一種生物降解脫氧雪腐鐮刀烯醇的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種生物降解脫氧雪腐鐮刀烯醇的方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域和食品安全技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的降解脫氧雪腐鐮刀烯醇的微生物是從太湖湖底泥中經(jīng)梯度稀釋分離、篩選得到的，經(jīng)鑒定為青霉JS2(Penicillium sp.JS2)，在培養(yǎng)基中，DON的初始濃度為2mg/L，pH 6.0，經(jīng)32?35℃培養(yǎng)96h，DON的降解率為62％。該菌種降解嘔吐毒素的穩(wěn)定性很好，在培養(yǎng)基中，傳代培養(yǎng)5代，DON的降解率均在60％以上。CCTCC NO：M 201523720150416
【專利說明】
一種生物降解脫氧雪腐鐮刀烯醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種生物降解脫氧雪腐鐮刀烯醇的方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域和食品安全技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]真菌毒素對食品尤其是對糧食的危害極大，真菌可在糧食作物田間生長、收獲后及儲藏過程中對毒素的生物合成及代謝。嘔吐毒素(vomitoxin)又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenolDON)，是由鐮刀菌屬等產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，它對糧谷類的污染非常普遍，家畜食用了 DON污染的飼料會引起拒食，嘔吐，生長延遲，生殖紊亂等癥狀;而人類誤食了 DON污染的糧食會引起免疫抑制，貧血，頭痛，嘔吐，厭食和腹痛等癥狀。
[0003]嘔吐毒素的性質(zhì)非常穩(wěn)定，耐熱、耐壓，在弱酸中部不分解，一般的方法很難破壞其化學(xué)結(jié)構(gòu)。目前，嘔吐毒素降解的方法有物理法、化學(xué)法和生物法，但是由于成本、環(huán)境污染、原料營養(yǎng)成分破壞等原因，推廣起來不易。因此，尋找一種安全快速有效的方法來降解污染糧食中的嘔吐毒素是十分必要的。
[0004]微生物降解嘔吐毒素有以下優(yōu)點(diǎn):專一、有效且條件溫和:不會引入有害化學(xué)物質(zhì)，對谷物及飼料營養(yǎng)價(jià)值的損失少，沒有環(huán)境污染而受到廣大關(guān)注。真菌毒素微生物防治方法作為一種常用方法，具有安全、高效、經(jīng)濟(jì)、應(yīng)用性強(qiáng)、環(huán)境友好型等優(yōu)勢，成為近年來備受推崇的防治方法。
[0005]目前，生物降解嘔吐毒素包括一些黑曲霉、枯草芽孢桿菌、米曲霉米根霉及一些腸道厭氧微生物，雖然已有報(bào)道一些青霉菌可以降解嘔吐毒素，但是存在降解效率低的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一株能降解嘔吐毒素的菌株及與其適合的有效發(fā)酵培養(yǎng)條件。
[0007]本發(fā)明的菌株為青霉JS2，已于2015年4月16日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC Ν0:Μ 2015237。
[0008]本發(fā)明的青霉JS2，在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，DON濃度為2mg/L，pH為6.0，經(jīng)32°C培養(yǎng)96h，傳代5次，青霉JS2對DON的降解率均在60 %以上。
[0009]所述的能降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)的青霉菌JS2，是從太湖湖底泥中以DON毒素為唯一碳源分離篩選出來，其保藏條件如下:從生長良好的固態(tài)平板培養(yǎng)基上接取3環(huán)降解菌到搖瓶培養(yǎng)基中，32°C搖床(120rpm)培養(yǎng)96h，取0.65mL移入含有0.3mL無菌甘油的甘油管中，放入-70°C超低溫冰箱保存。
[0010]所述固態(tài)平板培養(yǎng)基為(w/v):D0N毒素 0.2mg，KH2P04 0.5g,MgSO4.7H20 0.lg，(NH4)2SO4 0.3g,CaCl2.2H20 0.2g，瓊脂2.0g，蒸餾水 100mL，pH自然。121°C滅菌20min，滅菌后加入DON毒素。
[0011]本發(fā)明還提供一種所述能降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)的培養(yǎng)方法，是將青霉菌JS2接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基，pH 6.0，培養(yǎng)溫度32-35°(:，搖床轉(zhuǎn)速120印111/1^11，搖床培養(yǎng)96h0
[0012]所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基為(w/v):D0N毒素2mg/L，KH2P040.5%,MgSO4.7H20 0.1%,(NH4)2SO4 0.3-0.4% ,CaCl2.2H20 0.2%，瓊脂2.0 %，蒸餾水 100mL，pH自然。121°C滅菌20min，滅菌后加入DON毒素。
[0013]將能降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)的青霉菌JS2菌發(fā)酵后的發(fā)酵液，5000rpm離心1min后上清液為粗酶液，經(jīng)高效液相色譜(HPLC)檢測結(jié)果顯示DON經(jīng)粗酶降解，降解效果明顯，降解率達(dá)60%以上。
[0014]本發(fā)明還提供了一種降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)的方法，是利用青霉JS2發(fā)酵得到的粗酶液降解DON。
[0015]生物材料保藏:
[0016]青霉JS2，分類學(xué)命名為青霉JS2Penicillium sp.JS2，已于2015年4月16日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC Ν0:Μ 2015237，保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)。
[0017]本發(fā)明的有益效果:
[0018]本發(fā)明自太湖湖底泥中篩選出一株能降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)的青霉JS2(Penicillium sp.JS2)，該菌株可產(chǎn)生酶能降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)，該菌種降解嘔吐毒素的穩(wěn)定性很好，傳代培養(yǎng)5代，在培養(yǎng)基中，D0N的初始濃度為2mg/L，pH 6.0，經(jīng)32-350C培養(yǎng)96h，DON的降解率均在60 %以上。
