一種基于選擇性剔除技術(shù)的中藥效應(yīng)物質(zhì)辨識方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種中藥活性效應(yīng)物質(zhì)成分的研宄方法，具體涉及一種利用制備液相 選擇性剔除技術(shù)的中藥效應(yīng)物質(zhì)辨識方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 作為世界上最古老的傳統(tǒng)醫(yī)藥之一，中草藥已經(jīng)具有幾千年的歷史，主要用于慢 性病的治療，療效確切，現(xiàn)如今已被廣泛地使用于許多發(fā)達國家和發(fā)展中國家。中藥發(fā)揮療 效的是中藥所含的復(fù)雜物質(zhì)基礎(chǔ)，然而，中藥多成分、多靶點的特點為其藥效物質(zhì)的闡明帶 來了很大困難，從而限制了中藥現(xiàn)代化的進程。
[0003] 長期以來，國內(nèi)中藥有效成分研宄主要是借鑒國外對天然藥物研宄的兩種基本策 略：一是在系統(tǒng)分離、結(jié)構(gòu)鑒定基礎(chǔ)上，結(jié)合藥效學評價（從整體動物、離體器官、細胞亞細 胞和分子生物學角度），研宄得到的單體成分的活性；二是應(yīng)用一個或多個藥理模型對中 藥分離部位進行評價，并對活性部位進行系統(tǒng)分離和結(jié)構(gòu)鑒定。多年來這樣的研宄方法發(fā) 現(xiàn)了一些中藥中的活性成分，如麻黃、黃連、人參等。但是，國內(nèi)外學者在研宄中也慢慢發(fā) 現(xiàn)，臨床上對某些疾病很有療效的中藥，在某個動物試驗或體外模型上卻未能驗證出特定 的活性成分。另外，許多中藥粗提物隨著逐步分離純化，活性卻越來越弱，最后卻未能得到 有活性的純化合物。同時，研宄者們越來越多地認可中藥中存在著復(fù)雜的成分間相互作用。 可見，傳統(tǒng)的中藥有效成分研宄模式不能全面反映中藥多成分、多靶點的特點和相互影響 的整體作用。
[0004] 近年來，隨著現(xiàn)代色譜學、細胞分子生物學、計算機科學等學科的發(fā)展以及多種先 進科學技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研宄思路和方法取得了長足的進展，如基于譜 效關(guān)系的中藥藥效物質(zhì)研宄、基于藥代動力學的中藥藥效物質(zhì)研宄、基于血清藥物化學和 血清藥理學相結(jié)合的中藥藥效物質(zhì)研宄、基于整合效應(yīng)關(guān)聯(lián)分析的中藥藥效物質(zhì)研宄以及 基于計算機虛擬篩選技術(shù)的中藥藥效物質(zhì)研宄。但這些研宄方法除存在固有的缺點外，也 難以真正地闡明中藥物質(zhì)基礎(chǔ)及其相互作用。
[0005] 因此，很有必要在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)之上，建立一種基于選擇性剔除和活性評價相 結(jié)合的普遍適用的在整體水平上辨識中藥藥效物質(zhì)的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明目的：本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種可操作性強，適用 范圍廣泛，可全面闡明中藥活性效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)到基于選擇性剔除技術(shù)的中藥效應(yīng)物質(zhì)辨識 方法。本發(fā)明采用制備液相色譜技術(shù)將目標成分選擇性剔除，進而對其進行藥效活性評價， 根據(jù)目標成分剔除前后活性的變化與否及其變化程度，判定所剔除成分在中藥效應(yīng)表達中 的貢獻，進而對該中藥中不同效應(yīng)成分進行主次區(qū)分與排序，以達到對中藥效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ) 的定量評價，可充分闡明中藥效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)。
[0007] 技術(shù)方案：為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案為：
