0047] 以下結(jié)合【具體實施方式】詳細(xì)說明本發(fā)明技術(shù)方案，并不以此限定本發(fā)明的實施范 圍。凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所做的本領(lǐng)域等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【具體實施方式】
[0048] 實施例1 :制備糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)
[0049] 一 ·材料
[0050] 1.包裝容器的選擇
[0051] 聚乙烯材料對候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)基質(zhì)中的成分沒有吸收和釋放，耐熱、抗酸、抗堿、抗 水，因此選擇無菌聚乙烯管（Axygen公司，美國）作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的容器。
[0052] 2.消毒
[0053] 在制備前，無菌間和超凈臺紫外消毒。
[0054] 3.采血志愿者選擇
[0055] 健康無糖尿病、糖尿病控制良好及糖尿病控制不好志愿者，年齡20~50歲、男女 各半，人類免疫缺陷病毒抗體（HIV)和乙型、丙型肝炎表面抗原（HBV、HCV)陰性，填寫知情 同意書。
[0056] 4.試劑
[0057] 乙腈，色譜純（Acetonitrile, Fisher公司，美國），β -嗎啉乙磺酸（MES，Sigma 公司，美國），乙二銨四乙酸二鈉（Na2-EDTA)、氯化鈉（NaCl)、氯化鉀（KCl)、碳酸氫鈉 (NaHCO 3)為分析純（北京化學(xué)