【具體實(shí)施方式】
[0019]毒素檢測方法:
[0020]25ml發(fā)酵液過濾后取5ml再通過DON免疫親和柱凈化，然后將凈化液3ml以氮?dú)獯蹈?，用Iml流動(dòng)相甲醇:水(8:2)復(fù)溶，然后用UPLC進(jìn)行檢測。
[0021 ]實(shí)施例1:降解嘔吐毒素菌株的篩選方法
[0022]采取的一定量的太湖湖底泥，放入裝有10mL無菌水及玻璃珠的250mL三角瓶中，振蕩，稀釋不同濃度梯度，將不同濃度梯度稀釋好的樣品分別涂布到以DON毒素為唯一碳源的PH值為6.0的固體培養(yǎng)基平板上，32 °C培養(yǎng)72h。反復(fù)進(jìn)行平板劃線分離，重復(fù)三次得到純化的單菌落，供下一步鑒定用。
[0023]鑒定主要通過:I)菌落特征觀察:在含有DON毒素的固體培養(yǎng)基平板上，用肉眼直接觀察，在菌落周圍有淀粉降解透明圈的菌株。2)個(gè)體形態(tài)觀察:用光學(xué)顯微鏡觀察，挑起有變形菌形態(tài)的菌株。將滿足鑒定條件的菌株挑出甘油管保藏。
[0024]以3%接種量取-70 °C甘油管保藏液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，32 °C，120rpm搖瓶培養(yǎng)。取32 0C搖床培養(yǎng)的96h的發(fā)酵液，5000rpm，4 °C離心1min。離心結(jié)束后，取上清液，過濾后用HPLC方法測定降解率。
[0025]所述發(fā)酵培養(yǎng)基為(》八):0(^毒素0.211^，腿2?040.5%，]\%504.7H20 0.1%, (NH4)2SO4 0.4%,CaCl2.2H20 0.2%，瓊脂2.0%，蒸餾水 100mL，pH自然。121°C滅菌20min，滅菌后加入DON毒素。
[0026]通過利用HPLC法對降解菌的降解率進(jìn)行測定，篩選出一株可高效降解DON毒素的菌株(降解率為67 % )，通過16S rDNA鑒定，序列分析可知該菌株為青霉菌JS2(PeniciIliumsp.JS2)，于2015年4月16日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M2015237。
[0027]實(shí)施例2:青霉菌JS2(Penicillium sp.JS2)產(chǎn)酶最適反應(yīng)pH的測定
[0028]采用甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，配置不同梯度pH緩沖液(5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，)的方法測定降解酶最適反應(yīng)pH。分別將粗酶液與不同pH的緩沖液在試管中混合，在350C水浴鍋內(nèi)保溫24h ο該降解酶的最適反應(yīng)pH為6.0，在該pH條件下可以高效降解DON。在卩!15.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5下的降解率分別是50%，64%，66%，62%，55%，47%。
[0029]粗酶液制備方法:取32°C搖床培養(yǎng)的96h的發(fā)酵液，5000rpm、4°C離心lOmin。離心結(jié)束后，取上清液，過濾備用。
[0030]降解體系:粗酶液添加量為lml，將粗酶液與不同pH的緩沖液在試管中混合，加入DON毒素的量為2mg/L，反應(yīng)時(shí)間為30分鐘。
[0031]實(shí)施例3:青霉菌JS2(Penicillium sp.JS2)產(chǎn)酶最適反應(yīng)溫度的測定
[0032]采用不同梯度溫度(25°C，30°C，35°C，40°C，45°C，50°C)的方法測定降解酶最適反應(yīng)溫度，25°(:、30°(:、35°(:、40°(:、45°(:、50°(:下的降解率分別49%，57%，65%，52% ,46%，39%。分別將粗酶液放置在不同溫度條件下進(jìn)行反應(yīng)，在水浴鍋內(nèi)保溫24h，該降解酶的最適反應(yīng)溫度為35°C，在該溫度條件下可以高效降解DON。
[0033]粗酶液制備方法:取32°C搖床培養(yǎng)的96h的發(fā)酵液，5000rpm、4°C離心lOmin。離心結(jié)束后，取上清液，過濾備用。
[0034]降解體系:粗酶液添加量為Iml，加入DON毒素的量為2mg/L，反應(yīng)時(shí)間為30分鐘。
[0035]雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一株降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的青霉JS2，于2015年4月16日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M 2015237。2.權(quán)利要求1所述的青霉JS2在降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇方面的應(yīng)用。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是用于降解糧食中的降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇。4.一種發(fā)酵培養(yǎng)權(quán)利要求1所述青霉JS2的方法，其特征在于，所述方法是將青霉菌JS2接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基，pH 6.0，培養(yǎng)溫度32°C，搖床轉(zhuǎn)速120rpm/min，搖床培養(yǎng)96h，得到發(fā)酵液。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，含有DON毒素2mg/L，KH2PO4 0.5% ,MgSO4.7H20 0.1 % , (NH4)2SO4 0.3-0.4% ,CaCl2.2H20 0.2%，瓊脂 2.0%。6.根據(jù)權(quán)利要求4-5的方法得到的發(fā)酵液。7.權(quán)利要求6所述的發(fā)酵液在降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇方面的應(yīng)用。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是利用發(fā)酵液離心后得到的粗酶液降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇。
【文檔編號】C12N9/00GK105925492SQ201610404034
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月8日
【發(fā)明人】孫秀蘭, 孫超, 紀(jì)劍, 張銀志, 孫嘉笛
【申請人】江南大學(xué)