[0008] 一種基于選擇性剔除技術(shù)的中藥效應(yīng)物質(zhì)辨識方法，包括以下步驟：選取中藥 材，經(jīng)提取得到提取物，然后利用制備液相色譜剔除中藥提取物中的主要成分，以中藥材功 效作為相關(guān)評價指標，然后分別對剔除的主要成分和剔除主要成分后的樣品進行多指標效 應(yīng)評價，進而比較分析得出中藥材各指標的主要效應(yīng)物質(zhì)及各成分對中藥材功效的貢獻 度。
[0009] 作為優(yōu)選方案，以上所述的中藥復(fù)雜成分配伍相互作用研宄方法，所述的主要成 分包括黃酮類、三萜類、苯丙素類、蒽醌類、香豆素類、木質(zhì)素類、有機酸或生物堿類?？梢杂?于評價和分析各種中藥材到活性效應(yīng)物質(zhì)。
[0010] 紅花中藥材復(fù)雜成分配伍相互作用研宄方法，其它包括以下步驟：
[0011] ⑴紅花提取物的制備
[0012] 稱取紅花藥材，用乙醇提取1~3次，每次各60~120min，合并提取液，減壓濃縮， 得紅花提取物；
[0013] (2)剔除成分的樣品制備
[0014] 稱取上述步驟（1)紅花提取物適量，用甲醇溶解，13000~15000r/min，離心10~ 20min，取上層離心液上制備液相系統(tǒng)進樣，進樣體積為500 y L ;流動相：A相為水，-B相為 甲醇；流速為20mL/min ;檢測波長270nm ;根據(jù)不同成分確定不同的洗脫程序，各成分的最 佳洗脫程序如下表1所示；依據(jù)保留時間分別收集目標成分1~13,10mL/管，同時分別收 集剔除目標成分1~13后的樣品液，然后減壓回收收集管及樣品液中溶劑后，分別得到目 標成分C1~C13和分別剔除目標成分后的樣品部分HH1-HH13 ;
[0015] 表1各成分最佳梯度洗脫條件
[0016]
[001 /J
【主權(quán)項】
1. 一種基于選擇性剔除技術(shù)的中藥效應(yīng)物質(zhì)辨識方法，其特征在于，包括以下步驟： 選取中藥材，經(jīng)提取得到提取物，然后利用制備液相色譜剔除中藥提取物中的主要成分，以 中藥材功效作為相關(guān)評價指標，然后分別對剔除的主要成分和剔除主要成分后的樣品進行 多指標效應(yīng)評價，進而比較分析得出中藥材各指標的主要效應(yīng)物質(zhì)及各成分對中藥材功效 的貢獻度。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的中藥復(fù)雜成分配伍相互作用研宄方法，其特征在于，所述的 主要成分包括黃酮類、三萜類、苯丙素類、蒽醌類、香豆素類、木質(zhì)素類、有機酸或生物堿類。
3. 紅花中藥材復(fù)雜成分配伍相互作用研宄方法，其特征在于，它包括以下步驟： (1) 紅花提取物的制備 稱取紅花藥材，用乙醇提取1~3次，每次各60~120min，合并提取液，減壓濃縮，得紅 花提取物； (2) 剔除成分的樣品制備 稱取上述步驟（1)紅花提取物適量，用甲醇溶解，13000~15000r/min，離心10~ 20min，取上層離心液上制備液相系統(tǒng)進樣，進樣體積為500yL;流動相：A相為水，-B相為 甲醇；流速為20mL/min;檢測波長270nm;根據(jù)不同成分確定不同的洗脫程序，各成分的最 佳洗脫程序如下表1所示；依據(jù)保留時間分別收集目標成分1~13,10mL/管，同時分別收 集剔除目標成分1~13后的樣品液，然后減壓回收收集管及樣品液中溶劑后，分別得到目 標成分C1~C13和分別剔除目標成分后的樣品部分HH1-HH13 ; 表1各成分最佳梯度洗脫條件
(3)HPLC分析條件 取上述步驟（2)剔除目標成分前后樣品HH及HH1-HH13和剔除到目標成分C1-C13適 量，用甲醇溶解，13000~15000r/min，離心10~20min，，取上清液進HPLC分析，色譜條件 為：柱溫：30°C，進樣體積10yL，流動相為A相0. 5%乙酸水-B相甲醇，流速為0.8mL/min， 梯度洗脫程序：〇min，5%B-10min，10%B- 25min，25%B- 40min，30%B- 55min，45% B- 75min，90%B;PAD檢測器，波長掃描范圍：210-450nm; (4)HPLC-Q-T0F-MS分析鑒定條件 色譜條件與步驟（3)HPLC-致； 質(zhì)譜檢測條件ESI源，掃描方式：ESI+、ESI_模式，毛細管電壓：3.OkV，錐孔電壓：40V， 萃取電壓：2. 0V，離子源溫度：100°C，脫溶劑氣溫度：250°C，錐孔氣流量：50L?tT1，脫溶劑 氣流量：600L?tT1，離子能量：1V，每0. 2s采集1次圖譜；準確質(zhì)量測定采用亮氨酸-腦啡 肽（ESI+:m/z556. 2771，ESI_:m/Z 554. 2615)溶液為鎖定質(zhì)量溶液，質(zhì)量掃描范圍：100~ 1500m/z； 對剔除成分Cl~C13分別進行結(jié)果鑒定，共鑒定11個成分，分別為胞苷（Cl)、腺苷 (C2)、羥基紅花黃色素A(C3)、6-羥基山柰酚-3,6-二氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷（C4)、 6-羥基山柰酚-3,6, 7-三氧葡萄糖苷（C5)、6_羥基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸 苷化6)、6-羥基山柰酚-3,6-二氧葡萄糖苷化7)、6-羥基山柰酚-3-氧蕓香糖-6-氧葡萄 糖苷的混合物（C8)、脫水紅花黃色素B(C9)、6-羥基山柰酚-3-氧蕓香糖苷（C10)和山柰 酷_3_氧蕓香糖苷（C11)。 (5) 選取抗血小板聚集活性、抗凝血活性、總抗氧化活性和對卵巢顆粒細胞增殖活性作 為紅花功效到相關(guān)評價指標，結(jié)合多指標綜合指數(shù)法，分別考察制備液相分離得到到目標 成分C1~C13、分別剔除目標成分后的樣品部分HH1-HH13及未剔除目標成分的紅花提取物 的抗血小板聚集活性、抗凝血活性、總抗氧化活性和對卵巢顆粒細胞增殖活性進行多指標 效應(yīng)評價，進而比較分析得出紅花中各主要成分對紅花功效的貢獻度。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的紅花中藥材復(fù)雜成分配伍相互作用研宄方法，其特征在于， 抗血小板聚集活性測定包括凝血酶時間，凝血酶原時間和纖維蛋白原轉(zhuǎn)化時間測定。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的紅花中藥材復(fù)雜成分配伍相互作用研宄方法，其特征在于， 紅花中藥材中活血效應(yīng)的主要活性成分為羥基紅花黃色素A、脫水紅花黃色素B、6-羥基 山柰酷_3_氧蕓香糖苷、6-羥基山柰酷-3,6-二氧葡萄糖苷和6-羥基山柰酷_3_氧蕓香 糖-6-氧葡萄糖苷的混合物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的紅花中藥材復(fù)雜成分配伍相互作用研宄方法，其特征在于， 紅花中藥材中抗氧化活性的主要活性成分為胞苷、脫水紅花黃色素B、6-羥基山柰酚-3-氧 蕓香糖苷、山柰酚-3-氧蕓香糖苷、6-羥基山柰酚-3,6-二氧葡萄糖苷和6-羥基山柰 酚-3-氧蕓香糖-6-氧葡萄糖苷的混合物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的紅花中藥材復(fù)雜成分配伍相互作用研宄方法，其特征在于， 紅花中藥材中促進卵巢顆粒細胞增殖的主要活性成分為Cl、C4、C5、C6、C8和C11。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于選擇性剔除技術(shù)的中藥效應(yīng)物質(zhì)辨識方法，該方法選取中藥材，經(jīng)提取得到提取物，利用制備液相色譜剔除中藥提取物中的主要成分，以中藥材功效作為相關(guān)評價指標，然后分別對剔除的主要成分和剔除主要成分后的樣品進行多指標效應(yīng)評價，分析得出中藥材主要效應(yīng)成分對中藥材功效的貢獻度，并對不同效應(yīng)成分進行主次區(qū)分與排序，以達到對中藥效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)的定量評價。本發(fā)明提供的技術(shù)方案，從中藥整體作用特點出發(fā)，可闡明紅花等中藥材的效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)，該方法可操作性強，工藝設(shè)計合理，為評價紅花等中藥材的活性物質(zhì)基礎(chǔ)和活性物質(zhì)作用機理提供科學依據(jù)，可為紅花等中藥材在中藥復(fù)方配伍中提供重要依據(jù)，具有重要的應(yīng)用價值。
【IPC分類】G01N30-02
【公開號】CN104698097
【申請?zhí)枴緾N201510008084
【發(fā)明人】林航, 開鈞, 尚冠雄, 唐于平, 王林艷, 段金廒
【申請人】南京中醫(yī)藥大學
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年1月7日